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。2017年12月；27(12):1441-1465.
doi:10.1038/cr.2017.113。 Epub 2017年10月13日。

抑制MAPK11或HIPK3降低亨廷顿病模型中突变亨廷顿蛋白水平

孟玉 1, 傅玉华 1, 梁一江 1, 海昆之歌 1, 姚瑶 1, 吴鹏（音） 1, 姚玉伟 1, 潘玉音 1, 薛文 1, 马丽香 2, 赛茵河西阁 1, 于丁 1, 罗寿清 三, 博逊路 1
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抑制MAPK11或HIPK3降低亨廷顿病模型中突变亨廷顿蛋白水平

孟玉等。 单元格Res。 2017年12月。

摘要

大多数神经退行性疾病与疾病相关蛋白的积累有关。其中，亨廷顿病（HD）因其单基因性质而引起特别关注。HD主要由突变亨廷顿基因（HTT）编码的缺陷蛋白的细胞毒性引起。因此，降低突变HTT蛋白（mHTT）水平将是一种有希望的HD治疗策略。在这里，我们报道了两种激酶HIPK3和MAPK11作为mHTT水平在细胞和体内的阳性调节剂。这两种激酶通过其激酶活性调节mHTT，表明抑制这些激酶可能具有治疗价值。有趣的是，它们对HTT水平的影响是依赖于mHTT的，提供了一种反馈机制，其中mHTT增强自身水平，从而促进mHTT积累和疾病进展。重要的是，在敲除HD小鼠模型中，敲除MAPK11可显著挽救与疾病相关的行为表型。总之，我们的数据揭示了HD的新治疗切入点和类似疾病的靶点发现方法。

