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。2017年12月；24(12):787-800.
doi:10.1038/gt.2017.85。 Epub 2017年11月16日。

重组和进化AAV血清型在rd1小鼠和离体灵长类视网膜中的嗜性

D G希基 1, T L爱德华兹 1, A R巴纳德 1, M S辛格 1 2, S R de Silva先生 1, 机电元件 1, J G法兰 三, M W Hankins公司 1 4, R E麦克拉伦 1 2 5
附属机构

重组和进化AAV血清型在rd1小鼠和离体灵长类视网膜中的嗜性

D G希基等。 基因疗法。 2017年12月。

摘要

对于腺相关病毒（AAV）血清型最能针对特定视网膜细胞类型和手术输送途径（玻璃体内或视网膜下），存在很多争议。本研究比较了迄今为止在视网膜变性小鼠模型（rd1小鼠）和猕猴及人类视网膜移植中已知的三种最有效的AAV载体。由普遍存在的启动子驱动的绿色荧光蛋白（GFP）被包装成三个AAV衣壳：AAV2/8（Y733F）、AAV2/2（四Y-F）和AAV2/2。总的来说，AAV2/2（7m8）转导视网膜最大面积，导致GFP表达水平最高，其次是AAV2/2和AAV2/8（Y733F）。无论是玻璃体内注射还是视网膜下注射，AAV2/2（7m8）和AAV2/2。与视网膜下注射相比，经玻璃体内注射AAV2/8（Y733F）后，视网膜的转导面积明显更小。在小鼠视网膜中，视网膜神经节细胞、水平细胞和视网膜色素上皮表达相对较高水平的GFP，而无长突细胞表达较低水平GFP，双极细胞很少转导。锥体细胞是猕猴视网膜移植体中最常见的转导细胞类型，而Müller细胞是人类视网膜移植体的主要转导细胞。在测试的AAV血清型中，AAV2/2（7m8）对变性小鼠视网膜、猕猴和人类视网膜移植物中的一系列细胞类型的转导最有效。

