斑马鱼成熟幼虫肠道神经系统的免疫组织化学和超微结构分析揭示了神经膜模式的形成
,1 ,2 ,1和1 菲利普·贝克
1美国德克萨斯州休斯顿市主街6100号莱斯大学生物科学系,MS 140
马修·梅耶
2共享设备管理局,MS 100,莱斯大学,6100 Main Street,Houston,Texas 77005 USA
Ashley Tsang(曾荫权)
1美国德克萨斯州休斯顿市主街6100号莱斯大学生物科学系,MS 140
罗莎·A·乌里韦
1生物科学系,MS 140,莱斯大学,6100 Main Street,Houston,Texas 77005 USA
1美国德克萨斯州休斯顿市主街6100号莱斯大学生物科学系,MS 140
2共享设备管理局,MS 100,莱斯大学,6100 Main Street,Houston,Texas 77005 USA
通讯作者。 2019年1月11日收到;2019年4月24日验收。
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胃肠道由一系列内部相连的神经节构成,这些神经节横跨整个胃肠道,称为肠神经系统(ENS)。ENS对许多重要的肠道功能发挥关键的局部反射控制作用;包括蠕动、水平衡、激素分泌和肠屏障稳态。ENS神经节是一组神经元和胶质细胞的集合,它们排列在整个肠道的一系列神经丛中:肌间神经丛和粘膜下神经丛。虽然已知肠神经节来源于称为神经嵴的干细胞群,但决定最终神经丛组织的机制仍不清楚。最近,脊椎动物斑马鱼已成为了解ENS发育的有用模型,但其肌间神经丛结构的发育尚不清楚。在这里,我们对成熟的斑马鱼幼鱼的肌间神经丛进行了一段时间的组织学检查,发现它由一系列紧密的轴突层和长的神经胶质细胞突起组成,这些神经胶质细胞突起包裹着肠管的周围,沿着肠道的各个层面将其完全包裹。在幼虫晚期,肌间神经丛的复杂性增加,一层轴突与同心层胶质细胞并列。在超微结构上,胶质细胞含有胶质丝,并以长的线状突起相互紧密接触。囊泡轴突剖面的保守指标在幼虫神经丛中很容易丰富。总之,这些数据扩展了我们对成熟斑马鱼肌间神经丛结构的理解,从而使未来对其形成的功能研究成为可能。
主题术语:神经模式,胃肠模型,发育神经发生
介绍
肠神经系统(ENS)由数千个相互连接的神经节组成的多系列网络组成,这些神经节在整个胃肠道(GI)的肌壁内形成周向的神经丛。肠神经节由肠神经元亚型和神经胶质细胞组成,它们相互沟通以调节肠道的神经反射1作为外周神经系统的最大组成部分,ENS使胃肠道能够在肠道内稳态期间执行关键的生命功能,如蠕动、肠道激素分泌和水平衡1ENS能够自主反射活动,独立于中枢神经系统(CNS)的控制,因此被称为“第二大脑”。密集的研究集中在胚胎干细胞祖细胞群体神经嵴(NCC)的ENS形成上,然而,对支撑其神经丛表现和模式的细胞和分子机制的了解相对不足。
ENS神经节起源于发育过程中起源于背神经管的神经干细胞2——4在斑马鱼中,ENS来自发源于称为迷走神经区的发源于耳后区域的神经干细胞5——7迷走神经干细胞沿着原始肠道的长度向下迁移,直到到达最远端的后肠,从而停止迁移并最终分化为神经元,这些神经元对受精后3天在整个肠管周围的肠肌层内形成神经回路至关重要(dpf)8在所有脊椎动物中,这种神经回路的扩张导致了同心神经丛的发育,该神经丛继续成熟为具有功能的成年ENS9在哺乳动物中,ENS由两个主要层组成:首先形成的是外肌间神经丛,其次是内粘膜下神经丛,随着时间的推移,这两个层最终显示出更精细的神经膜结构10,11斑马鱼有一个肌间神经丛12目前,关于组成斑马鱼肌间神经丛的细胞成分在发育过程中是如何形成模式的,或者沿肠道长度是否有明显的精细神经膜,我们知之甚少。从全球来看,了解肌间神经丛在正常发育过程中是如何构建的,将提高我们破译其在病理和疾病状态下如何受到影响的能力,例如在先天性巨结肠中13或克罗恩病14因此,发育生物学家、胃肠临床专家和神经科学家应该对研究肠神经膜成熟度的关键工作感兴趣。
