跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https公司

网站是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2016年6月9日；35(23):3004-15.
doi:10.1038/onc.2015.363。 Epub 2015年10月5日。

PAT4水平控制高尔基体雷帕霉素耐药mTORC1的氨基酸敏感性并影响结直肠癌的临床结局

S-J风机 1, C斯奈尔 2, H特雷 2, J-L李 2, R麦考密克 2, S M W佩雷拉 1, S海伯林 1, S卡齐 1, 阿扎德 1, C威尔逊 1, A L哈里斯 2, D C I戈伯丹 1
附属公司

PAT4水平控制来自高尔基体的雷帕霉素抗性mTORC1的氨基酸敏感性，并影响结直肠癌的临床结果

S-J风机等。 癌基因. .

摘要

肿瘤细胞可以使用一些策略，使其能够抵抗营养剥夺，从而战胜邻居。雷帕霉素复合物1（mTORC1）的氨基酸依赖性机制靶点是细胞对饥饿和其他应激反应的关键集合体。溶质连接载体36（SLC36）和SLC38家族中的氨基酸转运蛋白促进了mTORC1在晚期内体和溶酶体上的激活。在这里，我们分析了SLC36家族成员SLC36A4（也称为质子辅助氨基酸转运蛋白4（PAT4））在结直肠癌中的功能。我们的研究表明，独立于其他主要病理因素，PAT4的高表达与结直肠癌手术后无复发生存率降低相关。与此一致，PAT4促进HCT116人结直肠癌细胞在培养中的增殖和异种移植模型中的肿瘤生长。在HCT116细胞中的诱导敲除表明，PAT4调节一种具有两个不同性质的mTORC1：首先，它优先靶向真核翻译起始因子4E结合蛋白1（4E-BP1），其次，它对雷帕霉素处理具有耐药性。此外，在HCT116细胞中，两种非必需氨基酸谷氨酰胺和丝氨酸通常被肿瘤细胞迅速代谢，以PAT4依赖的方式调节雷帕霉素耐药mTORC1。过度表达的PAT4也能促进人类胚胎肾293细胞对雷帕霉素的耐药性。PAT4在一系列细胞类型中主要与高尔基体有关，原位近接连接分析表明，PAT4与高尔基上的mTORC1及其调节因子Rab1A相互作用。这些发现以及其他研究表明，差异定位的细胞内氨基酸转运蛋白有助于激活mTORC1的替代形式。此外，我们的数据预测，PAT4高表达的结直肠癌细胞对丝氨酸和谷氨酰胺的耗竭具有更强的抵抗力，使其能够存活并生长出邻近的正常细胞和致瘤细胞，并可能为药物干预提供新的途径。

