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.2016年9月15日；11（9）：e0163029。
doi:10.1371/journal.pone.0163029。 2016年eCollection。

富含亮氨酸重复激酶2（LRRK2）与p62/SQSTM-1在选择性自噬中的相互作用

Sangwook公园 1, Seulki Han先生 2 三, 因苏普·崔 4, 贝姆苏·金 4, 升皮公园 2 三, 恩惠-乔 4, Young Ho Suh公司 2 三
附属公司

富含亮氨酸重复激酶2（LRRK2）与p62/SQSTM-1在选择性自噬中的相互作用

Sangwook公园等。 公共科学图书馆一号. .

摘要

多泛素化聚集体的沉积与帕金森病（PD）的病理生理学有关，越来越多的证据表明选择性自噬在自噬体清除泛素阳性蛋白聚集体中起着关键作用。选择性自噬受体p62/SQSTM-1直接与泛素和LC3结合，将泛素偶联物转运到自噬体进行降解。富含亮氨酸的重复激酶2（LRRK2）是一种PD-相关蛋白激酶，受自噬溶酶体降解和泛素蛋白酶体途径的严格控制。然而，关于泛素化LRRK2通过选择性自噬降解的情况知之甚少。在本研究中，我们发现p62/SQSTM-1作为选择性自噬受体与LRRK2发生物理相互作用。p62的过度表达通过自噬溶酶体途径导致LRRK2的强烈降解。此外，LRRK2间接调节p62的Ser351和Ser403磷酸化。特别有趣的是，磷酸化p62和Keap1之间的相互作用因LRRK2过度表达而减少。因此，我们认为LRRK2和p62之间的相互作用可能有助于LRRK1蛋白的病理生理功能和体内平衡。