几十年来,通过研究脊椎动物ENS在各种羊膜系统中的形成和结构,各种研究在提高我们对其的理解方面取得了很大进展15然而,由于每个生物体的不透明性及其羊膜发育,在早期发育过程中对这些过程的微观研究受到阻碍。斑马鱼已经成为一个强大的系统,有助于建立在这些研究的基础上,并促进我们对ENS结构和功能的理解。斑马鱼幼虫由于其透明的外部胚胎和幼虫发育,在关键的发育阶段为我们提供了一个难以置信的机会8此外,斑马鱼和哺乳动物的肠道器官系统在很大程度上是同源的,它们都有前肠、中肠和后肠,这使我们能够收集重要信息,并将其应用于理解更复杂的脊椎动物发育。
以往对哺乳动物肠道组织进行超微结构分析的研究为我们目前对ENS神经丛内神经和胶质细胞模式的理解奠定了基础16——18这些超微结构研究确定了轴突轮廓和大量存在于神经膜中的肠神经胶质细胞,数量超过成年ENS中的神经元,这些神经元可以根据其形态和位置进行亚类化16最近有关成年小鼠免疫组织化学技术的研究支持了这些发现,并发现神经胶质细胞与神经元的数量相差4倍。此外,他们能够根据不同胶质标记物的免疫反应区分不同的肠胶质19.
此前,已使用免疫组织化学和透射电子显微镜(TEM)检查了斑马鱼幼体和成年肠道结构12虽然这些研究大大提高了我们对斑马鱼肠道结构的理解,尤其是对上皮细胞模式的理解,但对6 dpf和成年期之间肌间神经丛的描述却非常贫乏,这可能是ENS模式形成的关键时期。通过结合高分辨率免疫组织化学和TEM技术,我们报告了在成熟仔鱼的肌间神经丛中存在肠神经膜。
结果
斑马鱼成熟幼虫前肠、中肠和后肠肌层的组织学
为了研究斑马鱼幼虫肠神经丛的组织,我们首先试图描述7和18 dpf鱼类沿着前肠、中肠和后肠的肠肌层(神经丛位于其中)的一般解剖结构。在7 dpf时,斑马鱼肠道功能发达,并表现出蠕动活动8,20到18dpf时,幼虫肠道显示出增大的尺寸,我们假设与7dpf幼虫期相比,它应该表现出更高的成熟度。通过对塑料包埋鱼类的横切面组织学分析和甲苯胺蓝染色,我们观察到幼虫肌层作为薄组织层存在于肠管外周,在两个时间点直接位于肠上皮(IE)的外面(图,请参见虚线区域之间的区域)。这些观察结果与华莱士和同事的观点一致12这说明斑马鱼肌层是沿着肠道的一个相对简单的薄层。在这一组织层内,沿着肠道的各个层次,我们观察到肌层含有异质性细胞群,其细胞核甲苯胺蓝染色,密度不同,细胞质突起染色较浅,周长的相对总厚度也不同。细胞核呈现出各种形状,从圆形和椭圆形,到锯齿状和非常细长,例如后肠(图)。与7dpf时相比,18dpf时肌层的细胞核沿中肠和后肠呈扁平状(图)。一些核聚在一起(图),没有明显的模式。总的来说,这些组织学观察表明,斑马鱼幼体肌层的大体形态在7至18 dpf之间没有发生剧烈变化,但随着鱼类的生长,肌层的大小也有所增加。
横切组织切片显示肠肌层的一般解剖。塑料包埋鱼横切并用甲苯胺蓝染色(A类——C类′)7 dpf和18 dpf(D类——F类′),显示位于躯干肌(M)下方的肠上皮(IE)。白色粉刷盒(A类——F类)对应于放大倍率较高的面板(A类′–F类′)显示肠肌层的位置(虚线)。
成熟幼虫肠丛轴突和胶质细胞的定位