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数字

图1
图1
通过筛选确定mHTT水平的潜在药物遗传修饰物。（A）显示筛选过程的示意流程图。（B）潜在初步打击的信息。通过HTRF使用2B7/MW1抗体对在两种不同的人类HD患者成纤维细胞系（Q68与Q45）中测量mHTT水平。“mHTT降低siRNAs的数量”表示减少两条线中mHTT水平的siRNA数量（四分之一）。（C）当在标准（非保护性）条件下培养时，稳定表达HTT-exon1片段的hESC衍生神经元表现出长polyQ（Q73）特异性退化表型，这可以通过基于图像的测量进行评估。代表性图像（超过20个生物复制品）显示了这些细胞（Q73神经元）中神经元存活的变化，这些细胞转染了打乱的siRNA（打乱）或HTT-exon1 siRNA（HTT）。比例尺，50μm。（D）使用SMART-pool siRNAs（Dharmacon）在Q73神经元中测试候选点击，IncuCyte基于每个孔中的四个场计算不同时间点成像测量的汇流。来自两个独立转染的信号（平板A和B）显示出一致性，信号聚集在对角线（红色）附近。（E）在用靶向初级命中的siRNA-pool转染的Q73神经元中，用mHTT-exon1水平绘制每个板中每个siRNA转染孔的平均汇合点（两个独立转染孔中的八个测量值），并在转染48小时后使用2B7/MW1抗体对通过HTRF进行测量。相关系数对和P（P）通过Spearman相关分析计算68小时测得的汇流值。（F）转染有指定siRNAs的Q73神经元的神经元存活图。通过每个孔中四个场的平均汇合来测量神经元存活率。请注意，所有这些图的干扰和HTT siRNA信号都来自与候选基因平行测试的相同样本。混乱的(n个=16）和HTT siRNA(n个=4）图表示平均值和SEM，而两个独立转染的点击孔分别绘制。siRNAs靶向的基因明显增加了神经元存活率（在所有测得的时间点都有较高的存活率），这些基因被选为潜在的靶基因。
图2
图2
HIPK3和MAPK11调节HTT水平。（A）左面板，指示蛋白质的代表性western blotsSTHdh公司转染所示siRNA后的细胞。请注意，ab1（N末端抗体）检测mHtt和wtHtt，而MW1（polyQ抗体）仅检测mHtt。击倒嘻哈3或地图11降低HD（Q7/Q111）细胞中的Htt水平，但不降低WT（Q8/Q7）细胞中Htt水平；右侧面板，西方印记的量化。Hdh5型是一种直接针对小鼠的siRNAHtt公司基因。（B）左，显示HD患者iPSC-derived神经元的代表性图像（蓝色，DAPI；绿色，Tuj1；比例尺，50μm）；使用特异性检测mHTT的2B7/MW1抗体对，通过HTRF测量HD患者iPSC-derived神经元的中间mHTT水平。对，使用2B7/2166抗体对通过HTRF测量对照患者iPSC-衍生神经元的HTT水平。（C）典型的western blot和定量分析表明嘻哈3降低10个月大HD纹状体内源性Htt水平(卫生部第140季度/第7季度)老鼠，但不是WT(卫生部第7季度/第7季度)老鼠。对于定量，首先将Htt信号（由ab1测量）归一化为负载控制（β-Tubulin）。然后将负荷控制校正信号归一化为同年龄WT控制的平均值。（D）典型的western blot和定量分析表明地图11降低4个月龄和6.5个月龄HD纹状体内源性Htt水平(卫生部第140季度/第7季度)老鼠，但不在WT中(Hdh公司第7季度/第7季度)老鼠。量化与（C）对于该图中的所有条形图，所有信号均归一化为干扰siRNA-转染控制的平均信号；将棒材绘制为平均值和SEM；每个顶部的数字表示生物复制的数量，通过单因素方差分析和事后（post-hoc）Dunnett的测试一个和B类和双向未配对t吨测试C和D类与干扰siRNA-转染控制相比。*P（P）< 0.05;**P（P）< 0.01;***P（P）< 0.001; 纳秒，P（P）> 0.05.
图3
图3
HIPK3和MAPK11介导的HTT调节依赖于mHTT。（A）典型的western blot和定量STHdh公司第7季度/第7季度（WT）细胞显示mHTT（Q72）而不是wtHTT（Q25）N-末端外显子1片段的表达能够通过敲除地图11.siRNA靶向引起的wtHtt变化地图11在各组cDNA转染样品中计算，并绘制为各组之间的百分比差异地图11siRNA-转染良好，同一组内干扰siRNA转染对照的平均值。采用单因素方差分析和Dunnett’s进行统计分析事后（post-hoc）测验。（B）类似（A），但显示了击倒的效果嘻哈3。（C）HD的代表性蛋白质印迹和定量（ab1）(STHdh公司第7季度/第11季度)细胞显示出特别的击倒毫安时使用等位基因特异性siRNA（等位基因特异性mHtt-si）通过敲除地图11或嘻哈3。统计分析由双尾非配对t吨测验。