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.2018年12月18日；11（12）：dmm036426。
doi:10.1242/dmm.036426。

鼠标同上3a突变导致视网膜变性和线粒体功能降低

艾米·芬德利 1, 罗德里克·卡特 2, 贝基·斯塔巴克 三, 丽莎·麦基 1, 克拉拉·诺瓦科娃 1, 彼得·S·巴德 1, 玛格丽特·凯格伦 1, 约瑟夫·马什 1, Sally H Cross女士 1, 米歇尔·西蒙 三, 保罗·K·波特 三, 尼古拉斯·莫顿 2, 伊恩·杰克逊 4 5
附属公司

鼠标同上3a突变导致视网膜变性和线粒体功能降低

艾米·芬德利等。 Dis模型机械. .

摘要

异柠檬酸脱氢酶（IDH）是由异柠檬酸盐生产α-酮戊二酸所需的一种酶。IDH3生成线粒体中用于ATP生成的NADH，是由两个α、一个β和一个γ亚基组成的四聚体。两者的功能丧失和错义突变IDH3A公司和IDH3B型此前曾与视网膜变性的家族有关。利用小鼠模型，我们研究了IDH3在视网膜疾病和线粒体功能中的作用。我们在筛选携带ENU诱导突变E229K的衰老小鼠的过程中，确定了患有迟发性视网膜变性的小鼠同上3aGFAP染色显示，这种突变纯合子小鼠早在3个月时就表现出视网膜应激的迹象，但其他组织似乎没有受到影响。我们击倒了同上3a并发现纯合子小鼠在早期胚胎发生后无法存活。同上3a-/E229K系列与之相比，复合杂合突变体表现出更严重的视网膜变性同上3aE229K/E229K纯合子突变体。突变细胞系中线粒体功能的分析强调了线粒体最大呼吸和储备能力水平的降低同上3aE229K/E229K和同上3a-/E229K系列细胞。功能丧失同上3b突变体没有表现出相同的视网膜变性表型，没有视网膜应激或线粒体呼吸减少的迹象。以前有报道称视网膜在线粒体储备能力有限的情况下运作，我们认为这一点，再加上突变体储备能力的降低，解释了在同上3a突变小鼠。本文对第一作者进行了相关的第一人称访谈。