为了更好地了解成熟幼虫肠道神经丛的空间组织,我们使用免疫组织化学方法检查了横向冰冻切片,以可视化7和18dpf时,沿着前肠、中肠和后肠的轴突和神经胶质的存在和周向分布。为了检测轴突的投射,用一种抗乙酰化管蛋白(Acety-Tubul)的抗体处理切片,该抗体以前曾用于标记斑马鱼肠管沿线的神经元细胞体和轴突12,21——23为了在这些阶段观察斑马鱼ENS内的神经胶质细胞,我们利用了斑马鱼特异性胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体(Genetex GTX128741)的免疫反应性。GFAP在胶质细胞中表达,包括肠胶质细胞24这种抗体标记斑马鱼中枢神经系统内的胶质细胞;在所有的切片中,GFAP在整个大脑中都有高度的离散免疫反应(图; 箭头)和脊髓(图; 箭头),显示了之前观察到的放射状胶质细胞25确认抗体标记斑马鱼胶质细胞的能力。
斑马鱼特异性胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体标志着中枢神经系统中的胶质细胞。最大强度投影共焦叠加(A类)显示GFAP的3 dpf仔鱼的全量免疫荧光制剂+后脑(Hb)和中脑(Mb)的细胞,比例尺:100微米,E:眼睛。(B类——D类)18只dpf幼虫前肠水平横向冷冻切片的最大强度投影(B类),中肠(C类)和后肠(D类)标记整个脊髓的放射状胶质细胞(SC)。LL:侧线,NC:脊索,M:骨骼肌,比例尺:50微米。
在肠道的所有部分,GFAP+和乙撑+免疫反应性细胞突起沿肠管外层周缘延伸,表示ENS的肌间神经丛(图——)。神经丛内GFAP+这些过程在很大程度上形成了一个内层分离乙炔-甲苯+在7 dpf和18 dpf幼虫的前肠、中肠和后肠中观察到的IE轴突(图——)。特别是,我们注意到神经胶质细胞和轴突沿肠周立即并置(图; 箭头)。神经胶质细胞突起长且呈线状,沿着肠管的周长包裹以完全包裹肠管。轴突偶尔也会沿着肠的各个层面在各层之间穿行(图,和).
斑马鱼幼虫前肠肌间神经丛内的轴突和胶质细胞模式。横向冰冻切片的最大强度共焦投影显示GFAP+(红色),乙酰化管蛋白+7 dpf幼虫前肠中的(乙酰胆碱酯酶)突起(蓝色)(A类——C类),式中,乙炔-甲苯+外层形成过程(白色箭头),比例尺:40微米(D类——F类)18dpf幼虫,比例尺:50微米。DAPI显示的细胞核(青色)。白色方框对应放大区域(A类′–C类')比例尺:10微米,以及(D类′–F类')比例尺:12.5微米。
斑马鱼幼虫中肠肌间神经丛内的轴突和胶质细胞模式。横向冰冻切片的最大强度共焦投影显示GFAP+(红色)和醋酸管+中肠的突起(蓝色)(A类——C类)7 dpf幼虫,比例尺:20微米,以及(D类——F类)18只dpf幼虫,比例尺:40微米。DAPI显示的细胞核(青色)。白色虚线框对应于放大区域(A类′–C类')比例尺:5微米,以及(D类′–F类')比例尺:5微米。
斑马鱼幼虫后肠肌间神经丛内的轴突和胶质细胞模式。横向冰冻切片的最大强度共焦投影显示GFAP+(红色)和醋酸管+后肠的突起(蓝色)(A类——C类)7 dpf幼虫,比例尺:20微米,以及(D类——F类)18只dpf幼虫,轴突突出靠近IE(箭头),比例尺:40微米。DAPI显示的细胞核(青色)。白色方框对应放大区域(A类′–C类')比例尺:5微米,以及(D类′–F类')比例尺:5微米。
在7至18 dpf幼虫发育期间,肠道总大小和复杂性增加,ENS神经膜也证明了这一点。特别是在前肠和后肠内,在7到18 dpf之间出现显著的神经膜层扩张(图和)。在这两个区域,胶质层和轴突层的宽度和复杂性都在扩大。例如,在前肠内有一层额外的GFAP+18dpf时,肌间神经丛外缘形成胶质突起,有效夹住一层乙酰胆碱酯酶+轴突(图)。此外,GFAP+投射物交织在中肠和后肠的内网神经膜层(图和).