（D）qPCR测量臀部3HD（Q7/Q111）与WT（Q7/Q7）的mRNA水平STHdh公司单元（左侧）和HD中(卫生部第140季度/第7季度)与WT相比(卫生部第7季度/第7季度)指定年龄段（中、右）动物的小鼠纹状体。将水平归一化为WT样本的平均值。统计分析由双尾非配对t吨测验。（E）qPCR测量嘻哈3HD中的mRNA水平(STHdh公司第7季度/第11季度)单元格或WT(STHdh公司第7季度/第7季度)转染有指定siRNA的细胞。B01、C01和Hdh5是靶向性siRNAHtt（高温）（见补充信息，数据S1）。将水平归一化为加扰siRNA-转染对照样品（加扰）的平均值，并通过单向方差分析进行统计分析，然后进行事后（post-hoc）Dunnett的测试。（F）类似（E）但患者iPSC-衍生神经元。HTT3是靶向人类的siRNAHTT公司。（G）磷酸化MAPK11/MAPK11比值的典型western blot和定量STHdh公司第7季度/第7季度用所示cDNA转染WT细胞并用所示化合物处理。对与模拟对照相比的p-MAPK11/MAPK11比率变化进行定量，以测定MAPK11的活化。（H）6.5月龄小鼠纹状体裂解液中Atf2和磷酸化Atf2（p-Atf2）水平的Western blot和定量地图11分别使用靶向Atf2和磷酸化Atf2的特异性抗体在野生型背景中进行敲除。Atf2磷酸化在地图11敲除小鼠，确认Atf2是Mapk11的底物。统计分析由双尾非配对t吨测验。（一）类似（H），但比较高清(卫生部第7季度/第140季度)与WT小鼠相比(卫生部第7季度/第7季度). HD小鼠Atf2磷酸化显著增加，提示Mapk11活性可能增加。对于所有曲线图，误差条代表平均值和SEM。*P（P）< 0.05;**P（P）< 0.01;***P（P）< 0.001; 纳秒，P（P）> 0.05.
图4
图4
Mapk11和Hipk3通过其激酶活性调节Htt水平。（A）HD中Htt水平的典型western blot和定量(STHdh公司第7季度/第11季度)细胞或WT(STHdh公司第7季度/第7季度)转染有指定siRNA的细胞。（B）HD中Htt水平的典型western blot和定量(STHdh公司第7季度/第11季度)转染显性阴性地图11cDNA(DN-MAPK11管道)与地图11cDNA(地图11)质粒。（C）HD中Htt水平的典型western blot和定量(STHdh公司第7季度/第11季度)用指定的靶向siRNA转染地图11以及表达MAPK11或DN-MAPK11的cDNA质粒。（D）在原代培养的纹状体神经元中卫生部第7季度/第140季度用干扰控制siRNA或地图11siRNA（Mapk11_si2），p38 Mapk抑制剂SB202190治疗后Htt水平的剂量依赖性曲线，使用2B7/2166抗体对通过HTRF测量。绘制为平均值和SEM的数据，n个= 6. 曲线由剂量依赖性曲线拟合。（E）代表性的western blot和定量分析显示野生型的过度表达嘻哈3cDNA（HIPK3）增加Htt水平STHdh公司第7季度/第11季度而激酶头Hipk3（K226M和D322N）没有这种作用。（F）左图，典型的western blots显示，使用Hipk3抑制剂AST487治疗可以降低STHdh公司第7季度/第11季度10μM的细胞。对，在STHdh公司第7季度/第11季度用干扰控制siRNA或嘻哈3siRNA（Hipk3_si1），使用2B7/2166抗体对通过HTRF测量AST487治疗后Htt水平的剂量依赖曲线。转基因嘻哈3siRNA消除了AST487的Htt降低作用。绘制为平均值和SEM的数据，n个= 10. 曲线由剂量依赖性曲线拟合。（G）类似（F）但在永生HD患者成纤维细胞中（Q68）。在右面板的HTRF实验中，HD Q68成纤维细胞被干扰控制siRNA或HIPK3型siRNA（HIPK3_si1）和mHTT水平通过使用2B7/MW1抗体对的HTRF测量。转染HIPK3型siRNA消除了AST487的作用。绘制为平均值和SEM的数据，n个= 10. 曲线由Sigmoidal剂量依赖曲线拟合。（H）在HD患者iPSC-衍生神经元（Q47）中，使用2B7/MW1抗体对通过HTRF测量AST487治疗后的mHTT水平。绘制为平均值和SEM的数据，n个= 12. 采用单因素方差分析和Dunnett’s进行统计分析事后（post-hoc）测验。**P（P）< 0.01.
图5
图5
