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.2017年10月；19(10):1214-1225.
doi:10.1038/ncb3610。 Epub 2017年9月11日。

Retriever是一种多蛋白复合物，用于逆转录酶依赖的内体货物回收

凯莉·麦克纳利 1, 丽贝卡·福克纳 2, 弗洛里安·斯坦博格 三, 马修·加隆 1, 拉杰什·加伊 4, 大卫·皮姆 5, 保罗·兰顿 1, 尼尔·皮尔逊 1, 克里斯·M·丹森 1, 海克·纳格尔 三, 林赛·L·莫里斯 2, 阿米卡·辛拉 2, 布列塔尼·L·奥弗利 6, 凯特·海索姆 7, 理查德·塞申斯（Richard Sessions） 1, 劳伦斯·班克斯 5, 布雷特·M·柯林斯 4, 伊姆雷·伯杰 1, 丹尼尔·比拉多 6, 埃兹拉·伯斯坦 2, 彼得·库伦 1
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Retriever是一种多蛋白复合物，用于不依赖逆转录酶的内体货物回收

凯莉·麦克纳利等。 Nat细胞生物学. 2017年10月.

摘要

在内吞作用进入内胚体网络后，完整的膜蛋白会进行分类，以进行溶酶体降解，或者被回收并再循环回细胞表面。在这里，我们描述了一个古老而保守的多蛋白复合物的发现，该复合物协调了货物的回收和再循环，重要的是，在生物化学和功能上与已建立的逆转录酶途径不同。我们把这个复杂的东西叫做“猎犬”；它是由DSCR3、C16orf62和VPS29组成的异源三聚体，与逆转录酶具有惊人的相似性。我们确定，取回器与货物适配器分类连接蛋白17（SNX17）结合，并与CCC（CCDC93、CCDC22、COMMD）和WASH复合物结合，以防止溶酶体降解并促进α5β1整合素。通过定量蛋白质组学分析，我们鉴定了120多个细胞表面蛋白，包括许多整合素、信号受体和溶质转运蛋白，这些蛋白需要SNX17受体维持其表面水平。我们对取回器的鉴定建立了一个主要的内体取回和再循环途径。