关键词：克雷布斯循环；小鼠模型；色素性视网膜炎。

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竞争利益作者声明没有竞争利益或财务利益。

数字

图1。
图1。
同上3aE229K/E229K小鼠表现出视网膜退化的迹象。（A）同上3aE229K/E229K根据视动鼓（OKD）评分，小鼠（红色）的视力下降了12 月{0.2071±0.01872 c/d[平均值±s.e.m。，n个=9，雌性（F）4，雄性（M）5]}与野生型（蓝色）相比[0.3090±0.009441 c/d（平均值±标准偏差。，n个=23，F14，M9）](P（P）<0.0001）和杂合子（黄色）[0.3173±0.007472 c/d（平均值±标准偏差。，n个=35，F24，M11）](P（P）<0.0001）小鼠。这一显著下降仍在继续，到18 月，纯合小鼠（红色）进一步退化[0.1592±0.02396 c/d（平均值±标准偏差。，n个=9 F4，M5）]与野生型（蓝色）相比[0.3004±0.01223 c/d（平均值±标准偏差。，n个=23，F14，M9）](P（P）<0.0001）和杂合子（黄色）[0.2836±0.009699 c/d（平均值±标准偏差。，n个=35，F24，M11）]小鼠(P（P）<0.0001). 未付款t吨-测试***P（P）<0.001. （B） 眼底成像对比同上3aE229K/E229K视网膜与野生型同卵双胞胎的视网膜；突变视网膜表现出视网膜变性的迹象，表现为暗斑片状外观。（C） IDH3A:IDH3G异二聚体（PDB ID:5GRI）的结构，本研究中确定的E229K突变位置（红色）和之前确定的错义突变位置（蓝色）突出显示。（D） 预测突变对IDH3A单体稳定性和与IDH3G相互作用强度的影响。数值越高，表明蛋白质稳定性或相互作用强度的破坏越大。
图2。
图2。
同上3a−/E229K和同上3ae229千/e229千小鼠出现早期快速的光感受器丧失。（A） 在同上3a−/E229K绿色GFAP染色显示，反应性胶质增生症小鼠从P30开始出现并持续到P60-90(n个=3). P30-60中不存在这种染色同上3aE229K/E229K或在P90野生型同卵双胞胎中（最右边），但在P90中可见同上3aE229K/E229K视网膜切片(n个=3). 蓝色染色为DAPI。（B） H&E染色眼睛的组织学分析。年，ONL中的核数明显减少同上3a−/E229K第60页，第90页几乎没有。ONL感光细胞核的（C，D）个数(年-轴）在视神经头两侧的固定距离处(x-轴）。P30（C）的计数表明，除外，所有基因型的细胞核数都正常同上3a−/E229K视网膜(n个=3-6，数据输入表S2). 到P60并继续到P90（D）时同上3ae229千/e229千视网膜(n个=7，F7，M2），与野生型同卵双胞胎对照相比(n个=7，F4，M3）。未付款t吨-测试*P（P）<0.05, **P（P）<0.01. 比例尺：50 微米。INL，内核层；ONL，外核层；视网膜神经节细胞层；视网膜色素上皮。
图3。
图3。
同上3a−/E229K和同上3aE229K/E229K小鼠的光感受器功能正常，随后下降。暗适应的（A-C）A波振幅同上3a−/E229K暴露于3 cd/m（光盘/分钟）三P30（A）和P60（B）的闪光，伴随的痕迹显示P30（C，顶部）和P六十（C，底部）的突变（红色）和野生（蓝色）暗点反应。在第30页，同上3a−/E229K单向方差分析显示，小鼠的a波振幅与对照同窝小鼠相当[F类(3,10)=0.7970,P（P）=0.5232] [n个=4（F2，M2），3（F2，M1），3（F1，M2），4（F2，M2）]，但到P60时，这一数字已显著下降[F类(3,9)=32.66, ***P（P）<0.001] [n个=3（M3），3（F1，M2），3（F1，M2），5，（F1，M4）]。（D，E）之间a波振幅的比较同上3aE229K/E229KP60（D）和P120（E）的野生型对照。在P60时，突变小鼠没有表现出视网膜功能丧失[265.5±18.18（平均值±标准偏差。，n个=5，F2，M3）]与野生型同卵双胞胎相比[267.0±21.3（平均值±s.e.m。，n个=4，F4）]。到P120时，突变体的感光细胞对光刺激的反应显著降低[153.2±35.11（平均值±标准偏差。，n个=4，F2，M2）]与野生型[247.7±15.51（平均值±s.e.m。，n个=4，F3，M1）]小鼠*P（P）<0.05. （F） 随行痕迹显示同上3aE229K/E229KP30（顶部）和P120（底部）处的（绿色）和野生型控制记录道（蓝色）。
图4。
图4。
突变MEF细胞表现出储备减少和最大呼吸。 同上3a突变体表现出线粒体最大呼吸和储备能力降低。（A） 使用安捷伦海马XF测量MEF细胞的耗氧量（OCR）e（电子）24基本和刺激条件下的细胞外通量分析仪。（B-F）直方图显示最大呼吸[FCCP测量2–抗霉素+鱼藤酮（Ant/Ret）测量2]（B），储备量（FCCP测量2-基础测量2）（C），基础呼吸（基础测量2-Ant/Ret测量2），泄漏呼吸（低氧测量2–Ant/Ret测量2）（F）pmol min−1外径540−1对于实验的每个部分（A）。同上3a−/E229K和同上3aE229K/E229K与野生型（D-F）相比，突变细胞在基础呼吸、ATP依赖性呼吸或泄漏呼吸方面表现出较低但不显著的趋势。两者都有同上3a−/E229K和同上3aE229K/E229K显示最大呼吸显著降低[F类(4,10)=5.701,P（P）=0.0118]（B）和备用呼吸容量[F类(4,10)=6.536,P（P）=0.0075]（C），如单向方差分析所示*P（P）<0.05, **P（P）<0.01.
图5。
图5。
同上3b−/−小鼠在6岁以下没有视网膜退化的迹象 月。 同上3b−/−小鼠在P180之前无视网膜变性。（A） 视网膜切片上的GFAP绿色免疫荧光在突变小鼠中没有上调，表明没有视网膜应激(n个=3). （B） P180的ERG分析同上3b−/−响应3 cd/m（光盘/分钟）三暗视条件下的闪光显示出类似的a波振幅[233.4±19.63（平均值±标准差。，n个=6，F2，M4）]至野生型同卵双胞胎[207.7±14.42（平均值±标准偏差。，n个=6，F3，M3）]（左）。与野生型（黑色）（右）相比，突变小鼠（红色）的ERG痕迹也没有缺陷。（C-E）OCR测量单位：同上3b−/−MEF细胞并与对照窝友进行比较。与…对比同上3a突变细胞，同上3b−/−细胞的最大呼吸量或剩余呼吸量没有显著降低。（F） 对视网膜组织中IDH3B和α-微管蛋白的Western blot分析显示同上3b−/−视网膜。比例尺：50 微米。
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