Mapk11调节HTT公司mRNA水平通过调节HTT公司mRNA稳定性。（A）RT-qPCR结果STHdh公司细胞显示地图11降低Htt（高温）HD（左）而非野生型细胞（右）中的mRNA水平。这个X（X）-轴表示地图11mRNA表达水平，而Y（Y）-轴表示Htt（高温）mRNA水平。至于B类-D类每个点都展示了Htt（高温）与地图11独立转染孔的mRNA水平和数量(n个). 所有数据均归一化为干扰siRNA转染对照样品的平均值。红色干扰siRNA-转染对照样品；深色，细胞转染了这两种基因中的任何一种地图11siRNA（Mapk11_si1和Mapk11_si2）。相关系数对和P（P）通过Spearman相关分析计算每个图顶部的值。“***“每个图的右侧表示P（P）<0.001由未配对双尾计算t吨测试Htt（高温）mRNA水平地图11siRNA-转染样品与对照。（B）类似（A）但HD患者iPSC-衍生神经元（Q47）。数据图和统计分析的执行方式与（A）。（C）类似（A），但mRNA是从体内小鼠纹状体(卫生部第7季度/第140季度有或没有杂合敲除地图114-6.5月龄），并进行相同的统计分析。“n个“数字表示老鼠的数量。（D）非放射性脉冲相位实验表明地图11不影响Htt蛋白降解。siRNA被转染到STHdh公司第7季度/第11季度细胞。对每个点的三个独立转染孔进行测试。数据绘制为平均值和SEM。通过双向方差分析进行统计分析，以确定转染是否影响蛋白质降解。图右侧的“ns”表示siRNA转染和Htt蛋白降解之间没有统计学意义上的相互作用。（E）Htt下降了地图11siRNA（Mapk11_si2）在STHdh公司2B7/2166 HTRF电池。蛋白酶体抑制剂环氧霉素或自噬抑制剂巴非霉素A（BafA）并没有降低地图11击倒。条形代表平均值和SEM，数字表示独立转染孔的数量。通过单因素方差分析和Dunnett’s进行统计分析事后（post-hoc）测验。**P（P）< 0.01.（F）这个Htt（高温）启动子活性在STHdh公司第7季度/第11季度荧光素酶报告分析（见材料和方法）。击倒地图11没有显著影响Htt（高温）启动子活性。蓝线代表平均值和SEM，针对每种情况测试10个独立转染孔。统计分析由非配对双尾t吨测验。（G） Htt（高温）mRNA稳定性测量STHdh公司第7季度/第11季度细胞（左）和HD患者iPSC-衍生神经元Q47（右）。用指示的siRNA转染细胞36小时，然后用放线菌素D处理以阻止新的mRNA合成。这个高温/高温然后使用RT-qPCR在不同时间点测量mRNA水平，标准化为Hprt/Hprt公司mRNA水平并绘制为初始时间点的百分比。对于HD患者iPSC-derived神经元，β-actin和18S mRNA被用作对照，它们不受地图11击倒。由于其降解接近HPRT，并且其水平在每个时间点都归一化为HPRT，因此归一化水平在各个时间点上相对平坦。数据绘制为平均值和SEM。通过双向方差分析进行统计分析，以确定转染是否影响mRNA降解。***P（P）<0.0001的影响地图11siRNA开启Htt（高温）mRNA降解。
图6
图6
Hipk3调节自噬流量。（A）转染人患者成纤维细胞（Q68）的典型western blots和定量HIPK3型siRNAs与加扰对照siRNA.LC3B-II和Beclin1水平升高，而p62水平降低。采用单因素方差分析和Dunnett’s进行统计分析事后（post-hoc）测验。*P（P）< 0.05.（B）显微镜实验的代表性图像和定量显示，GFP-LC3斑点的数量通过敲除而增加HIPK3型转染GFP-LC3质粒的患者成纤维细胞（Q68）。比例尺，20μm。采用单因素方差分析和Dunnett’s进行统计分析事后（post-hoc）测验。***P（P）< 0.001.（C）类似（A）但来自患者iPSC-derived神经元（Q47）。采用单因素方差分析和Dunnett’s进行统计分析事后（post-hoc）测验。*P（P）< 0.05;**P（P）< 0.01.（D）通过LC3II抗体免疫染色对患者iPSC-derived神经元（Q47）内源性LC3II点的代表性图像和量化。LC3的过度表达导致这些细胞的毒性并改变其形态，因此对内源性LC3II点进行了检测。比例尺，20μm。统计分析采用双向非配对t吨测验。***P（P）< 0.001.（E）小鼠纹状体组织裂解物样品的典型western blots和定量。基因型已被指出。每个点代表一个鼠标。请注意，这些样品与图2D中使用的小鼠相同。对于所有条形图，数据表示平均值和SEM，数字表示蛋白质印迹的生物复制，或成像分析中的细胞数量。图像通过ImageJ进行盲分析。
图7
图7
Hipk3通过DAXX调节mHtt水平。（A）左，RT-qPCR和western blots证实DAXX公司通过其siRNA在HD患者成纤维细胞（Q68）中表达。右，在转染指定的siRNA后，通过HTRF使用抗体对2B7/MW1测量HD患者纤维细胞（Q68）中的mHTT水平。转基因DAXX公司siRNA阻断击倒效应HIPK3型。（B）转染指定的siRNA后，通过HTRF使用抗体对2B7/MW1测量HD患者（Q47）原代成纤维细胞（左）或HD患者iPSC-衍生神经元（右）中的mHTT水平。转基因DAXX公司siRNA阻断击倒效应HIPK3型。（C）用指示的siRNA转染的患者iPSC衍生的神经元（Q47）中内源性LC3II点状的代表性图像和定量。比例尺，20μm。点子的量化是盲目进行的，方框区域被放大并显示在右下角以更好地观察点子，但计数并不限于方框区域。