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作者声明没有竞争性的经济利益。

数字

图1
图1。比较GFP-SNX17和SNX17-GFP蛋白质组学鉴定了不依赖逆转录酶的分选机制
（A，B）GFP-SNX17和SNX17-GFP定位于RPE-1转导细胞的早期内体。n=3的代表视野。EEA1是早期内体标记，LAMP1是晚期内体/溶酶体标记。（C） GFP-SNX17和SNX17-GFP在HEK 293细胞中表达，并进行GFP陷阱。Western blot分析证实，这些结构物结合LRP1，即已确定的SNX17货物。代表性斑点n=3。（D） 在GFP或GFP-SNX17或SNX17-GFP的siRNA耐药版本重新表达之前，siRNA在HeLa细胞中抑制了SNX17。n=3的代表性图像。缩小后的图像见补充图1。（E） SILAC蛋白质组学示意图。（F） 分析GFP-SNX17和SNX17-GFP转导的细胞，并分析SNX17的表达。使用Odyssey软件测量GFP-SNX17或SNX17-GFP带强度，并将其归一化为负荷控制，并与内源性SNX17（设为1）进行比较。用t检验检测GFP-SNX17和SNX17-GFP水平之间的差异。从n=3进行量化。Ns=无显著性。（G） 筛选的蛋白质组数据绘制为logScore与log（SNX17-GFP富集/GFP-SNX17富集）。每个圆圈代表SNX17相互作用组的一个蛋白质。具有较大负对数（SNX17-GFP富集/GFP-SNX17富集）的蛋白质在SNX17-GFP条件下特异性丢失。以红色突出显示的蛋白质是逆转录酶复合体（VPS29）的成员，橙色圆圈表示CCC复合体的蛋白质，紫色圆圈表示一个CCC复合物相关蛋白（C16orf62），蓝色圆圈表示功能未知的蛋白质（DSCR3）。（H） 通过GFP陷阱和Western分析验证了瞬时转染GFP、GFP-SNX17、SNX17-GFP、GFP-VPS35或GFP-SNX27的HEK 293细胞的蛋白质组数据。代表性斑点n=3。（一） 对内源性SNX17进行免疫沉淀，并对回收的材料进行免疫印迹，以检测指示的蛋白质。n=3的代表性印迹
图2
图2。SNX17、CCDC22、CCDC93、C16orf62和DSCR3的抑制或VPS29而非VPS35的缺失导致α5β1整合素的错误排序
（A） 用靶向指示蛋白的siRNA转染HeLa细胞，并在转染72小时后固定。对细胞进行α5整合素和溶酶体标记LAMP1染色。n=3的代表性视野。通过三个独立的击倒实验计算了皮尔逊系数、共定位系数和显著性的量化。通过t检验将系数与加扰控制值进行比较。***p<0.001，**p<0.01。（B） VPS29基因敲除导致溶酶体错配α5β1整合素。亲代、VPS29 KO和VPS29 GO拯救（VPS29在VPS29 KO中重新表达）HeLa细胞固定并染色以检测α5整合素和溶酶体标记LAMP1。皮尔逊系数和共定域系数由3个独立实验计算得出。通过t检验将系数与亲代HeLa值进行比较。***p＜0.001，ns＝无显著性。（C） 将转染有所示siRNA的HeLa细胞与抗β1整合素单克隆抗体在37℃孵育30分钟。对表面结合的抗体进行酸剥离，然后在37°C下进一步孵育指定时间，然后固定。（D） 用靶向所示蛋白的siRNA转染HeLa细胞。细胞用不透膜的生物素结合物生物素化。细胞被裂解，用链霉亲和素琼脂糖分离生物素化蛋白，然后进行蛋白质印迹。从n=3进行量化。测量细胞表面蛋白质的谱带强度，并将其计算为扰乱控制谱带强度的%。使用t检验将敲除条件与加扰控制进行比较。***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05。误差条代表s.d.使用Odyssey软件对波段强度进行量化。（E） 用指定的siRNA敲除HeLa细胞。细胞在裂解前与溶酶体抑制剂亮蛋白蛋白孵育。然后通过蛋白质印迹分析蛋白质水平。用核糖体抑制剂环己酰亚胺处理3、6和9小时，然后用基于Western blot的α5β1整合素总水平定量，从转染了所示siRNA的三个独立实验（F）HeLa细胞中的一个获得的代表性印迹。从n=3进行量化。在Odyssey软件上实现了Western blot的定量。蛋白质量表示为每种条件下0小时蛋白质的百分比。%使用t检验，将击倒条件下的蛋白质百分比与每个时间点的打乱控制中的蛋白质百分比进行比较。***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05。
