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.2016年8月1日；126(8):3104-16.
doi:10.1172/JCI85193。 Epub 2016年7月18日。

通过体内细胞融合重新编程Müller胶质细胞再生小鼠光感受器

丹妮拉·桑格斯, 贾科玛·西蒙特, 翁贝托·迪维奇诺, 诺伊斯·罗莫, 伊莎贝尔·皮尼拉, 马尔塔·尼科拉斯, 玛丽亚·皮亚·科斯马

通过体内细胞融合重新编程米勒神经胶质再生小鼠光感受器

丹妮拉·桑格斯等。 临床研究杂志. .

摘要

视网膜色素变性引起的视力损害和失明是由严重的神经退化引起的，这种神经退化会导致感光细胞的丢失，而感光细胞是一种特殊的光敏神经元，能够产生视觉。虽然哺乳动物的神经系统无法替换因退化而丢失的神经元，但已经提出了对常驻胶质细胞进行重新编程以替换视网膜神经元的治疗方法。在这里，我们证明视网膜Müller胶质细胞可以在体内重新编程为视网膜前体，然后分化为光感受器。我们将造血干细胞和祖细胞（HSPCs）移植到受光感受器变性影响的视网膜中，观察Müller胶质细胞与移植细胞之间的自发细胞融合事件。移植HSPC中Wnt信号的激活可提高苗勒-HSPC杂种的存活率和增殖率，并可将其重编程为中间光感受器前体。这表明Wnt信号驱动重编程细胞走向感光前体命运。最后，Müller-HSPC杂种分化为光感受器。带有活化Wnt的HSPC移植在rd10小鼠（遗传性视网膜色素变性模型）中具有功能性挽救视网膜变性表型的作用。总之，这些结果表明，通过对Müller胶质细胞进行重新编程可以产生感光细胞，并且这种方法可能具有逆转视网膜变性的潜力。

