Progranulin deficiency causes impairment of autophagy and TDP-43 accumulation

doi:10.1084/jem.20160999

.2017年9月4日；214(9):2611-2628.

doi:10.1084/jem.20160999。 Epub 2017年8月4日。

孕激素缺乏导致自噬和TDP-43积累受损

迈克尔·C·张¹, 卡尔帕甘·斯里尼瓦桑², 布拉德·弗里德曼^三, 埃里克·苏托⁴, 佐拉·莫德鲁桑⁵, 怀恩·P·李⁴, 约书亚·S·卡明克^三, 大卫·V·汉森², 摩根盛⁶

附属机构

¹神经科学系，基因泰克公司，加利福尼亚州南旧金山chang.michael@gene.com。
²神经科学部，Genentech公司，加利福尼亚州南旧金山。
^三生物信息学和计算生物学系，Genentech，Inc.，加利福尼亚州南旧金山。
⁴转化免疫学系，Genentech，Inc.，加利福尼亚州南旧金山。
⁵分子生物学系，Genentech，Inc.，加利福尼亚州南旧金山。
⁶神经科学部，Genentech，Inc.，加利福尼亚州南旧金山sheng.morgan@gene.com。

PMID： 28778989
预防性维修识别码：项目编号：C5584112
内政部： 10.1084/jem.20160999

孕激素缺乏导致自噬和TDP-43积累受损

迈克尔·C·张等。实验医学杂志. 2017.

.2017年9月4日；214(9):2611-2628.

doi:10.1084/jem.20160999。 Epub 2017年8月4日。

作者

附属机构

¹神经科学系，基因泰克公司，加利福尼亚州南旧金山chang.michael@gene.com。
²神经科学部，Genentech公司，加利福尼亚州南旧金山。
^三生物信息学和计算生物学系，Genentech，Inc.，加利福尼亚州南旧金山。
⁴转化免疫学系，Genentech，Inc.，加利福尼亚州南旧金山。
⁵分子生物学系，Genentech，Inc.，加利福尼亚州南旧金山。
⁶神经科学部，Genentech，Inc.，加利福尼亚州南旧金山sheng.morgan@gene.com。

PMID： 28778989
预防性维修识别码：项目编号：C5584112
内政部： 10.1084/jem.20160999

摘要

功能丧失突变GRN公司用43 kD（TDP-43）阳性内含物的反式反应DNA-结合蛋白和神经元类蜡样脂褐质沉积症（NCL）引起额颞叶痴呆（FTD）。无论是FTD还是NCL，都没有疾病修饰疗法，部分原因是对诸如GRN公司有助于疾病发病和神经退行性变。通过研究缺乏前颗粒蛋白（PGRN）的小鼠GRN公司我们发现了多种证据表明，PGRN缺乏会导致自噬损伤，自噬是一种关键的细胞降解途径。PGRN缺乏小鼠对单核细胞增生李斯特菌由于异种吞噬的缺陷，一种特殊形式的自噬调节细胞内病原体的清除。缺乏PGRN的细胞表现出自噬流量减少，并且TDP-43的病理形态通常通过自噬清除，在PGRN缺乏的神经元中积累得更快。我们的发现暗示自噬是一种新的治疗靶点GRN公司-并强调了神经退行性疾病更广泛的FTD/肌萎缩侧索硬化谱中出现的缺陷自噬主题。