图3
图3。C16orf62、DSCR3和VPS29形成一种逆转录酶样异源三聚体
（A） 以已发表的VPS35结构为模板，构建了C16orf62的同源模型，残基717-1030。有关建模细节，请参见（van Weering等人，2012）。（B） C16orf62与DSCR3和VPS29相互作用，但与其他逆转录酶亚基VPS35和VPS26A不相互作用。GFP-VPS35或GFP-C16orf62的GFP陷阱，随后对HEK 293细胞进行Western分析。代表性斑点n=3。（C） 内源性C16orf62与内源性VPS29和DSCR3相互作用。HEK 293细胞中的内源性C16orf62免疫沉淀。n=3的代表性印迹。（D） C16orf62、Strep-DSCR3和VPS29-his构成一个复合物。使用MultiBac系统在Sf21昆虫细胞中表达C16orf62、Strep-DSCR3和VPS29-his（详见补充图2）。在超声波裂解后，将清理过的昆虫裂解液添加到充满塔龙树脂的柱中。用咪唑洗脱结合蛋白。收集纯化每个步骤的样品，用SDS-PAGE进行分析，然后进行考马斯染色或Western分析。对于考马斯染色，通过通道的裂解液、可溶性部分和塔龙流占塔龙柱总蛋白输入的0.05%。洗脱液占洗脱蛋白的1%。对于西方分析，装载了少量的蛋白质；从相同的裂解液中提取0.025%的可溶性和流动性样品，并提取0.5%的塔龙洗脱液。来自n=3的代表性图像。（E） C16orf62、Strep-DSCR3和VPS29-his在体积排阻色谱法下共同洗脱。按照D中所示的VPS29-his纯化，浓缩洗脱液并注入superdex200大小的排除柱。收集组分，然后通过SDS-PAGE进行分析，然后进行考马斯染色或Western印迹。（F） 检索器和逆转录酶最小蛋白组合（G和H）的示意图模型检索器与CCC复合物和逆转录物不同。用靶向指示蛋白的siRNA转染HeLa细胞，随后进行Western blot分析。代表性斑点n=3。使用Odyssey软件测量带强度，并将其归一化为各自的负载控制（β-肌动蛋白），然后计算与非靶向（扰乱）siRNA控制相比的蛋白质百分比。条形图表示三个独立实验的平均值。误差条表示S.E.M。
图4
图4。取回复合体需要CCC和WASH复合体进行内体定位
（A） 检索子域与逆转录子域在不同于ESCRT子域的检索子域上共存。将转染Rab5 Q79L–BFP的HeLa细胞甲醇固定，并对其进行内源性蛋白染色。n=3的代表性视野。为了清晰起见，BFP频道已从合并图像中排除，Hrs/Hrs-2已被错误地涂成蓝色。（B） 检索子或CCC复合物不与涉及逆转录酶内胚体募集的蛋白质相互作用。mHEK293细胞的樱桃陷阱。n=2的代表性Western blot。（C） 检索器需要CCC复合体进行内体定位。用靶向所示蛋白的siRNA转染HeLa细胞。通过共焦显微镜分析内源性C16orf62和VPS35定位。n=3的代表视野。低倍图像见补充图4A。（D） 量化C16orf62和VPS35之间在指示抑制下的C.Pearson系数。分析了3个独立实验。分析的细胞总数；Scr=144个细胞，SNX17=140个细胞，DSCR3=146个细胞，CCDC22+CCDC93=134个细胞。使用单向方差分析和邓内特检验将皮尔逊系数值与加扰控制进行比较。****p<0.0001，***p<0.001，ns无显著性。误差条代表s.d.（E）取回犬的内体定位与逆转录酶无关。将亲代HeLa细胞和VPS35 KO-HeLa细胞固定并染色以检测内源性SNX1以及VPS35、FAM21或C16orf62。代表性视野。（F） 检索器需要FAM21才能定位到内体。将VPS35或FAM21的亲代HeLa或KO-HeLa细胞固定并染色以进行C16orf62和SNX1的内源性定位。具有代表性的视野。（G） FAM21 KO-HeLa细胞显示α5-整合素错配表型。分析了α5-整合素在亲代HeLa细胞、VPS35-KO或FAM21-KO HeLa细胞中的分布。LAMP2被用作溶酶体的标记。代表性视野。（H） 取回犬内体定位的工作模型。
图5
图5。SNX17的进化保守羧基末端尾部与DSCR3相互作用