基于此分析,我们发现在幼虫成熟过程中,肌间神经丛组织在各种复杂的神经胶质细胞和轴突神经膜层的同心层中。这些数据表明,成熟的ENS在7至18dpf之间表现出发育生长和神经丛模式,表明精细的细胞相互作用是成熟斑马鱼ENS最终构建的基础。
斑马鱼成熟幼虫肌间神经丛的超微结构
为了在超微结构水平上研究我们在免疫组织化学中发现的肌间神经丛,我们使用了透射电子显微镜(TEM)。TEM分析显示,在肠道的所有水平上,在7和18 dpf处都有神经膜层,胶质细胞和轴突都很明显(图——)。在7 dpf的前肠肌间神经丛中,IE和平滑肌(M)层正下方,观察到静脉曲张轴突含有许多大颗粒小泡(图,箭头),类似于硬骨鱼类的肌间神经丛白头翁26成年斑马鱼27紧邻轴突轮廓的是大胶质细胞体(图)通过胞体和细胞进程中细胞质的超微结构特征鉴定。以前,人们根据胶质丝(“胶质纤维”)的存在来描述胶质细胞16表现出丝状外观的1型(T1G)胶质细胞或表现出较少丝状外观(T2G)的胶质细胞18在幼虫ENS中,我们发现在所有肌层水平上都有类似于这两种类型的细胞(图——)。对于T1G,胶质丝可能呈现颗粒状外观(图)或丝状外观(图和)。对于T2G,它们的细胞过程与T1G接触,并可能表现出局部膜密度的区域(例如图,箭头)。
透射电镜(TEM)观察斑马鱼幼体前肠内的胶质细胞和轴突超微结构。透射电镜观察前肠肌间神经丛的超微结构(A类,B类′)7 dpf和(C类——E类′)18只dpf幼虫。红色灰框对应放大区域(A类′–E类′). 肠上皮(IE)、细胞核(N)、核体(NB)、肌层(M)、轴突(Ax)、1型胶质细胞(T1G)和2型胶质细胞。比例尺表示以下内容:(A类)500 纳米(A类′) 250 纳米(B类) 500 纳米(B类′) 250 纳米(C类) 500 纳米(D类) 200 纳米(E类)1微米和(E类′) 500 纳米。黄色箭头(A类)指向大颗粒囊泡,黑色箭头(B类')和白色箭头(D类,E类')指向caveolae。
TEM表征了斑马鱼幼虫中肠内的胶质细胞和轴突超微结构。透射电镜显示中肠肌间神经丛的超微结构(A类,B类′)7 dpf和(C类,D类′)18只dpf幼虫。红色灰框对应放大区域(A类’–D类′). 肠上皮(IE)、细胞核(N)、肌层(M)、内皮细胞(EC)、1型胶质细胞(T1G)和2型胶质细胞(T2G)。比例尺表示以下内容:(A类) 500 纳米(A类′) 250 纳米(B类) 500 纳米(B类′) 250 纳米(C类) 500 纳米(C类′) 250 纳米(D类) 500 纳米(D类′) 250 纳米。黄色箭头(A类′,B类′)和白色箭头(C类′)指向T1G和T2G之间的电子密集结。
TEM表征了斑马鱼幼体后肠内的胶质细胞和超微结构。TEM显示了小鼠后肠肌间神经丛的超微结构(A类,B类′)7 dpf和(C类——E类)18只dpf幼虫。红色灰框对应放大区域(A类′–D类′). 肠上皮(IE)、细胞核(N)、肌层(M)、轴突(Ax)、内皮细胞(EC)、1型胶质细胞(T1G)和2型胶质细胞(T2G)。比例尺表示以下内容:(A类) 500 纳米(A类′) 250 纳米(B类) 500 纳米(B类′) 250 纳米(C类)500 纳米(D类) 500 纳米(D类′) 200 nm和(E类) 200 纳米。黑色箭头(A类′)指向小窝和轴突束(D类′).