统计分析采用双向非配对t吨测验。（D）转染所示siRNAs的患者iPSC-derived神经元（Q47）的代表性western blots和p62和LC3 blots的定量。（E）转染所示siRNAs的患者iPSC-derived神经元（Q47）中DAXX的代表性蛋白质印迹和定量。（F）说明介导MAPK11和HIPK3对mHTT水平的影响的正反馈回路的模型。对于所有条形图，数据表示平均值和SEM。通过双向非配对分析进行统计分析t吨测试一个到D类然后进行单因素方差分析，然后进行Dunnett的事后（post-hoc）测试E类和F类。*P（P）< 0.05;**P（P）< 0.01;***P（P）< 0.001; 纳秒，P（P）> 0.05.
图8
图8
降低Mapk11可以拯救iPSC-derived HD神经元和HD敲除小鼠模型中与HD相关的表型。（A）左面板、野生型（WT，Q19）或亨廷顿病（HD，Q47）iPSC-derived神经元的代表性相位对照（用于细胞汇合和形态学）和绿色荧光图像（用于使用caspase-3检测染料的caspase-3活性），这些神经元转染了指定的siRNAs，在BDNF剥夺条件下持续48小时。比例尺，100微米；右侧面板，通过IncuCyte软件量化每个场的caspase-3信号数量（绿色粒子数×大小×平均强度）。顶部的数字表示独立转染的微孔数量。每个孔的4个区域通过细胞培养箱中的IncuCyte成像进行量化。所有信号均归一化为HD细胞的平均值。横线代表平均值和SEM。统计分析采用单因素方差分析和Dunnett’s事后（post-hoc）测验。（B）左侧面板，Htt聚集物的代表性图像（通过抗体S830）单独或与DAPI和Darpp32合并。散点图，通过使用ImageJ进行颗粒分析，量化每个细胞的总聚集信号（聚集计数×大小×平均强度）。数据来自每种基因型的3只小鼠的12个不同切片。比例尺，20μm。在揭示基因型之前，盲目进行成像和分析。采用单因素方差分析和Dunnett’s进行统计分析事后（post-hoc）测验。（C）在具有捣碎表面的笔杆中测试所示基因型的每只小鼠在5分钟内的活跃行为（活动）总数。未配对双尾t吨在HD之间进行测试(卫生部问题140/问题140)和WT(卫生部第7季度/第7季度)没有的老鼠地图11删除(地图11+/+); 单向方差分析和Dunnett’s事后（post-hoc）在HD和WT组中进行测试。（D）左边是在开阔地中测试的指示基因型小鼠在15分钟内行进的总距离。右侧，将开放区域划分为4×4虚拟网格进行分析，并量化每只老鼠跨越中间4个区块边界的次数。进行了统计分析，如所示（C）。（E）指定基因型小鼠的代表性足迹。（F）步态耦合参数的顶部主成分（耦合PC1）图（补充信息，表S1）。进行了统计分析，结果如下（C）。（G）获救（绿色）与恶化（橙色）参数数量汇总地图11杂合或杂合敲除。类别是根据变化的方向来判断的。杂合或纯合基因敲除地图11在HD小鼠中，救援（绿色）明显多于恶化（橙色），表明救援效果。所选参数见补充信息表S2。对于所有图，误差条代表平均值和SEM。每个图顶部的数字表示老鼠的数量。在所有行为实验和聚集免疫荧光实验中，对小鼠进行盲法检测，并在数据记录和分析后揭示其基因型。从11个月龄的小鼠获得免疫荧光数据，从7.5个月龄小鼠获得行为数据。
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中的注释

  • 寻找没有MAP（K）的突变体。
    Tejwani L，Lim J。 Tejwani L等人。 Cell Res.2017年12月；27(12):1403-1404. doi:10.1038/cr.2017.140。Epub 2017年11月14日。 2017年细胞研究。 PMID：29134957 免费PMC文章。

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    1. 马丁·巴蒂斯特。神经退行性疾病的分子基础。N Engl J Med 1999年；340:1970–1980.-公共医学
    1. Soto C.揭示蛋白质错误折叠在神经退行性疾病中的作用。Nat Rev Neurosci 2003；4:49–60.-公共医学
    1. 亨廷顿病协作研究小组。一种新的基因，含有一个在亨廷顿病染色体上扩张且不稳定的三核苷酸重复序列。细胞1993；72:971–983.-公共医学
    1. Rubinsztein DC，Carmichael J.Huntington病：神经变性的分子基础。2003年《摩尔医学评论》专家；5:1–21.-公共医学
    1. Yamamoto A、Lucas JJ、Hen R.《亨廷顿病条件模型中神经病理学和运动功能障碍的逆转》。细胞2000；101:57–66.-公共医学

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