PubMed免责声明

数字

图1
图1
验证“内部”生成的抗PAT4单克隆抗体。(一和b条)用PAT4单克隆抗体（PAT4/9/H10）培养福尔马林固定、石蜡包埋的786-O细胞，并用3,3'-二氨基联苯胺（DAB）进行可视化。在用干扰控制siRNA处理的大多数细胞中，可见明显的核周染色区(一). 当第四阶段使用siRNA敲除转录本第四阶段（si435；海伯林等。;b条). (c（c）)细胞裂解物系列稀释液的Western blot分析（15、7.5和3.8 μg蛋白质），由携带IPTG诱导的shPAT4（43587；shPAT5）的786-O细胞池产生，用PAT4单克隆抗体Pat/9/H10进行检测。这显示了一组从60到75的波段 IPTG诱导的kDa强烈降低第四阶段击倒（+IPTG），表明它们是PAT4特有的。Western blot也用抗微管蛋白抗体作为负荷对照进行了检测。(d日)对786-O细胞和GFP-PAT4过度表达的HEK-293细胞系的细胞裂解产物进行Western blot，在电泳前用PNGase F处理以去除糖基。这将未经处理的细胞裂解物中的交叉反应分子分解成更为特异的条带，在约30和50时迁移 kDa分别小于预测分子量55 kDa（PAT4）和85 kDa（GFP-PAT4），其他跨膜蛋白也有报道。
图2
图2
PAT4的高表达预示着结肠癌的无复发生存率较差。共有107例原发性结肠癌患者接受了PAT4在肿瘤中的表达评估，并根据PAT4的表达进行了分层。(一和b条)通过免疫组织化学测定的低和高PAT4表达水平的代表性图像。用二氨基联苯胺进行棕色染色表明具有免疫反应性。(c（c）)Kaplan–Meier曲线比较高表达水平与低表达水平。P（P）-值是log-rank测试的结果（Mantel–Cox）。(d日)高表达和低表达PAT4患者的病例处理总结。中的比例尺(一)是50 微米。
图3
图3
PAT4调节HCT116细胞的生长在体外和体内. (一)用靶向PAT4的两种独立IPTG诱导的shRNA结构之一，即shPAT4（4.8）和shPAT5（7.1），或IPTG引导的非靶向对照结构（shNT），在有无IPTG的情况下，对稳定转导的HCT116细胞克隆的增殖进行了测量(n个=3). (b条和c（c）)携带shNT转导细胞池的免疫缺陷小鼠中人类HCT116肿瘤异种移植物的平均生长曲线（±s.e.m.）(b条)有（空白圆圈）或无（填充正方形）IPTG诱导，或shPAT4-转导的HCT116细胞(c（c）)有（空白方块，用红色勾勒）或无（填充方块）IPTG感应(n个=7). 中的数据(b条和c（c）)由未配对的双尾独立学生t吨-测试。(d日和e（电子）)七只动物在IPTG诱导和不诱导shNT-的情况下的Kaplan-Meier生存曲线(d日)和shPAT4-包含(e（电子）)HCT116肿瘤；log-rank（Mantel–Cox）测试：P（P）=0.019适用于(e（电子）). 对于shPAT4诱导的细胞，七只非诱导小鼠（填充方块）中除一只外，其余均需在36天内被杀死（中位数生存时间为36天），而七只诱导小鼠（空白方块，用红色勾勒）则从38天开始被杀，中位数存活时间为50天。细胞增殖实验重复三次*P（P）<0.05, **P（P）<0.01.
图4
图4
PAT4选择性地影响mTORC1靶点4E-BP1。携带IPTG诱导shNT或shPAT4的HCT116细胞蛋白质提取物的蛋白质印迹（4.8）(一和c（c）)或shNT和shPAT4（7.1）构造(b条和d日)在有无IPTG的情况下培养。(一和b条)第四阶段敲除降低电泳前细胞裂解物与PNGase F孵育后检测到的PAT4蛋白水平。(c（c）–（f）)第四阶段敲除显著降低了4E-BP1最磷酸化γ形式的水平，通过抗磷酸化Ser65-4E-BP1（p-S65-4E-BPl）抗体和pan-4E-BPl抗体的上带可见（箭头所示；在三个独立实验中量化为直方图中4E-BPI总染色的比例(e（电子）)和(（f）)）。磷酸-S6K（p-T389-S6K1）、磷酸-S6（p-S240/244-S6）、磷酸Akt（p-S473-Akt）和磷酸ERK（p-T202/Y204-ERK）水平基本上不受第4部分击倒。用抗微管蛋白抗体检测印迹作为负荷控制。在三个单独的实验中重现了这些效果*P（P）<0.05**P（P）<0.01.
图5
图5
PAT4调节HCT116细胞中抗雷帕霉素的mTORC1形式，并增加HEK-293细胞中的雷帕霉素抗性。(一和b条)携带IPTG诱导物的HCT116细胞克隆第四阶段shRNA结构shPAT4（4.8）和IPTG诱导的非靶向对照结构shNT在无IPTG或有IPTG的情况下培养5天，如果需要，在最后24天用雷帕霉素处理 h.雷帕霉素（3 n个M（M）; 参见补充图S2A和B）强烈降低磷酸化-S6水平（p-S240/244-S6），并部分影响Ser65-磷酸化4E-BP1（p-S65-4E-BPl）γ带（箭头）。这种抗雷帕霉素的磷酸化-4E-BP1γ带在第四阶段击倒(b条). (c（c）)shPAT4（4.8）细胞和shNT对照细胞在没有或存在IPTG的情况下培养8天，并用雷帕霉素处理3天。然后对细胞进行计数，发现雷帕霉素存在时两种细胞系的增殖都降低，IPTG存在时shPAT4（4.8）的增殖也降低(n个=3). 雷帕霉素和IPTG的结合导致shPAT4的细胞数量进一步减少（4.8）。(d日和e（电子）)将正常HEK-293细胞或稳定转染组分表达的GFP-PAT4构建物的细胞培养24小时 有无100时为h n个M（M）雷帕霉素（见图S2F），然后通过西方分析分析细胞裂解物。GFP-PAT4表达减少雷帕霉素对γ-磷酸化4E-BP1带的影响(e（电子）)，但不包括磷-S6（p-S240/244-S6）、磷-Akt（p-S473-Akt）或磷-ERK（p-T202/Y204-ERK）。用抗微管蛋白抗体检测所有印迹，作为负荷对照。(*P（P）<0.05;n个=3). 细胞增殖实验重复三次。NS，不显著。