所有神经胶质细胞均呈现薄丝状突起,包裹肌层周长,并在7和18 dpf时以平行轨道相互直接接触,以完全包裹肠道,这与我们的免疫组织化学分析一致。例如,沿着前肠,T2G与T1G平行,沿着长轨迹紧密相连(图)。沿着中肠可以看到类似的模式(图)和后肠(图)。此外,我们观察到,内吞小泡或小窝有时在丝状胶质突起之间共享,通常沿着前肠在彼此之间“萌芽”(图)。这些神经胶质小泡表现出不同的电子密度,例如,一些电子密度更高,而一些是电子透明的(图,箭头)。沿着外层细胞过程也有丰富的小凹,类似内皮细胞(EC)28它们与沿肠道各级的外侧胶质细胞突起直接接触(图,和).
通过18 dpf,轴突体轮廓(图)大量轴突束被胶质细胞包围,密度不同,表明神经元组织在7到18dpf之间已经成熟(图和)。神经元体(NB)显示细胞核有一个突出的核仁,伴有电透明细胞质(图)。在后肠肌间神经丛中,经常可以看到轴突束簇,数量从4到20不等(图)。轴突的大小从100到400不等 直径为nm。轴突轮廓包含许多密度和大小的小泡。以前,在哺乳动物肌间神经丛中,根据其超微结构形态和密度,各种神经轮廓被分为六种主要类型17,29本质上,这些包括小颗粒囊泡(SGV)、小无颗粒囊泡17在斑马鱼幼虫肠神经丛中,我们很容易在18dpf的轴突束簇内发现SGV、HGV、LOV和LGV小泡的证据(图)。总的来说,清晰的无颗粒小泡、大的半透明小泡和致密核小泡都很容易看到。这些观察结果表明,斑马鱼的轴突轮廓与哺乳动物ENS相似。
讨论
本报告以高分辨率描述了斑马鱼幼虫肌间丛的组织学。这些数据提供了肠道各级成熟肠神经膜的基线特征,从而可以对表型和/或突变状态进行精细的比较分析。斑马鱼可能会在类似哺乳动物出生后发育的阶段,提供一个成熟ENS的富有成果的简化脊椎动物模型。事实上,最近人们认识到,ENS在出生后阶段会持续生长、定型和成熟30——32,强调需要强大的、遗传上易于驯服的模式生物来仔细研究这些现象体内当斑马鱼与恒星实时成像、基因操作属性和高离合器数相结合时,斑马鱼成为未来ENS研究的优秀候选者。
总之,我们对幼虫肠道中轴突和胶质细胞的免疫组织化学和超微结构检测揭示了斑马鱼ENS结构和成熟的新细节。我们观察到斑马鱼幼虫肠神经丛在组织学上有7 dpf的区别,并且包含围绕肠上皮的轴突和胶质细胞轮廓。这个神经丛包含一个神经膜,很明显,沿着前肠、中肠和后肠,有一个轴突层与神经胶质细胞并列(图)。此前,人们已经认识到斑马鱼ENS中含有神经元,这些神经元在幼虫期和成年期沿肠道表面稀疏分布21,22从这些先前的研究中,我们知道肠道神经元的简单网络以网状结构相互连接,覆盖在肠道管上。斑马鱼肠道神经元不像哺乳动物那样聚集形成神经节1,12尽管如此,在斑马鱼中,肠道神经元表达神经化学标记物的组合;包括5-羟色胺(5HT)、酪氨酸羟化酶(TH)、垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP)、血管活性肠肽(VIP)、胆碱乙酰转移酶(ChAT)和一氧化氮(NO)22证明斑马鱼使用了哺乳动物神经系统中丰富的保守神经化学物质1因此,在上述研究的基础上,我们对肠神经膜的描述扩展了斑马鱼神经丛结构的解剖学知识。
