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.2019年3月7日；4（5）：e97903。
doi:10.1172/jci.insight.97903。

PTHrP靶向HDAC4和HDAC5以抑制软骨细胞肥大

西森茂树 1, 森林莱 1, Mieno Shiraishi公司 1, 小林达也 1, Elena Kozhemyakina女士 2, 左宗尧 三, 安德鲁·拉萨尔 2, 亨利·克伦伯格 1
附属公司

PTHrP靶向HDAC4和HDAC5以抑制软骨细胞肥大

西森志贵等。 JCI洞察. .

摘要

在软骨内骨形成过程中，软骨细胞肥大是软骨细胞分化为骨形成的关键转折点。甲状旁腺激素相关蛋白（PTHrP）和组蛋白去乙酰化酶4（HDAC4）均抑制软骨细胞肥大。使用多小鼠遗传模型，我们在体内证明，HDAC4是PTHrP对软骨细胞分化的影响所必需的。我们进一步在体内显示，PTHrP导致14-3-3结合位点HDAC4磷酸化降低，随后HDAC4核移位。Hdac4-KO小鼠与Pthrp-KO小鼠具有相似但较温和的表型，表明可能存在Pthrp作用的其他介质。我们确定HDAC5是PTHrP信号传导的额外介质。虽然Hdac5 KO小鼠在出生时没有生长板表型，但除了Hdac4的KO之外，还需要Hdac5的KO来在体内完全阻断PTHrP对出生时软骨细胞分化的作用。最后，我们发现PTHrP抑制心肌细胞增强因子2（Mef2）的作用，使软骨细胞肥大所需的runt-related transcription factor 2（Runx2）mRNA表达。我们的结果表明，PTHrP通过允许HDAC4和HDAC5阻断Mef2/Runx2信号级联，抑制体内软骨细胞肥大和随后的骨形成。这些结果解释了人类几种遗传异常的表型。

关键词：骨生物学；骨发育；发展；遗传病；分子遗传学。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益冲突：提交人声明，不存在利益冲突。