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数字

图1
图1。LRRK2被UPS和ALP降级。
A类14天时的原代大鼠皮层神经元在体外将DMSO、5μM MG132、10 mM 3-甲基腺嘌呤（3-MA）、50μM氯喹或50 nM巴非霉素A1培养2小时。显示了四到五个独立实验中指示蛋白质的代表性免疫印迹。B类使用ImageJ软件对与DMSO处理样品中LRRK2的表达水平进行量化。条形图数据表示LRRK2表达的平均值±SEM（DMSO，1.00±0.08；MG132，2.46±0.52；3-MA，2.22±0.51；氯喹，3.32±0.70；巴非霉素A1，3.73±0.93；n=4-5；*p<0.05，成对t吨-测试）。
图2
图2。LRRK2与p62相互作用。
A类HEK 293T细胞与FLAG-标记的p62（FLAG-p62）、c-myc-标记的LRRK2（myc-LRRK1）或两者瞬时共转染。转染后24小时，用抗c-myc单克隆抗体9E10对总细胞裂解物进行免疫沉淀。用western blotting分析p62与LRRK2的结合。B类用指示量的抗p62抗体（0.25~1.5μg）免疫沉淀法检测HEK 293T细胞中内源性LRRK2与p62的结合。C类用指示量的抗p62抗体（0.5～1.5μg）免疫沉淀大鼠脑总裂解物的P2部分。免疫复合物通过SDS-PAGE溶解，然后对所示抗体进行免疫印迹。使用一微克兔抗GFP抗体作为阴性对照（IgG）。D类用myc标记的LRRK2 WT或突变表达构建物（G2019S、R1441C、D1994A或G2385R）和FLAG标记的p62瞬时转染HEK 293T细胞。如图A所示进行共免疫沉淀。E类条形图显示了p62与突变LRRK2的相对结合，归一化为LRRK2WT。数据来自四个独立的实验；n.s.表明，与WT结合相比，p>0.05，用单因素方差分析进行分析。
图3
图3。LRRK2和p62之间的结合域映射。
A类.显示面板A中使用的LRRK2结构域和LRRK1片段（F1-F8）的示意图。F1：氨基酸（aa）1-480，N末端片段1；F2:aa 480–895，N端片段2；F3:aa 895–1329，N端片段3；F4：氨基酸981–1503，LRR+GTP酶；F5:aa 981–1298，LRR；F6:aa 1534–1857，COR；F7:aa 1866–2139，激酶；F8:aa 2125–2528，WD40域。B类.p62与LRRK2的N末端区域相互作用。如图B所示，GFP标记的p62与所示的FLAG-LRRK2片段结构体F1–F8在HEK 293T细胞中共同转染。使用兔抗GFP抗体进行免疫沉淀，并使用小鼠抗FLAG抗体检测结合域。C类显示面板A中使用的p62结构域和p62片段（G1-G6）的示意图。G1:GFP单独；G2:aa 1–103，p62 Phox和Bem1（PB1）；G3：aa 1–163、p62 PB1和锌指（ZZ）；G4:aa 1–251，p62ΔLIR/ΔUBA；G5:aa 1–386，p62ΔUBA；G6：氨基酸1–440，p62全长。ΔTB、ΔSMIR和ΔSMIR/TB分别表示p62 aa 225–251、aa 166–224、aa 66–251的缺失突变体。所有突变结构都经过了序列验证，并具有完全的保真度。微管相关蛋白1A/1B-轻链3-相互作用区；UBA，泛素相关域。D类.LRRK2通过p62的SMIR与p62交互。用GFP-p62片段构建物（G1-G6）和myc标记的LRRK2共同转染HEK 293T细胞。使用抗myc（左面板）或抗GFP抗体（右面板）进行共免疫沉淀分析。箭头表示免疫球蛋白重链（IgH）。
图4
图4。LRRK2的稳定性由p62调节。
A类用0.25、0.5或1.0μg FLAG-p62表达质粒或对照载体转染HEK 293T细胞24 h。Bafilomycin A1处理2 h。用来自总细胞裂解物的LRRK2抗体通过western blotting检测内源性LRRK_2表达。A组的量化数据代表LRRK2表达的平均值±SEM（Vec，1.00±0.00；0.25μg p62，0.59±0.12；0.5μg p62，0.34±0.15；1.0μg p六十二，0.46±0.15）；n=3；*p<0.05，成对t吨-测试）。B类用巴非霉素A1处理初级皮层神经元2h，并用所示抗体用免疫印迹法检测内源性蛋白水平。C类初级皮层神经元感染了慢病毒，慢病毒在泛素启动子下过度表达GFP（对照）或p62（p62 OE）。神经元也感染了慢病毒，慢病毒在H1启动子下携带p62小发夹RNA（shRNA），以抑制p62（p62KD）的表达。感染后5-7天，用二甲基亚砜或5μM MG132处理神经元2小时。用免疫印迹法检测内源性LRRK2的表达。箭头表示3X FLAG标记的p62的外源性表达，其中的条带因p62分子量增加与三个串联的FLAG表位融合而移位。D类。显示了LRRK2相对于对照物的带强度量化。平均值±SEM（对照组，1.00±0.00；P62 OE，0.60±0.11；P62 KD，1.12±0.49；P62 OE的n=4，p62KD的n=13；*p<0.05，n.s.表示p>0.05，成对t吨-测试）。E类将FLAG-p62表达质粒转染HEK 293T细胞。转染后24小时，用100 nM雷帕霉素处理细胞2小时，用所示抗体进行蛋白质印迹分析蛋白表达水平。F类条形图数据表示标准化LRRK2表达±SEM的平均值（Vec，1.00±0.00；Vec与雷帕霉素，0.39±0.08；p62，0.35±0.05；p62与雷帕霉素，0.51±0.04；n=3，*p<0.01，n.s.表示p>0.05，成对t吨-测试）。G公司HEK 293T细胞联合转染WT或G2019S myc-LRRK2和磷酸化突变株FLAG-p62 Ser403Glu（S403E）或去磷酸化突变Ser403Ala（S403A）。用蛋白质印迹法检测LRRK2的表达。小时条形图数据表示面板G中归一化LRRK2表达±SEM的平均值（Vec，1.00±0.00；S403E，0.50±0.01；S403A，1.28±0.66；G2019S中S403E的表达，0.47±0.11；n=3-4，*p<0.05，成对t吨-测试）。
图5
图5。LRRK2调节p62的Ser351磷酸化。
A类用含有LRRK2 shRNA或非靶向shRNA序列（NT shRNA）的慢病毒感染初级皮层神经元7天，并用所示抗体通过免疫印迹分析内源性蛋白表达水平。B类将LRRK2敲除归一化为NT shRNA后p62的相对磷酸化水平进行量化。摘要数据以三个独立实验（NT shRNA，1.00±0.00；pSer351，2.92±0.74；pSer403，3.10±1.09；n=3；*p<0.05，成对t吨-测试）。C类将GFP-p62 WT或Ser351Glu（S351E）与载体对照、WT或G2019S myc-LRRK2在HEK 293T细胞中共转染。通过抗GFP（p62）抗体免疫沉淀分析Keap1与p62的内源性结合。D类面板C的量化数据表示相对Keap1与p62±SEM结合的平均值（WT LRRK2，1.05±0.19；GS LRRK1，0.67±0.11；矢量，1.51±0.08；n=3；*p<0.05，成对t吨-测试）。
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本研究由韩国国家研究基金会（NRF）资助(网址：http://nrf.re.kr/)发送给S.P.（2013R1A1A2058079）和Y.H.S.（NRF-2011-00116942015048055）；Brain Korea 21 PLUS计划(网址：https://bkplus.nrf.re.kr/)至S.H。；以及首尔国立大学医院（2016年）的资助(网址：http://www.snuh.org/)至Y.H.S。

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