PubMed免责声明

利益冲突声明

JGF是AAV2/2（7m8）专利的发明者。其他作者声明没有利益冲突。

数字

图1
图1
注射三种表达GFP的AAV血清型的退化小鼠视网膜的扫描激光眼底镜检查。(一–c（c）)在13–14周龄时注射小鼠，并在注射后3周通过共焦扫描激光眼底镜（cSLO）进行评估。从注射了以下血清型的每只眼睛获得以视盘为中心的图像：(一)AAV2/8（Y733F）(b条)AAV2/2（四Y-F）和(c（c）)AAV2/2（7m8）。使用相同的自动荧光设置。(d日)通过设置阈值像素值并确定高于该阈值的每个图像的面积，对SLO图像进行量化(e（电子）)阈值以上区域的信号强度（“像素值”）（平均值±s.e.m。；n个=4，AAV2/8（Y733F）和AAV2/2（四Y-F）；n个=3，AAV2/2（7m8））*P（P）<0.05, **P（P）<0.01. 比例尺，1 毫米。
图2
图2
退行性变患者分娩途径与AAV血清型比较的免疫组化数据统计分析rd1型小鼠视网膜。(一)对检查递送途径（玻璃体内或视网膜下）和AAV血清型对视网膜三层中每层阈值以上区域的影响的普通双向方差分析（ANOVA）测试进行了检查。只有递送途径和AAV血清型对内网状层阈值以上区域的影响在统计学上显示了递送途径与阈值以上区域之间的交互作用，F（1,11）=5.2，P（P）=0.043 (n个=3，除玻璃体内AAV2/2（7 m8）(n个=2)). 简单效应分析表明，视网膜下注射AAV2/8（Y733F）后内网状层阈值以上的面积显著低于玻璃体内注射AAV2/2（7m8）后的面积。(b条)普通双向方差分析测试了递送途径和AAV血清型对视网膜三层中每一层像素值的影响，结果显示没有统计学意义上的交互作用*P（P）<0.05.
图3
图3
注射三种血清型AAV-GFP并双重标记GFP和视网膜细胞标记物的退化小鼠视网膜的共焦荧光显微照片。退化第1版在小鼠视网膜内或视网膜下注射由普遍存在的启动子驱动的表达GFP的AAV载体，其具有三种AAV血清型之一：AAV2/8（Y733F）、AAV2/2（quad Y-F）或AAV2/2。垂直切片进行GFP和视网膜细胞标记物双重免疫标记：(一)钙结合蛋白；(b条)蛋白激酶Cα（PKCα）；(c（c）)谷氨酸脱羧酶67（GAD67）；(d日)甘氨酸转运体1（GlyT1）或(e（电子）)脑特异性同源框/POU域蛋白3a（Brn3a）。GFP和细胞标记物免疫阳性的细胞体被包围。箭头表示表达GFP的视网膜色素上皮（RPE）。由于RPE在样品制备过程中分离，因此大多数面板中无法识别RPE。共同定位结果汇总见表1。GCL，神经节细胞层；INL，内核层。比例尺，20 微米。
图4
图4
用三种血清型AAV-GFP转导的猕猴中央凹外植体。第三个 以中心凹为中心的猕猴视网膜直径为mm的圆盘在AAV-GFP溶液中培养8天，然后固定并用抗GFP抗体进行免疫标记。用三种不同的AAV血清型转染不同的外植体：AAV2/8（Y733F）、AAV2/2（quad Y-F）和AAV2/2。使用相同的设置获取图像。在所有图像中，外核层距离相机最近。比例尺，500 微米。
图5
图5
用三种血清型AAV-GFP转导并双重标记GFP和视紫红质的猕猴视网膜移植物的荧光显微照片。将取自中央窝的猕猴外植体转染AAV-GFP，转染三种血清型之一——AAV2/8（Y733F）、AAV2/2（四Y-F）或AAV2/2。将外植体固定、切片并用抗GFP和视紫红质（1D4）的抗体进行双重免疫标记，以显示GFP在视网膜层中的分布。所有部分的方向都是感光层向上。请注意，这些图像来自于图4所示样本中唯一的组织。GCL，神经节细胞层；INL，内核层；ONL，外核层。比例尺，200 微米。
图6
图6
用AAV2/8（Y733F）-GFP转导的猕猴中央窝移植物共聚焦荧光显微照片，共标记视网膜细胞标记物。(一)猕猴中央窝外植体中大多数GFP阳性细胞为钙结合蛋白阳性，表明它们是球果。(b条)然而，少数GFP阳性感光细胞为钙结合蛋白阴性（箭头），结合这些细胞细长的内段形态和胞体更内部的位置，表明这些是杆状物。神经节细胞层（*）也发现钙结合蛋白和GFP阳性细胞。(c（c）)在扁平外植体的最外围，PKCα阳性双极细胞被联合标记（箭头）。GCL，神经节细胞层；INL，内核层；ONL，外核层。比例尺，20 微米。
图7
图7
用三种血清型AAV-GFP转导的人视网膜移植体的荧光显微照片。在三种不同血清型的AAV-GFP存在下，对需要视网膜切除术的患者的视网膜进行1周的培养：(一)AAV2/8（Y733F）(b条)AAV2/2（四元Y-F）或(c（c）)AAV2/2（7米8）。对外植体进行切片并免疫标记GFP和细胞标记物，如蛋白激酶Cα（PKCα），用于(一)和(b条)仅限）。GFP主要局限于AAV2/8（Y733F）转导视网膜的内核层（INL），但在AAV2/2（四Y-F）和AAV2/2的转导视网膜中延伸至所有视网膜层（7m8）。GCL，神经节细胞层；ONL，外核层。比例尺，20 微米。
图8
图8
用AAV2/8（Y733F）-、AAV2/2（quad Y-F）-或AAV2/2（7m8）-GFP转导，或不转导AAV并共同标记GFP和(一和e（电子）)蛋白激酶Cα（PKCα）(b条)视紫红质(c（c）)胶质纤维酸性蛋白（GFAP）或(d日)钙结合蛋白。(一,e（电子）)GFP和PKCα均未对任何细胞进行双重标记。(b条)用AAV2/2（四Y-F）-GFP和AAV2/2。(c（c）)AAV2/2（四联Y-F）-GFP和AAV2/2-GFP转基因视网膜显示GFP与GFAP共定位（箭头）。(d日)AAV2/2（7m8）-GFP转导的视网膜切片中发现GFP和钙结合蛋白阳性的细胞（箭头）。(e（电子）)未接触AAV的视网膜中未发现GFP。所有部分的方向都是感光层向上。GCL，神经节细胞层；INL，内核层；ONL，外核层。比例尺，20 微米。
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