图6
图6
谷氨酰胺和丝氨酸选择性调节HCT116细胞中依赖于PAT4的雷帕霉素耐药mTORC1信号。(一)HCT116细胞缺乏必需氨基酸、甘氨酸（Gly）、异亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、苏氨酸（Thr）和色氨酸（Trp）以及非必需氨基酸丝氨酸（Ser）和谷氨酰胺（Gln）4 然后提取蛋白质并进行western印迹。在此之后，谷氨酰胺消耗使4E-BP1的γ-磷酸化减少最多（箭头所示）；丝氨酸耗竭也会导致更温和的转变。(b条)携带IPTG诱导物的HCT116细胞克隆第四阶段将shRNA构建体shPAT4（4.8）和IPTG诱导的非靶向对照构建体shNT暴露于含有不同浓度谷氨酰胺的培养基中4 h，在不存在IPTG的情况下。在这些条件下，shPAT4（4.8）细胞表达约50%的正常第四阶段由于渗漏导致的信使核糖核酸水平（补充图S1B）第四阶段shRNA转录。随着谷氨酰胺浓度下降，shPAT4（4.8）细胞中4E-BP1的γ-磷酸化明显降低。S6磷酸化似乎也受到低谷氨酰胺浓度的影响。(c（c）)与相同的实验(b条)除培养基中丝氨酸含量不同外。同样，shPAT4（4.8）细胞在丝氨酸浓度降低时具有较低的4E-BP1γ-磷酸化。(d日和e（电子）)雷帕霉素处理的HCT116细胞受到不同水平谷氨酰胺的影响(d日)和丝氨酸饥饿(e（电子）)，超过4 h、 显示4E-BP1的γ-磷酸化有较大降低。
图7
图7
PAT4和mTOR位于HCT116细胞的高尔基体上。(一)内源性PAT4（绿色）在包括反式-HCT116细胞中的高尔基网络（TGN46；红色）。(b条)虽然大多数mTOR（绿色）位于HCT116细胞中LAMP2阳性的晚期内体和溶酶体（蓝色）上，但一些mTOR染色也与反式-高尔基网络（红色；由合并图像中的箭头指示）。DAPI（4'，6-二氨基-2-苯基吲哚）标记(一)（蓝色）和(b条)（白色）。比例尺为5 微米。合并图像中的共焦通道显示如下：绿色（G）、蓝色（B）和红色（R）。
图8
图8
PAT4与高尔基体上的Rab1A和mTORC1相互作用。(一)HEK-293细胞中的GFP-PAT4融合蛋白（绿色）显示出与HCT116细胞相似的亚细胞定位反式-高尔基（TGN46；红色）。另一个分辨率更高的细胞用相同的标记物染色(d日). (b条)Rab1A（蓝色）主要位于顺式-高尔基，用GM130标记（红色）标记。(c（c）)现场PLA（红色）显示了Rab1A（蓝色）和GFP-PAT4（绿色）之间的相互作用，主要与包含GFP-PAT_4的隔间有关（GFP-PAT3和PLA信号之间的重叠在合并中为黄色，右上角面板；箭头）。PLA信号也与Rab1A集中在Rab1A和PLA合并处的隔间相邻并部分重叠，右下角。Rab1A/PAT4-PLA信号仅在GFP-PAT4-expressing细胞中观察到（参见补充图S5B）。(d日)一些GFP-PAT4/Rab1a PLA阳性相互作用隔间（红色）似乎也部分或全部被标记为反式-高尔基网络标记TGN46（蓝色；箭头），但不是反式-缺乏GFP-PAT4的高尔基体区域。(e（电子）)PLA（红色）显示了mTOR（蓝色）和GFP-PAT4（绿色）之间的相互作用，部分与包含GFP-PAT_4的隔间重叠（黄色表示包含绿色和红色通道的合并，包括右上面板中的放大图像；箭头）。在低倍合并图像中，不表达GFP-PAT4的两个上部细胞没有发出PLA信号，表明该分析专门检测GFP-PAT_4/mTOR相互作用。蓝色和红色通道合并（右下方面板）显示，mTOR染色通常与PLA信号非常接近，但也在细胞内的许多其他位置发现。(（f）)PLA（红色）显示了Raptor和GFP-PAT4（绿色）之间的交互作用（红色），位于包含GFP-PAT3的隔间内和相邻隔间内（包含绿色和红色通道的合并中的黄色重叠，包括右上面板中的放大图像；箭头和箭头）。蓝色和红色通道合并（右下面板）显示，一些PLA信号与反式-高尔基（TGN，蓝色；箭头），而其他人没有（箭头）。Raptor/GFP-PAT4 PLA信号仅在表达GFP-PAT4的细胞中观察到（参见补充图S5C）。DAPI标记细胞核(一)（蓝色）和(b条–（f）)（白色）。共焦通道在合并图像中显示如下：绿色（G）、蓝色（B）和红色（R）。比例尺为5 微米。
图9
图9
HCT116细胞中雷帕霉素敏感和耐药mTORC1复合物的示意图。S6K和4E-BP1是真核生物起始因子4E（eIF4E）的负调控因子，是mTORC1最具特征的下游靶点。尽管雷帕霉素治疗强烈抑制S6K磷酸化，但它对Ser65处4E-BP1γ带磷酸化的影响较弱。较少磷酸化形式的4E-BP1与eIF4E结合，导致翻译抑制。降低PAT4活性主要影响抗雷帕霉素的mTORC1形式。这导致4E-BP1的Ser65磷酸化形式减少，但对S6K磷酸化的影响较小。SLC36（PAT）和/或SLC38家族中的其他AAT可能参与雷帕霉素敏感性mTORC1调节，例如PAT1和SLC38A9。PP242是一种mTORC1-ATP-激酶抑制剂，作用于雷帕霉素敏感型和耐药型的mTORC1。箭头表示正信号，横线表示抑制信号事件。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

