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.2016年7月；132(1):93-110.
doi:10.1007/s00401-016-1564-y。 Epub 2016年3月28日。

神经丝耗竭通过调节Stat3/stathmin信号改善微管动力学

普雷蒂·亚达夫 1, Bhuvaneish T Selvaraj公司 1 2, 弗洛里安·L·P·本德 1, 马库斯·贝林格 三, 梅赫里·莫拉迪 1, 拉杰夫·西瓦达桑 1, 本杰明·多姆伯特 1, 罗伯特·布仑姆 1, 埃丝特·阿桑 4, 马库斯·绍尔 三, 珍妮·皮埃尔·朱利安 5, 迈克尔·森特纳 6
附属公司

神经丝耗竭通过调节Stat3/stathmin信号改善微管动力学

普雷蒂·雅达夫等。 神经病理学学报. 2016年7月.

摘要

在神经元中，微管在轴突内形成密集的阵列，微管网络的稳定性和功能由神经丝调节。在几种形式的神经退行性疾病中观察到了神经丝的积聚，但到目前为止，神经丝水平升高如何破坏轴突的稳定机制尚不清楚。在这里，我们发现运动神经元疾病模型pmn突变小鼠运动神经中神经丝表达的增加会导致微管动力学紊乱。这种疾病是由微管蛋白特异性伴侣E（Tbce）基因的点突变引起的，导致C端氨基酸色氨酸大部分被交换为甘氨酸。因此，TBCE蛋白变得不稳定，从而导致轴突微管不稳定和轴突运输缺陷，尤其是运动神经元。神经丝的耗竭会增加pmn突变运动神经元中微管的数量和再生，并恢复轴突的伸长。这种效应是由神经丝与stathmin复合体的相互作用介导的。pmn突变体运动神经元轴突中与stathmin相关的神经丝积聚。Nefl基因敲除导致的神经丝耗竭增加Stat3-stathmin相互作用，并稳定pmn突变运动神经元中的微管。因此，对抗增强的神经丝表达可以改善轴突维持并延长pmn突变小鼠的生存期。我们认为，这种机制也可能与其他神经退行性疾病有关，其中神经丝的积累和微管的丢失是突出的特征。