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数字

图1
图1。移植的HSPC在感光细胞损伤后与MG融合。
(A类)实验计划的示意图。LoxP-STOP-LoxP-YFP供体小鼠（R26Y）和受体小鼠分离的HSPC之间的细胞融合Gfap-Cre公司MG细胞导致去除带绒毛的终止密码子，进而导致YFP的表达。(B类)YFP的代表性联合通信管理+混合（绿色）和TUNEL+从受损或健康的MNU视网膜切片上采集的（红色）凋亡感光细胞（对照）Gfap Cre公司HSPC视网膜下移植术后12小时R26年.YFP+在MNU受损的视网膜中检测到来自细胞融合的杂种（绿色），显示TUNEL+ONL中的感光细胞，但未受损的眼睛中没有感光细胞（对照组）。细胞核用DAPI（蓝色）复染。比例尺：20μm。n个= 3. (C类)DiD百分比的统计分析+YFP公司+根据DiD-标记HSPC总量评估杂种R26年通过FACS分析检测到MNU受损或健康（对照）Gfap-Cre公司移植后24小时视网膜。数据表示为3个独立实验的平均值±SD。n个= 3. ***P（P）<0.0001由未配对学生t吨测试。(D类)YFP的代表性免疫染色+杂交后代（绿色）MG标记（GS，红色；黄色箭头）也呈阳性，但在HSPC移植24小时后检测到的感光细胞标记物恢复素（红色；绿色箭头）未呈阳性R26年在MNU中损坏Gfap-Cre公司视网膜。比例尺：20μm。n个= 3.
图2
图2。Wnt信号的激活促进杂种的增殖和存活。
(A类和B类)增殖百分比（PCNA+,A类)或凋亡（TUNEL+,B类)YFP公司+YFP总量的杂种+MNU中的混合动力受损Gfap-Cre公司未经治疗（HSPC）或生物治疗（BIO-HSPC）的HSPC移植后24小时的视网膜R26年. ***P（P）<0.0001，未成对学生t吨测试。(C类)FACS分选的DiD细胞周期基因的qPCR分析+YFP公司+未经处理或生物处理的HSPC移植后24小时收获的杂种26年在MNU中损坏Gfap-Cre公司视网膜。数据表示为对数的平均值±SD10DiD中基因表达的折叠变化+YFP公司+DiD的杂种+YFP公司+人群缺失视网膜。n个= 3. (D类)YFP合计+在MNU中检测到含有BrdU（红色条）的混合动力车（绿色条）受损Gfap-Cre公司未经治疗或生物治疗的HSPC移植后24小时、72小时和1周的视网膜R26年. **P（P）<0.001，双向方差分析和Bonferroni后验。红线和绿线表示绿色（YFP）或红色（BrdU）条的统计显著性。(电子–G公司)YFP的百分比+溴化铀+杂交后代对GS也呈阳性(电子，米勒细胞），OTX2(F类或恢复素(G公司、REC、成熟光感受器）在MNU受损中检测到Gfap-Cre公司未经治疗或生物治疗的HSPC移植后24小时、72小时和1周的视网膜R26年. (H（H）–J型)双YFP的代表性免疫染色+（绿色）/BrdU+（红色）杂种对GS（品红H（H），白色箭头），OTX2（洋红色输入我，黄色箭头），或恢复（洋红色J型，绿色箭头）MNU染色受损Gfap-Cre公司视网膜24小时(H（H）)，72小时(我)、和1周(J型)移植BIO处理的HSPC后。细胞核用DAPI（蓝色）复染。顶部的图像显示了更高的放大率和白色方块中的单通道区域。比例尺：20μm。(A类,B类、和D类–G公司)图表中的值表示为平均值±标准差(n个= 9).
图3
图3。Wnt信号的激活促进杂种的重编程。
(A类)DiD中多能性（蓝色条）、神经前体（红色条）、感光前体（黑色条）、成熟感光器（绿色条）和分化细胞（橙色条）标记的基因表达分析+YFP公司+混血儿。在移植未经治疗或经生物治疗的HSPC后24小时、72小时和1周，将杂种进行FACS分类R26年在MNU中损坏Gfap-Cre公司视网膜。数据表示对数平均值10与未经处理的DiD-HSPC融合获得的杂种相比，与生物处理的DiD-HSPC融合后获得的杂种中检测到的基因表达的倍数变化±SEM。n个= 3. (B类)融合后检测视网膜细胞脱分化的实验计划示意图。视网膜细胞与移植HSPC融合后nestin启动子的激活R26年导致Cre表达和YFP的形成+混血儿。(C类)YFP的代表性免疫染色+混合（绿色）和TUNEL+MNU损伤的nestin视网膜切片上的凋亡感光细胞（红色）-Cre公司未经治疗或生物治疗的HSPC移植后24小时的视网膜R26年用DAPI（蓝色）对细胞核进行复染。比例尺：20μm。
图4
图4。MG与Wnt激活的HSPC融合后重新编程产生新的感光细胞。
(A类和B类)YFP的代表性免疫染色+在MNU损伤中检测到的（绿色）杂交种也对GS（红色、白色箭头）或recoverin（红色、黄色箭头）免疫反应Gfap-Cre公司未经治疗的视网膜移植后1周(A类)或BIO处理(B类)热休克蛋白CR26年用DAPI（蓝色）对细胞核进行复染。n个= 3. (C类)对健康（WT）或MNU受损眼睛在接受PBS或未治疗（HSPCs）或生物处理HSPCs（BIO-HSPC）或单独使用BIO治疗1周后的ONL中感光细胞核行数进行统计分析。数据表示为平均值±SD，计算在每只小鼠注射部位的3个不同截面上。n个= 9. ***P（P）<0.0001，未成对学生t吨测试。(D类)BrdU阳性细胞（红色）的代表性免疫检测也对MNU受损的ONL中的感光标记物恢复蛋白（绿色）阳性Gfap-Cre公司生物处理HSPC移植后1周的视网膜R26年用DAPI（蓝色）对细胞核进行复染。插入表示白色方块中区域的放大倍数较高。(n个= 3). 比例尺：20μm。
图5
图5。光感受器再生第10行老鼠。
(A类和B类)YFP的代表性免疫染色+（绿色）带有GS（红色、白色箭头）或recoverin（红色和黄色箭头）第10行R26年BIO处理的视网膜移植后42天(A类)或未经处理(B类)热休克蛋白CVav-Cre公司.n个= 3. (C类)YFP总数+混合型（绿色条），其中包含检测到的BrdU（红色条）第10行26年未经治疗或生物治疗的HSPC移植后24小时（第19页）、72小时（第21页）和42天（第60页）Vav-Cre公司数据表示为平均值±标准差。n个= 9. **P（P）< 0.001; *P（P）<0.01，双向方差分析和Bonferroni后验。红色和绿色线显示了相应的绿色（YFP）和红色（BrdU）条之间的差异的统计显著性。(D类)双YFP百分比+溴化铀+移植未经处理（灰条）或经生物处理（黑条）的HSPC后42天（P60），杂交后代GS、OTX2或恢复染色也呈阳性Vav-Cre公司在里面第10行R26年视网膜。数据表示为平均值±SD。n个= 9. (电子)BrdU的代表性免疫检测+MNU损伤的ONL中感光标记物恢复素（绿色）阳性的细胞（红色）第10行R26年生物处理HSPC移植后42天的视网膜Vav-Cre公司用DAPI（蓝色）对细胞核进行复染。插入显示白色方框中区域的放大倍数较高。(F类)YFP的典型共焦图像+混合型（绿色）在ONL中对BrdU（红色）和recoverin（蓝色）也呈阳性第10行R26年生物处理HSPC移植后42天的视网膜Vav-Cre公司。底部的图像表示相同YFP的放大+混合（绿色）对恢复素（左侧为蓝色）和BrdU（右侧为红色）染色也呈阳性。n个= 3. 比例尺：20μm。
图6
图6。功能性抢救第10行BIO处理的HSPC移植的表型。
(A类)2个月大婴儿的代表性H&E染色第10行右眼视网膜移植BIO处理的HSPC或左眼视网膜移植PBS作为对照。比例尺：20μm。n个=8。(B类)从WT或WT采集的2个月龄小鼠视网膜ONL中检测到的最大核行数的统计分析第10行动物在P18用生物处理的HSPC移植或单独用载体（PBS）治疗作为对照。数据表示为平均值±SEM。n个= 8. ***P（P）<0.0001，未成对学生t吨测试。(C类)2个月大婴儿鼻、中央或颞部视网膜区域检测到的ONL核排数的统计分析第10行与左对照（PBS）眼相比，右视网膜移植生物治疗HSPC***P（P）<0.0001，未成对学生t吨测试。每个鼠标有九个连续部分(n个=8）进行了分析。21个视网膜中的8个视网膜计数显示核行增加，并绘制了图。(D类)2个月大的典型ERG反应第10行以右眼移植BIO-处理HSPC（BIO-HSPC）或左眼单独移植载体（PBS）的小鼠为对照。数据表示为平均值±SD(n个=8）21只接受生物治疗的HSPC移植后ONL厚度增加的小鼠中，有8只出现ERG反应的A波和B波振幅（μV）***P（P）<0.0001，未成对学生t吨测试。(电子)2个月龄WT或WT视网膜PDE6B蛋白水平的Western blotting第10行在P18用PBS治疗或用生物处理HSPC移植的小鼠。分析了三种不同的BIO-HSPC移植视网膜（1号、2号、3号）。
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