数字

图1
图1。加速软骨细胞分化Hdac4型-KO骨架是托尔普-KO骨架。
胫骨近端生长板的H&E染色（原始放大倍数，×100[A类–C类，顶部]；×40 [天，顶部]），前胸腔（原始放大倍数，×40[A类和B类，底部]）和前肋软骨（原始放大倍数，×100[C类和天，底部]）出生时(A类和C类)，第8页(B类)和第12页(天). 年龄相同的老鼠是室友，除了Hdac4型-KO鼠标输入天。要比较托尔普-KO鼠标和Hdac4型-KO老鼠正好在同一窝里，我们让Hdac4/Pthrp公司带有Hdac4/Pthrp公司双HET鼠标。(A类). 数字表示增殖软骨细胞区域的平均长度（用黑线表示）（平均值±SEM，n个=3，生物三倍体）*P（P）=7 × 10–7, **P（P）=6 × 10–6，***P=8 × 10–7, ****P（P）=3 × 10–6由双尾学生的t吨测试，当与其对应的WT测量值进行比较时。A类P（P）小于0.05的值被认为是显著的。黑色箭头表示肋骨软骨细胞肥大和矿化，这在WT对照组中没有发生。比例尺（红线）：500μm。
图2
图2。PTHrP和HDAC4通过共同途径发挥作用。
(A类)出生时胫骨近端生长板的H&E染色（原始放大倍数，×100）。图中的老鼠是同窝老鼠。数字表示增殖软骨细胞区域的平均长度（以黑线表示）（平均值±SEM，n个=3，生物三倍体）*P（P）<0.0003，采用随机截距线性混合效应模型（SAS Institute）。A类P（P）小于0.05的值被认为是显著的。(B类)出生时整个胫骨的H&E染色（原始放大倍数，×20）。图中所示的老鼠是在Hdac4型-HET鼠标和Hdac4型-HET公司-托尔普-Tg/+鼠标。黑色箭头表示扁平柱状和肥大的软骨细胞区域。黑线表示肥大软骨细胞层的长度。表型的重复性由3只独立的幼崽证实。(C类和天)ISH用于Ihh公司mRNA和第10a1列胫骨内侧和人的mRNA托尔普胫骨近端生长板处的mRNA（原始放大倍数，×100）。与中所示的鼠标相同B类.比例尺（红线）：500μm。
图3
图3。体内通过PTHrP信号转导HDAC4去磷酸化和核移位。
(A类和C类)14-3-3结合位点的蛋白质印迹（见补充材料中完整的未经编辑的印迹）。出生时，从胫骨近端生长板中的微细切割增生软骨细胞区域进行全细胞裂解。使用了不同的动物组(A类,n个=3，生物三倍体；C类,n个=2，生物副本）。Tg、，托尔普-Tg/+；让开，托尔普-科威特。WT1或WT2和WT3分别来自Tg凋落物或KO凋落物(A类). Tg1和Tg2是室友。KO幼崽来自不同的窝。(B类和天)根据中的谱带计算相对谱带强度A类(n个=3）或C类(n个=2）以及补充图4A(n个= 2). HDAC4被归一化为β-肌动蛋白。磷酸化HDAC归一化为HDAC4。S245+S250，磷酸HDAC4-Ser245和磷酸HDAC5-Ser250之和；S465，磷酸化HDAC4-Ser465；S629，磷酸化HDAC4-Ser629*P（P）=0.03, **对=0.002,***P（P）=1 × 10–5，****P=4 × 10–4,*****P（P）=5 × 10–5由双尾学生的t吨测试。(E类)共焦显微镜下的典型IHC图像（原始放大倍数，×620）。出生时胫骨近端生长板中的圆形软骨细胞：绿色（HDAC4）和蓝色（DAPI，核染色）。(F类)细胞核中的HDAC4总强度与整个细胞中HDAC4的平均强度之比（平均值±SEM，n个=5，生物复制）。的比率托尔普-Tg/+细胞为50.7%±2.4%Pthrp公司-KO细胞为38.4%±1.3%。详细计算如补充图4B和补充表1所示。*P（P）<0.0001通过随机截距线性混合效应模型（SAS Institute）。A类P（P）小于0.05的值被认为是显著的(B类,天、和F类).
图4
图4。HDAC5作为补充HDAC4行动的候选者。
（顶部）HDAC4、HDAC5和HDAC7蛋白质之间14-3-3结合基序的同源性。红色字母“S”代表磷酸化丝氨酸。带下划线的字母表示不匹配的氨基酸。除了HDAC7-S479（人类RAQSSP有一个失配）外，这些基序在小鼠和人类之间是保守的。HDAC4的（中间）蛋白质结构域。（底部）HDAC4蛋白与N末端延伸域或C末端HDAC域中的HDAC5或HDAC7同源。蛋白质序列由多序列比对程序Clustal Omega分析。
图5
图5。HDAC5作为PTHrP信号传导的额外介质的鉴定。
(A类)出生时前肋软骨的H&E染色（原始放大倍数，×100）。除了托尔普-KO鼠标。黑色箭头表示肋骨软骨细胞异常肥大和矿化。DKO，双KO。至少2只独立的动物证实了表型的再现性。(B类)ISH用于第10a1列mRNA和第2a1列出生时胸腔前部的mRNA（原始放大倍数，×40）。黑色箭头表示肋软骨中具有代表性的表达区域。(C类)出生时整个胫骨的H&E染色（原始放大倍数，×20）。5000万美元，Hdac5型-KO；4KO，Hdac4型-KO；5HET、，Hdac5型-HET；4&5 DKO，Hdac4和5丹麦克朗。相同的小鼠显示在A类–C类.比例尺（红线）：500μm。
图6
图6。当HDAC4表达低时，HDAC5介导PTHrP信号。
(A类和B类)出生时整个胫骨的H&E染色（原始放大倍数，×20）。显示的老鼠是同窝老鼠(A类)或父母相同(B类). 4HET、，Hdac4型-HET公司。(C类)出生时胫骨近端生长板的H&E染色（原始放大倍数，×100）。第一张和第二张图片中的老鼠以及第三张和第四张图片中老鼠分别是同窝老鼠。黑线表示肥大软骨细胞层的长度。(天)ISH用于第10a1列出生时胸腔前部的mRNA（原始放大倍数，×40）。右侧图像中的黑色箭头表示异常第10a1列前肋软骨中的mRNA表达。第10a1列在左边的图像中，前肋软骨中未见mRNA表达（黑色箭头）。请注意第10a1列左侧可见胸骨中的mRNA表达。每个基因型的2只独立动物证实了表型的再现性。比例尺（红线）：500μm。
图7
图7。HDAC4/5通过PTHrP作用抑制Mef2/Runx2信号级联。
(A类)P8和P21处前肋软骨的H&E染色（原始放大倍数，×100）。同龄的老鼠是室友。这个Hdac4型-KO小鼠在P10和P14之间死亡。黑色箭头表示肋骨软骨细胞异常肥大，这被HET缺失所抵消运行2（顶部图像）。比例尺（红线）：500μm。这个运行2-HET小鼠表现出正常的肋骨表型（下图）。(B类)软骨细胞肥大的发育调控模型。该模型来源于本手稿中的数据和先前报告（20，21）中的数据。PTHrP作用通过降低14-3-3结合位点处HDAC4的磷酸化来增加HDAC4核转位。当HDAC4表达低时，HDAC5也介导PTHrP信号传导。在细胞核中，HDAC4和HDAC5通过HDAC4/5的Mef2结合位点阻断Mef2的转录活性。Mef2通过直接激活和激活Runx2表达来驱动软骨细胞肥大。Runx2作用于HDAC4/Mef2和HDAC5/Mef2的下游，以驱动软骨细胞肥大。
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