关键词：轴突变性；微管；神经丝；状态3；Stathmin公司。

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数字

图1
图1
大鼠轴突中中间丝（IF）水平的分析pmn（可编程门阵列）突变小鼠运动神经元。一34日龄小鼠膈神经远端横截面的电子显微照片显示pmn（可编程门阵列）与野生型轴突相比，比例尺500纳米(顶部).底部车道显示了中相应图像的较高放大倍数顶层车道(比例尺200纳米）。箭头指向IF。b条电子显微镜显示培养7天的运动神经元轴突室。比例尺500纳米。c（c）IF数量的量化pmn（可编程门阵列）轴突近端增加(P（P）值=0.0304），中间(P（P）值=0.0249）和远端(P（P）值=0.0336）与野生型轴突相比的隔室（Mann–Whitney单尾试验，n个=16个野生型运动神经元和19个pmn（可编程门阵列）来自3个独立实验的运动神经元）。d日34日龄小鼠坐骨神经裂解物的Western blot分析。e（电子）,（f） Pmn（百万英镑）突变小鼠神经显示e（电子）美国橄榄球联盟(t吨 = 3.210,P（P）=0.0326）和（f）非金融控股公司(t吨 = 2.781,P（P）=0.0498）蛋白质。酒吧代表平均值±SEM(n个=5个野生型和pmn（可编程门阵列）和n个 = 3Nefl公司+/−;pmn（可编程门阵列）分析小鼠*P（P） < 0.05; 一个样品t吨测试）。克的表达水平Nefl公司28～30日龄大鼠坐骨神经提取物中的mRNApmn（可编程门阵列）与野生类型相比没有更改。通过将HPRT1作为看家基因进行标准化来进行量化。酒吧代表平均值±SEM(n个 = 3)
图2
图2
寿命和表型pmn（可编程门阵列）缺乏NFL的突变小鼠。一用于比较突变小鼠寿命的Kaplan–Meier曲线（对数秩检验；n个 = 22pmn（可编程门阵列）和n个 = 22Nefl公司−/−;pmn（可编程门阵列）小鼠和n个 = 27Nefl公司+/−;pmn（可编程门阵列）分析小鼠，P（P） = 0.0110,χ 2 = 6.460).b条同一窝29日龄小鼠的代表性图像。箭头展示这些老鼠的后肢。c（c）小鼠在出生后第21天和第27-29天称重，平均体重没有显著差异。d日在第21天测得的小鼠前肢握力峰值牛顿（N）没有显著差异，但在27–29天测得Nefl公司+/−;pmn（可编程门阵列）(P（P）<0.01；t吨=4.007）和Nefl公司−/−;pmn（可编程门阵列）(P（P） < 0.01;t吨=3.578）小鼠的握力比Nefl公司+/+;pmn（可编程门阵列）老鼠。e（电子）在加速旋转杆上，Nefl公司−/−;pmn（可编程门阵列）(P（P） < 0.05;t吨=2.735）和Nefl公司+/−；pmn（可编程门阵列）（P<0.001；t吨=5.206）相比于Nefl公司+/+;pmn（可编程门阵列）老鼠。c（c）–e（电子） 酒吧代表平均值±SEM（单向方差分析和Bonferroni的事后检验，n个=每个基因型6只小鼠*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01, ***P（P） < 0.001).酒吧显示出生后第21天、第27天、第28天和第29天的测试平均值
图3
图3
NFL耗竭增加微管密度和轴突长度pmn（可编程门阵列）突变体运动神经元。一34日龄小鼠膈神经远端横截面的电子显微照片(顶部),比例尺500纳米。底部车道显示了在顶层车道,比例尺200纳米。箭头指向MT。b条每轴突的MT数pmn（可编程门阵列）(P（P） < 0.05;t吨=3.640）减少，而Nefl公司−/−;项目经理老鼠(P（P） > 0.05;t吨=2.701）显示MT数量与野生型小鼠相当。c（c）每轴突的MT密度Nefl公司−/− (P（P） < 0.001;t吨=10.05）和Nefl公司−/−;pmn（可编程门阵列）(P（P） < 0.001;t吨=9.649）小鼠与野生型轴突相比增加。d日横截面积Nefl公司−/− (P（P） < 0.05;t吨=3.416）和Nefl公司−/−;pmn（可编程门阵列）(P（P） < 0.01;t吨=4.488）与野生型相比减少pmn（可编程门阵列）轴突(n个 = 3pmn（可编程门阵列）和Nefl公司−/−小鼠和n个=4个野生型和Nefl公司−/−;pmn（可编程门阵列）小鼠分析）。e（电子）体外培养7天的运动神经元的代表性图像。比例尺100µm。（f） Pmn（百万英镑）运动神经元轴突长度缩短(P（P） < 0.01;t吨 = 6.845).Nefl公司−/−；pmn（可编程门阵列）运动神经元的生长明显长于pmn（可编程门阵列）运动神经元(P（P） < 0.01;t吨 = 5.830) (n个＝3个独立实验）。数字在中酒吧表示所分析的运动神经元总数。酒吧代表平均值±SEM（单向方差分析和Bonferroni的事后检验*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01, ***P（P） < 0.001).克 条形图体外培养7天后，运动神经元存活率无变化。小时电子显微照片显示野生型轴突和Nefl公司−/−运动神经元体外培养7天。我 条形图野生型胚胎运动神经元轴突直径的定量分析(n个=7）和Nefl公司−/− (n个=9）小鼠，在体外7天后宽度没有变化。对每个运动神经元的近端、中间和远端轴突的2–3个截面进行分析，图中显示了三个分区的所有截面的平均值