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数字

**图1。**
**脑和小胶质细胞/巨噬细胞溶酶体相关基因表达的改变*GRN公司^−/−*老鼠。**（A和B）杂合子的整个大脑皮层中基因表达改变的火山图（fold-change vs.p-value）*GRN公司^+/−*小鼠（A）或纯合子*GRN公司^−/−*小鼠（B）相对于WTGRN公司^+/+小鼠（均为12个月大）。蓝色圆圈代表显著下调的基因，红色圆圈代表明显上调的基因。带有黑色轮廓的圆圈显示了溶酶体细胞成分GO项（GO:0005764）表达发生显著变化的基因。n个=一个实验中每组5只小鼠。使用voom/limma在P<0.05时显著性截止。N.C.，无变化。（C）热图显示溶酶体相关基因子集在大脑皮层的表达*GRN公司^+/+*，*GRN公司^+/−*、和*GRN公司^−/−*老鼠。显示的基因是在*GRN公司^−/−*皮质相对于*GRN公司^+/+*皮层，是溶酶体细胞成分GO术语的成员（GO:0005764；即，B中带黑色轮廓的红圈）。n个=一个实验中每组5只小鼠。（D）热图显示同一组溶酶体相关基因在分类的小胶质细胞/巨噬细胞、神经元和星形胶质细胞中的表达，如C所示*GRN公司^+/−*和*GRN公司^−/−*老鼠。在每种细胞类型中分别对基因表达进行标准化。n个=所有组五个实验中的5只小鼠*GRN公司^+/−*星形胶质细胞(n个=4只小鼠）。（E） D所示数据的基因密度与折叠变化图。n个=5只小鼠，来自除*GRN公司^+/−*星形胶质细胞(n个=4只小鼠）。（F）组织蛋白酶D每百万映射读取（nRPKM）每千基转录本的标准化读取数(*CTSD公司*)整体*GRN公司^+/+*，*GRN公司^+/−*、和*GRN公司^−/−*皮质（左）和分类的小胶质细胞/巨噬细胞、星形胶质细胞和神经元*GRN公司^+/−*、和*GRN公司^−/−*皮质（右）。n个=所有组五个实验中的5只小鼠*GRN公司^+/−*星形胶质细胞(n个=4只小鼠）。误差线代表平均值±SEM。

**图2。**
**防御能力受损*单核细胞增生李斯特菌*在缺乏PGRN的小鼠中。**（A） 14天生存曲线*GRN公司^+/+*（蓝色实线），*GRN公司^+/−*（绿色虚线），以及*GRN公司^−/−*静脉注射后（红色虚线）小鼠*单核细胞增生李斯特菌*感染。n个=一次实验中每组12只小鼠。****，P<0.0001GRN公司^+/+与*GRN公司^−/−*使用log-rank测试。（B）*单核细胞增生李斯特菌*中的负担*GRN公司^+/+*（蓝色圆圈）和*GRN公司^−/−*（红三角）小鼠感染后2d。n个=一次实验中每组5只小鼠。*，P<0.05和**，P<0.01与*GRN公司^+/+*使用未配对t吨用韦尔奇修正进行测试。（C）血清PGRN水平对*单核细胞增生李斯特菌*感染。n个=一次实验中每组5只小鼠。***，与感染前相比，使用配对t吨测试。（D）患者血清IL-6、IL-10和MCP-1水平*GRN公司^+/+*（圆圈）和*GRN公司^−/−*静脉注射后的（三角形）小鼠*moncytogenes乳杆菌*感染。n个=来自一个实验的每组5只小鼠。*，P<0.05与*GRN公司^+/+*使用未配对t吨测试。（E）患者血清IL-6、IL-10和MCP-1水平*GRN公司^+/+*（圆圈）和*GRN公司^−/−*LPS治疗后的（三角形）小鼠。n个=一次实验中每组5只小鼠。*，P<0.05和**，P<0.01使用未配对t吨测试。误差线代表平均值±SEM。