查看所有类似文章

引用人

  • RIP3/MLKL通过激活4EBP1-eIF4E通路调节坏死性下垂。
    王S、徐明。 王S等。 中南大学医学报一学版。2023年7月28日；48(7):979-985. doi:10.11817/j.issn.1672-7347.2023.230153。 中南大学医学报一学版。2023 PMID：37724400 免费PMC文章。 中文、英文。
  • 副ESCRT-III蛋白是Rab11a-exosome形成的保守和选择性调节因子。
    Marie PP、Fan SJ、Mason J、Wells A、Mendes CC、Wainwright SM、Scott S、Fischer R、Harris AL、Wilson C、Goberdhan DCI。 Marie PP等人。 《细胞外囊泡》。2023年3月；12（3）：e12311。doi:10.1002/jev2.12311。 《细胞外囊泡》。2023 PMID：36872252 免费PMC文章。
  • Arf5介导的mTORC1在质膜上的调节。
    Makhoul C、Houghton FJ、Hinde E、Gleeson PA。 Makhoul C等人。 摩尔生物细胞。2023年4月1日；34（4）：第23章。doi:10.1091/mbc。E22-07-0302。Epub 2023年2月3日。 分子生物学细胞。2023 PMID：36735494 免费PMC文章。
  • mTORC1通过SCYL1磷酸化控制高尔基体结构和囊泡分泌。
    Kaeser-Pebernard S、Vionnet C、Mari M、Sankar DS、Hu Z、Roubaty C、Martínez-Martínez E、Zhao H、Spuch-Calvar M、Petri-Fink A、Rainer G、Steinberg F、Reggiori F、Dengjel J。 Kaeser-Pebernard S等人。 国家公社。2022年8月10日；13(1):4685. doi:10.1038/s41467-022-32487-7。 国家公社。2022 PMID：35948564 免费PMC文章。
  • 肠道微生物如何培养肠道干细胞：A果蝇属观点。
    Neophytou C，Pitsouli C。 Neophytou C等人。 代谢物。2022年2月10日；12(2):169. doi:10.3390/metabo12020169。 代谢物。2022 PMID：35208243 免费PMC文章。 审查。
查看所有“被引用”文章

参考文献

    1. Schulze A，Harris AL.癌症代谢是如何调节增殖和易受破坏的。自然2012；491: 364–373.-公共医学
    1. Bar-Peled L，Sabatini DM。氨基酸对mTORC1的调节。《趋势细胞生物学》2014；24: 400–406.-项目管理委员会-公共医学
    1. Malik AR、Urbanska M、Macias M、Skalecka A、Jaworski J。蛋白质翻译失控：关于雷帕霉素（mTOR）哺乳动物靶点的非规范调节和功能，我们学到了什么。2012年生物化学与生物物理学学报；1834: 1434–1448.-公共医学
    1. Jewell JL，Guan KL。mTOR和细胞生长的营养信号。生物化学科学趋势2013；38: 233–242.-项目管理委员会-公共医学
    1. Zaytseva YY、Valentino JD、Gulhati P、Evers BM.mTOR抑制剂在癌症治疗中的应用。2012年癌症快报；319: 1–7.-公共医学

MeSH术语