成熟斑马鱼幼虫ENS肌间神经丛结构的图示。的代表性插图(A类,B类)免疫组织化学制备7只dpf幼虫前肠和后肠,描绘肌间神经丛的胶质细胞(红色)和神经元(蓝色)。不按比例。
斑马鱼肠神经丛的复杂性增加了18 dpf,突出表现为外胶质细胞层的扩张和轴突层的增厚。从区域来看,我们发现前肠显示出最复杂的模式成熟,显示出观察到的肌间神经丛厚度最大(图)。中肠和后肠也会在7到18 dpf之间扩张(图和)。众所周知,在人类肠道中,肌间神经丛在妊娠10至18周期间经历了广泛的生长和模式化,在此期间,胎儿肠道表现出运动活性33随着时间的推移,硬骨鱼类的肌间神经丛包括肠道的基本神经反射,包括运动神经元、中间神经元和感觉神经元1,34我们观察到肌间神经丛复杂性在7至18dpf之间扩张,这表明这种精细的神经反射模式可能在这个发育阶段发生。因此,我们在超微结构分析中注意到,轴突束在整个肠丛中纵向分布18dpf(图)进一步支持了ENS成熟在幼虫后期是活跃的这一观点。
TEM提供了7和18dpf斑马鱼幼体神经膜中分布的轴突轮廓和胶质细胞体的证据,与我们的免疫组织化学分析相一致。我们对7 dpf和18 dpf鱼类的前肠、中肠和后肠的研究揭示了一种普遍存在于斑马鱼幼体中的共同模式:胶质细胞纤维的长轨迹相互紧密相连(T1G、T2G),覆盖了肠管的范围,使其完全包裹。而在斑马鱼幼体早期阶段(3-9dpf)的肠道和成鱼的整群制剂中都有肠神经胶质细胞35——37其在老年仔鱼中的定位及其在神经丛中的组织学分布尚不清楚。在我们的观察中,我们注意到成熟幼虫肠道中富含胶质细胞。事实上,我们还观察到胶质细胞过程可能以小泡转移的形式相互交换物质,小窝暗示了这一点(图)。据推测,星形胶质细胞(胶质细胞的一种)可能通过释放神经活性物质参与“神经传递”,以调节神经活动38增加了肠道中可能存在类似机制的可能性。此外,我们在斑马鱼身上发现了轴突类型的证据,与哺乳动物的轴突类型相似。例如,在灵长类和豚鼠的肌间神经丛中,已知有几种囊泡划分了特定的轴突轮廓;值得注意的是,无颗粒小泡代表胆碱能性静脉曲张,致密核(嗜锇)颗粒表明肾上腺素能,中等电子密度的大小泡表示“P型”含肽小泡39基于这些描述,我们的数据总体上表明斑马鱼显示出这些特征的保守指标和成熟的肌间神经丛。
总之,对斑马鱼幼虫肠道神经丛的研究是及时的。我们在这里的描述以高分辨率扩展了斑马鱼肌间神经丛的结构和组织的知识。他们揭示,在幼虫成熟阶段,神经膜经历了一个生长阶段,表现为复杂性增加了18 dpf。未来,这些组织学描述将提供基线数据,用于比较可能在ENS构建和/或功能中发挥作用的候选基因中存在突变或基因敲除的斑马鱼模型。
材料和方法
斑马鱼维护和管线