**图3。**
**巨噬细胞的吞噬功能受损*GRN公司^−/−*老鼠。**（A）*单核细胞增生李斯特菌*BMDM清除试验*GRN公司^+/+*（蓝色圆圈）和*GRN公司^−/−*小鼠（红色三角形）对指示的*单核细胞增生李斯特菌*.n个=3个独立实验，每个实验一式四份（每个独立实验的平均值用图表表示）。***，P<0.001与*GRN公司^+/+*，使用线性最小二乘回归分析。（B）代表性显微照片n个=5个独立实验显示BMDM来自*GRN公司^+/+*（顶行）和*GRN公司^−/−*（底部）感染GFP标记的小鼠*ΔactA L.单核细胞增生*（左），LC3染色（中）。示例细菌用箭头标记。棒材，10µm。（C）量化*单核细胞增生李斯特菌*/如B所示，实验中的LC3共定域。n个=5个独立实验。**，P<0.01与*GRN公司^+/+*使用未配对的t吨测试。（D）典型的Western印迹来自n个=4个独立的细胞裂解物实验*GRN公司^+/+*和*GRN公司^−/−*在缺乏（顶行）和存在（中行）100 nM巴非霉素A1的情况下，BMDM在指定的时间内饥饿，并检测LC3和肌动蛋白。图3D和S2 A中所示的肌动蛋白（负载控制）免疫印迹是相同的；这个肌动蛋白免疫印迹，以及LC3（图3D）和p62（图S2A），是通过重复相同的Western印迹获得的。分子质量以千道尔顿表示。（E）根据D中的实验对LC3 II水平进行量化。n个=4个独立实验。§，P=0.0028适用于*GRN公司^−/−*与*GRN公司^+/+*采用双向方差分析和Dunnett多重比较检验（0.5 h=P<0.01，1 h=P<0.05，2 h=P<0.0001，4 h=P＜0.01）。（F）来自的代表性图像n个=3个独立实验*GRN公司^+/+*（左）和*GRN公司^−/−*（右）在LC3染色前用所示化合物处理BMDM。棒材，10µm。（G）根据F所示的实验，量化每个细胞的LC3点数量。n个=从左至右所列组的三个独立实验中的56、47、39、60、67、65个细胞。**，P<0.01与*GRN公司^+/+*使用Mann–WhitneyU型测试。误差线代表平均值±SEM。EBSS，厄尔平衡盐溶液。

**图4。**
**自噬和自噬信号受损*GRN公司^−/−*神经元。**（A）典型的Western印迹来自n个=3个独立的细胞裂解物实验*GRN公司^+/+*和*GRN公司^−/−*在缺少（顶行）或存在（底行）100 nM巴非霉素A1的情况下，皮层神经元在指定的时间内饥饿，并探测LC3和肌动蛋白。（B）根据A中的实验对LC3 II水平进行量化。n个=3个独立实验。§，P=0.038适用于*GRN公司^−/−*与*GRN公司^+/+*采用双向方差分析和Dunnett多重比较检验（0.5 h=不显著[n.s.]，1 h=P<0.05，2 h=P<0.01，4 h=P<0.0001）。（C）典型的Western印迹来自n个=3个来自培养的细胞裂解物的独立实验*GRN公司^+/+*和*GRN公司^−/−*用指示的抗体探测皮层神经元。（D）根据C所示的实验对AMPK和TBK1的磷酸化/总信号进行量化。n个=3个独立实验。**，P<0.01和***，P<0.001与*GRN公司^+/+*使用未配对t吨测试。（E） ~18个月大时整个皮层的代表性蛋白质印迹*GRN公司^+/+*和*GRN公司^−/−*小鼠用指示的抗体进行探测。n个=一个实验中每组3只小鼠。（A、C和E）分子质量以千道尔顿表示。（F）如E所示，对所示蛋白质（左）和LC3 II/LC3 I信号（右）的磷酸化/总信号进行量化。n个=一个实验中每组3只小鼠。*，P<0.05和**，P<0.01使用未配对t吨测试。误差线代表平均值±SEM。

**图5。**
**PGRN对自噬信号的刺激。**（A）典型的Western印迹来自n个=3个独立的细胞裂解物实验*GRN公司^−/−*未经处理或使用10µg/ml重组小鼠PGRN或载体的皮层神经元，并用指示的抗体进行探测。（B） A所示实验中所示蛋白质磷酸化/总蛋白信号的量化。n个=3个独立实验。*，P<0.05和**，P<0.01与*GRN公司^+/+*使用未配对t吨测试。（C） PGRN刺激AMPKα磷酸化的剂量-反应关系。代表性蛋白质印迹n个=3个独立实验*GRN公司^−/−*用指定浓度的重组mPGRN处理皮层培养物，并用指定抗体进行探测。（A和C）分子质量以千道尔顿表示。（D）如C所示，通过实验对磷酸-AMPKα/总AMPKα信号进行量化。n个=3个独立实验。*，使用Dunnett多重比较检验进行单因素方差分析，与未治疗组相比，P<0.05和***，P<0.001。误差线代表平均值±SEM。