（A） HeLa细胞中内源性SNX17免疫沉淀和Western blot分析，包括CCDC93或DSCR3 KO细胞系和DSCR3再次表达后的DSCR3 KO细胞（DSCR3 KO Rescue）。n=3的代表。（B） SNX17和截断突变体的结构域组织示意图。（C） SNX17的羧基末端尾部需要与猎犬结合。来自HEK 293细胞中表达的标记SNX17截断突变体的GFP陷阱的Western分析。来自n=3（D）的代表性印迹SNX17的羧基末端尾部足以与猎犬和CCC复合物结合。在HEK 293细胞中表达的GFP-SNX3-SNX17尾嵌合体的GFP陷阱。跨物种SNX17尾部n=3（E）序列比对的代表性印迹。黄色表示序列同源性较高。箭头表示突变的残基，黑盒子表示D467X突变中缺失的四种氨基酸。（F） SNX17 L470G突变消除了与猎犬和CCC复合体的结合。GFP陷阱和HEK 293细胞中表达的标记SNX17定点突变体（以E表示）的Western分析。n=3的代表性印迹。（G） 量化（F）。使用Odyssey软件从n=3开始测量带强度。将谱带强度归一化为GFP表达，并表示为GFP-SNX17对照的平均分数。使用单向方差分析和Dunnett检验将代表S.E.M.突变株的误差条与WT进行比较。***p<0.001，**p<0.01，ns无显著性。
图6
图6。SNX17和DSCR3之间的相互作用在进化上是保守的，对于内胚体分选α5β1整合素至关重要
（A） WT SNX17而非SNX17 L470G可以挽救在SNX17阴性细胞中观察到的α5β1表型。将来自亲本HeLa细胞、SNX17 KO或SNX17 GO细胞的蛋白裂解物转导到内源性水平表达未标记SNX17或SNX17KO（L470G），然后进行Western blot分析。n=3的代表性印迹。（B） 从n=3开始对来自A的α5β1-整合素的总水平进行量化。（C） SNX17 L470G不能挽救在SNX17阴性细胞中观察到的α5β1溶酶体定位。用未标记的SNX17或SNX17（L470G）转导SNX17 KO-HeLa细胞。未转染的KO细胞作为对照。细胞被固定并用DAPI和针对溶酶体标记物LAMP1和α5-整合素染色。代表性视野。（D） SNX17和猎犬之间的相互作用是进化保守的。GFP-SNX3果蝇-SNX17尾部的GFP陷阱和在人HEK 293细胞中表达的等效羧基末端突变（L490G）。代表性斑点n=3。
图7
图7。细胞表面蛋白质组的全局定量分析表明，SNX17依赖于货物的提取调节整合素、细胞粘附分子、营养物质转运蛋白和信号受体
（A） 表面生物素化与基于SILAC的蛋白质组学耦合的示意图。（B） 完整蛋白质损失超过1.4倍，由2个或更多独特的肽识别。蓝色圆圈表示在三个独立的实验重复中减少的完整蛋白质，绿色圆圈表示减少了两个蛋白质。粗体和下划线蛋白质：已建立的SNX17货物，红色蛋白质：含有已知由SNX17参与的NPxY基序的货物，紫色：在细胞溶质区域包含NxxY基序蛋白质。（C） 使用Panther搜索（B）的基因本体。（D） 在3个独立实验中比较SNX17抑制后表面丢失的完整蛋白质，以及在SNX27或VPS35抑制后发表的研究中丢失的完整蛋白。（E） 击倒猎犬可以减少HPV感染。将含有荧光素酶报告子的HPV伪病毒添加到HaCaT细胞中，这些细胞被所示蛋白抑制。48小时后，通过分析细胞裂解物中萤火虫荧光素酶的活性来监测感染。
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    1. 霍塔里J，海伦尼乌斯A.内体成熟。EMBO J.2011；30:3481–3500.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Gallon M，Cullen PJ。内体分选中的逆转录酶和分选连接蛋白。生物化学Soc Trans。2015;43:33–47.-公共医学
    1. Schreij AM、Fon EA、McPherson PS。细胞膜转运与神经变性疾病。细胞分子生命科学。2016;73:1529–1545.-公共医学
    1. Henne WM，Buchkovich NJ，Emr SD。ESCRT途径。开发单元。2011;21:77–91.-公共医学
    1. Burd C，Cullen PJ。逆转录酶：内体分选的主要导体。冷泉Harb Perspect生物。2014;6-项目管理咨询公司-公共医学

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