斑马鱼(达尼奥雷里奥)保持在28.5 °C,在13小时灯下/11 小时黑暗循环。按照莱斯大学动物护理和使用委员会(IACUC)批准的规定和指南(方案编号1143754)对动物进行治疗和实验。野生型AB(斑马鱼国际资源中心)在7和18dpf时用于本研究。
组织学和透射电镜
将刚安乐死的幼虫在卡诺夫斯基的固定剂中固定一夜40,在0.1中冲洗 M碳酸钠缓冲液,在1%四氧化锇中固定一小时,然后在0.1中再次冲洗 M二甲氨基甲酸钠缓冲液。然后将幼虫在分级系列乙醇中脱水,用环氧树脂渗透并包埋,然后在70 48°C烘箱 小时。为了确定TEM分析的关注区域,1 使用超微切片机横向切割µm厚度,用甲苯胺蓝染色,并用尼康仪器Eclipse复合光显微镜成像。100个超薄切片 然后使用超薄切片机切下用于TEM分析的nm厚度,并用33%甲醇乙酸铀酰染色15 分钟,柠檬酸铅(电子显微镜科学,目录号22410)7次 分钟。使用配备Gatan CCD相机的JEOL JEM-1230采集数字电子显微照片。
免疫组织化学
对按上述方法固定和处理的幼虫进行免疫组织化学制备7所有一级和二级抗体溶液均使用PBTD中5%的山羊血清块制成(1%二甲基亚砜,1X磷酸盐缓冲盐,0.1%吐温-20)。初级抗体以以下稀释度使用:小鼠抗乙酰化微管蛋白1:200(Sigma-Aldrich,T7451)和兔抗GFAP(斑马鱼表位)1:500(Genetex,GTX 12874)。二级抗体及其稀释液的使用如下:Alexa Fluor 488山羊抗兔1:700和Alexa Fluor 647山羊抗鼠1:500(Invitrogen)。在冰冻切片上孵育后,将DAPI并入二级抗体溶液以标记细胞核。
使用Olympus Fluoview FV3000共焦激光扫描显微镜对冰冻切片进行成像。使用UCPlanFLN 20×/0.70物镜对全视图截面进行成像。为了拍摄聚焦于肠道的高倍图像,使用UPlanSApo 60×/1.35油浸物镜。通过每1–1.5次捕获切片获得Z堆栈 µm范围为10–13 µm总厚度。在将图像导出为.tif文件之前,通过Olympus CellSen Dimensions软件处理图像,以生成最大强度的Z轴堆栈投影。使用Acrobat Adobe Photoshop CC软件对所有图像进行进一步处理和裁剪。
致谢
我们感谢艾琳·辛格尔顿的鱼类护理和技术帮助。我们感谢莱斯大学生物科学系启动资金的资助。R.A.U.是德克萨斯州癌症预防研究所(CPRIT)癌症研究学者。
作者贡献
R.A.U.、M.D.M.和P.A.B.设计了该研究;M.D.M.和P.A.B.进行实验并收集数据;R.A.U.、P.A.B.、M.D.M.和A.T.分析数据,起草并编辑手稿。
脚注
出版商备注:Springer Nature在公布的地图和机构关联中的管辖权主张方面保持中立。
工具书类
1Furness,J.B.&Wiley InterScience(在线服务)。肠神经系统(布莱克威尔出版社,2006年)。
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