**图6。**
**致病性TDP-43在*GRN公司^−/−*神经元。**（A）典型的Western印迹来自n个=4个独立实验*GRN公司^+/+*和*GRN公司^−/−*感染表达AAV mCherry和全长TDP43-GFP（左）或TDP43CT-GFP（右）的皮层培养物，并用指示的抗体进行检测。分子质量以千道尔顿表示。（B）实验中GFP/mCherry信号的量化，如A所示。n个=4个独立实验。***，P<0.001与*GRN公司^+/+*使用未配对t吨测试。（C）的代表性图像*GRN公司^+/+*和*GRN公司^−/−*用mCherry（顶行）和TDP43CT-GFP（底行）共同转染海马神经元，并用载体（DMSO；左）、10µM PGRN（中）或100 nM巴非霉素A1（右）处理。n个从左至右所列组的八、八、三、三、八和八个独立实验中，每种基因型和条件=158、173、37、69、147和96个细胞。棒材，25µm。（D） A所示实验中每个细胞的总GFP荧光定量。数据归一化为*GRN公司^+/+*载体处理的细胞。n个从左至右所列组的八、八、三、三、八和八个独立实验中，每种基因型和条件=158、173、37、69、147和96个细胞。*，与车辆治疗组相比，P<0.05和**，P<0.01GRN公司^+/+使用Kruskal–Wallis单向方差分析和Dunn的多重比较测试。误差线表示平均值±SEM.ns，不显著。

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1. Almeida M.R.、Macário M.C.、Ramos L.、Baldeiras I.、Ribeiro M.H.和Santana I.，2016年。葡萄牙人家族，因前颗粒蛋白基因突变而同时出现额颞叶变性和神经元类蜡样脂褐质沉积症表型。神经生物学。老化。41:200.e1–200.e5。2016年10月10日/j.neurobiolaging.2016.02.019-DOI程序-公共医学
1. Anakwe O.O.和Gerton G.L.，1990年。顶体生物发生始于减数分裂：来自豚鼠精子发生过程中顶体糖蛋白顶粒蛋白合成和分布的证据。生物再现。42:317–328. 10.1095/生物制品42.2.317-DOI程序-公共医学
1. Baker M.、Mackenzie I.R.、Pickering Brown S.M.、Gass J.、Rademakers R.、Lindholm C.、Snowden J.、Adamson J.、Sadovnick A.D.、Rollinson S.等人。progranulin突变导致与17号染色体相关的tau阴性额颞叶痴呆。自然。442:916–919. 10.1038/自然05016-DOI程序-公共医学
1. Barmada S.J.、Serio A.、Arjun A.、Bilican B.、Daub A.、Ando D.M.、Tsvetkov A.、Pless M.、Li X.、Peisach D.等人。2014.自噬诱导提高神经元ALS模型中TDP43的周转和存活率。自然化学。生物学10:677–685。10.1038/nchembio.1563-DOI程序-项目管理咨询公司-公共医学

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[4] Almeida M.R.、Macário M.C.、Ramos L.、Baldeiras I.、Ribeiro M.H.和Santana I.，2016年。葡萄牙人家族，因前颗粒蛋白基因突变而同时出现额颞叶变性和神经元类蜡样脂褐质沉积症表型。神经生物学。老化。41:200.e1–200.e5。2016年10月10日/j.neurobiolaging.2016.02.019-DOI程序-公共医学

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[6] Anakwe O.O.和Gerton G.L.，1990年。顶体生物发生始于减数分裂：来自豚鼠精子发生过程中顶体糖蛋白顶粒蛋白合成和分布的证据。生物再现。42:317–328. 10.1095/生物制品42.2.317-DOI程序-公共医学

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