图4
图4
NFL耗竭促进微管再生pmn（可编程门阵列）体外突变运动神经元。一运动神经元的代表性图像显示，诺卡唑治疗后，微管解聚，并且诺卡唑洗脱5分钟后微管再生。微管（MT）用α-微管蛋白标记(绿色)γ-微管蛋白和中心体(红色).酒吧2微米。b条使用1µm同心圆步长计算MT数量的Sholl分析代表性图像。c（c）–（f）MT交叉口数量(年轴）增加距离(x轴）从微管组织中心（MTOC）计数。直线图显示平均值±SEM（双向ANOVA与Bonferroni的事后检验，n个=4个独立实验**P（P） < 0.01, ***P（P） < 0.001).克绘制了每个MTOC的平均MT长度。小时绘制了每个MTOC重新生成的MT的总长度。酒吧代表平均值±SEM
图5
图5
Nefl公司删除增加Stat3–stathmin交互。一Stathmin是从34天龄小鼠的坐骨神经提取物中免疫沉淀的。Western blot显示来自左边右侧，输入（Ip）并从野生型和Nefl公司−/−抗IgG控制和抗tathmin下拉后的小鼠神经提取物。b条定量洗脱液中的谱带强度表明，Stat3和stathmin在Nefl公司−/−小鼠(t吨 = 17.08;P（P） = 0.0034).酒吧代表平均值±SEM（一个样本t吨测试，n个=3个独立实验）。c（c） Nefl公司缺失增加坐骨神经中Stat3–stathmin的相互作用pmn（可编程门阵列）突变小鼠。d日Western印迹分析显示34天龄的野生型坐骨神经提取物中stathmin的水平相似，pmn（可编程门阵列）和Nefl公司−/−小鼠。测定组蛋白水平，以确保蛋白质负载量相等。e（电子）34天龄野生型和非野生型坐骨神经提取物（免疫沉淀前输入）中Stat3/stathmin水平的量化Nefl公司−/−小鼠(n个=3个独立实验）。（f）Stathmin从NSC-34细胞提取物中免疫沉淀。蛋白质印迹显示IgG、模拟和NFL过表达NSC-34细胞从左到右的输入。赖特印迹显示，分别用模拟（仅脂质体）或NFL过表达载体转染NSC-34细胞后，在IgG对照下拉和stathmin下拉后洗脱。克Western blot分析显示34日龄大鼠坐骨神经提取物中磷酸化Stat3（Y705）水平增加pmn（可编程门阵列）和Nefl公司−/−与野生型小鼠相比。根据总Stat3水平对pStat3进行量化小时 项目经理小鼠与野生型的比较(t吨 = 4.928;P（P） = 0.0044;n个=6个独立实验）和我在里面Nefl公司−/−小鼠与野生型小鼠的比较(t吨 = 2.865;P（P） = 0.0242;n个=8个独立实验）。酒吧代表平均值±SEM
图6
图6
去NFL运动神经元中酪氨酸化和乙酰化微管蛋白的水平一运动神经元的典型图像显示乙酰化微管增加Nefl公司−/−体外培养3天后的运动神经元。神经元被酪氨酸化α-微管蛋白抗体染色(绿色)、stathmin(蓝色)和乙酰化α-微管蛋白(红色).比例尺20微米(第一和第三车道).白色方形框指示中放大的区域第二和第四车道,比例尺2微米。b条荧光强度定量显示乙酰化微管增加Nefl公司−/− (t吨=3.011）与野生型运动神经元相比，而酪氨酸化微管保持不变。stathmin的强度用作控制。酒吧代表平均值±SEM（单因素方差分析，n个=来自三个独立实验的10个运动神经元*P（P） < 0.05, ***P（P） < 0.001)
图7
图7
Stat3和stathmin在野生型和非野生型轴突中的分布Nefl公司−/−高分辨率SIM显示的运动神经元。运动神经元在体外培养3天。野生型和Nefl公司−/−运动神经元，用酪氨酸化α-微管蛋白抗体染色(绿色)，状态3(红色)和stathmin(蓝色). 抗酪氨酸化α-微管蛋白抗体可染色可溶性α-β-微管蛋白质异二聚体和聚合的高动态微管。注意，stathmin与Stat3的共定位增加Nefl公司−/−运动神经元(右侧面板).比例尺20微米(第一和第三车道).白色方形框表示第二个区域放大第四车道,比例尺2微米
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