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.2019年6月2日；15(7):1440-1451.
doi:10.7150/ijbs.30193。 2019年eCollection。

抗氧化剂MitoQ通过抑制人脐静脉内皮细胞的ROS和自噬保护CSE诱导的内皮屏障损伤和炎症

沙晨 1, Yu Wang（王宇） 1, 张海林 2, 冉晨 1, 吕方芳 2, 李正茂 三, Ting Jiang（丁江） 三, 林道鹏 2, 张宏宇 三, 李阳 4, 孔晓霞 1
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抗氧化剂MitoQ通过抑制人脐静脉内皮细胞的ROS和自噬保护CSE诱导的内皮屏障损伤和炎症

沙晨等。 国际生物科学杂志. .

摘要

慢性阻塞性肺病（COPD）是一种以持续气流受限为特征的常见疾病。肺血管内皮屏障损伤和炎症越来越被认为是香烟烟雾提取物（CSE）诱导COPD的重要病理生理过程，但其机制尚不清楚。为了确定CSE处理的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）中内皮屏障损伤和炎症的细胞机制，我们研究了线粒体靶向抗氧化剂MitoQ对内皮屏障损伤和炎症的影响。我们证明，MitoQ通过阻止VE粘附素的分解和肌动蛋白细胞骨架的重塑，以及通过内皮细胞中的NF-κB和NLRP3炎症小体途径减少炎症，从而恢复了内皮屏障的完整性。此外，MitoQ还通过减少活性氧的产生和过度自噬来维持线粒体功能。3-MA对自噬的抑制可保护HUVECs免受CSE诱导的细胞毒性。总之，我们的研究表明线粒体损伤是CSE诱导内皮屏障功能障碍和炎症的关键促进剂。在CSE诱导的HUVEC损伤中，MitoQ的保护作用与抑制ROS和过度自噬有关。

关键词：自噬；慢性阻塞性肺病；香烟烟雾提取物；内皮屏障；炎症；罗斯。

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竞争利益：作者声明不存在竞争利益。

数字

图1
图1
CSE对人脐静脉内皮细胞VE-cadherin表达和肌动蛋白细胞骨架的影响。（A） 用Western blotting检测人脐静脉内皮细胞细胞裂解液中VE-cadherin和（B）F-actin的表达水平。用免疫荧光染色法分析CSE治疗后HUVEC中VE-cadherin（C）和F-actin（D）的表达。比例尺为10μm。绿色表示标记有F-actin和VE-cadherin的细胞；蓝色，DAPI。所有数据均与对照组进行比较，以平均值±SEM表示（每组n=5），*P<0.05，**P<0.01。
图2
图2
CSE诱导HUVEC中NF-κB和NLRP3炎症小体激活。（A） Western blotting检测HUVEC细胞裂解液中蛋白IκBα和p-IκBα的表达。GAPDH作为标准。用细胞质分离试剂盒检测蛋白核p65的表达。组蛋白用作负荷控制。蛋白质p-IκBα（B）和核p65（C）水平的定量分析。（D） 免疫荧光染色检测p65（红色，400×）的核转位。Western blotting检测蛋白NLRP3（E）、Caspase-1（F）和IL-1β（G）的表达。将所有数据与对照组进行比较，并以平均值±SEM表示（每组n=5）*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01.
图3
图3
CSE导致HUVEC线粒体功能障碍。（A） HUVEC与不同浓度的CSE孵育24h。用CCK8试剂盒测定细胞活力。（B） 用DCFH-DA试剂盒分析活性氧水平。（C） 处理后，对细胞进行JC-1染色（400×），以评估线粒体膜电位。红色染色表明JC-1染色中线粒体极化。绿色染色显示JC-1染色中线粒体去极化。（D） caspase-3（红色）和细胞核（蓝色）免疫荧光染色（400×）。（E） 蛋白TOMM20在HUVEC中的表达通过Western blotting显示。GAPDH作为标准。（F） CSE孵育24h的HUVEC中具有代表性的线粒体形态（1000×）。蓝色：DAPI；绿色：TOMM20（线粒体）。将所有数据与对照组进行比较，并以平均值±SEM表示（每组n=5）*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01.
图4
图4
MitoQ对CSE诱导的内皮屏障功能障碍的影响。（A） Western blotting检测蛋白VE-cadherin和F-actin的表达。蛋白质VE-cadherin（B）和F-actin（C）水平的定量分析。免疫荧光法检测VE-cadherin蛋白（绿色）（D）和F-actin（绿色）蛋白（E）的表达。HUVEC生长到约90%的汇合处。比例尺为10μm。数据表示为平均值±SEM（n=5）*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01.
图5
图5
MitoQ在CSE诱导的HUVEC NF-κB和NLRP3炎症小体激活中的作用。（A） Western blotting检测蛋白IκBα、p-IκBα和核蛋白p65的表达。以GAPDH和组蛋白为标准。p-IκBα（B）和核p65（C）水平的定量分析。（D） 用共焦显微镜（400×）对p65（红色）进行免疫荧光染色。Western blotting检测蛋白NLRP3（E）、Caspase-1（F）和IL-1β（G）的表达。数据表示为平均值±SEM（n=5）*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01.
图6
图6
MitoQ改善CSE诱导的HUVEC线粒体损伤。用5%CSE和（或）100nM MitoQ刺激HUVEC 24小时。（A） 用CCK8试剂盒测定细胞活力。（B） 用DCFH-DA试剂盒分析活性氧水平。（C） 胱天蛋白酶-3（红色）和细胞核（蓝色）的免疫荧光染色（400×）。（D） JC-1染色（400×）分析HUVEC线粒体膜电位。（E） 蛋白TOMM20的表达通过Western blotting检测。（F） 免疫荧光染色（1000×）检测TOMM20的表达。数据表示为平均值±SEM（n=5）*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01.
图7
图7
MitoQ抑制CSE诱导的HUVEC自噬。（A） 通过Western blotting和定量分析检测LC3和Beclin-1的表达。（B） Western blotting检测P62蛋白的表达。（C） 用CCK8试剂盒测定CSE和（或）3-MA处理的HUVEC的细胞活力。（D） 通过蛋白质印迹和定量分析检测LC3的表达。数据表示为平均值±SEM（n=5）*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01.
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