Disruption in the autophagic process underlies the sensory neuropathy in dystonia musculorum mice

doi:10.1080/15548627.2015.1052207

.2015;11(7):1025-36.

doi:10.1080/15548627.2015.1052207。

肌张力障碍小鼠感觉神经病变的自噬过程中断

安德鲁·费里尔¹, Yves重复, 阿尼莎·林奇·戈德雷, 萨布丽娜·吉博, 瓦拉开斋节, 丹尼尔·郭, 查晓慧, 拉什米·科塔里

附属公司

PMID： 26043942
预防性维修识别码：项目经理4590603
内政部： 10.1080/15548627.2015.1052207

肌张力障碍小鼠感觉神经病变的自噬过程中断

安德鲁·费里尔等。自噬. 2015.

.2015;11(7):1025-36.

doi:10.1080/15548627.2015.1052207。

作者

安德鲁·费里尔¹, Yves重复, 阿尼莎·林奇·戈德雷, 萨布丽娜·吉博特, 瓦拉开斋节, 丹尼尔·郭, 查晓慧, 拉什米·科塔里

附属

¹渥太华医院研究所；加拿大安大略省渥太华市。

PMID： 26043942
预防性维修识别码：项目经理4590603
内政部： 10.1080/15548627.2015.1052207

摘要

DST（肌营养不良）基因的纯合子突变会导致一种新发现的致命形式的人类遗传性感觉和自主神经病变（HSAN-VI）。DST功能丧失同样会导致肌张力障碍（DST（dt））小鼠的感觉神经元变性和严重共济失调。DST参与维持细胞骨架完整性和细胞内转运。由于自噬高度依赖于稳定的微管和运动蛋白，我们使用DST（dt-Tg4）小鼠模型评估了DST功能丧失对自噬的影响。电子显微镜（EM）显示，这些小鼠的感觉神经元中有自噬体堆积。此外，我们证明自噬通量受损。自噬体标记物LC3-II水平升高。因此，Dst（dt-Tg4）感觉神经元显示自噬体底物SQTSM1/p62和多泛素化蛋白的蛋白质周转受损。有趣的是，在先前描述的Dst（dt-Tg4）小鼠模型中，与Dst（dt-Tg4。在获救的小鼠中，LC3-II、SQTSM1、多泛素化蛋白和自噬流量也恢复到野生型水平。最后，Dst（dt-Tg4）背根神经节和感觉神经元中的DNAIC1（动力蛋白、轴突、中间链1；人类DNAI1的小鼠直系同源物）显著减少，DNAIC1是动力蛋白/动力蛋白运动复合体（DMC）的成员。因此，DST-A2功能丧失扰乱了自噬的晚期阶段，而自噬功能障碍至少部分是DST（dt）发病机制的基础。因此，我们得出结论，DST-A2亚型通常促进感觉神经元内的自噬，以维持细胞内稳态。

关键词：方差分析；BPAG1；CASP3、caspase 3、凋亡相关半胱氨酸肽酶；DMC；DMC，动力蛋白/动力蛋白运动复合物；DMEM，Dulbecco改良的Eagle介质；DNAIC1，动力蛋白，轴突，中间链1；DRG，背根神经节；DST，抗肌张力障碍素；肌张力障碍；电镜、电子显微镜；胎牛血清；HSAN-VI；HSAN-VI，遗传性感觉和自主神经病变VI型；微管肌动蛋白交联因子1；MAP1B；微管相关蛋白1B；MAP1LC3/LC3，微管相关蛋白1轻链3；MT，微管；P、产后日；PBS、磷酸盐缓冲盐水；聚合酶链反应；朊蛋白；逆转录聚合酶链反应；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳；SQTSM1/p62，固位体1；三氯乙酸；TUBB3，微管蛋白，β，3 III类；野生型；自噬体；动力蛋白；抗肌张力素；微管；贩卖人口。

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数字

**图1。**
症状和症状前的感觉神经元*国防科技部*^{dt-Tg4号机组}小鼠LC3-II蛋白水平增加。(A类)来自P17 WT的DRG蛋白裂解物和症状日期^{dt-Tg4号机组}通过western blot分析小鼠LC3-II蛋白水平。在P17中观察到LC3-II的显著诱导日期^{dt-Tg4号机组}DRG。LC3-I代表可溶性形式，LC3-II代表脂质化和膜结合形式的LC3（一种关键的自噬标记物）。每条通道代表从单个小鼠中采集的20μg DRG蛋白。(B类)LC3-II的诱导在症状前（P10）的DRG中也很明显日期^{数字电视-电视4}老鼠。(C类)通过（A）中斑点的密度测定进行量化。LC3-II水平归一化为总肌动蛋白水平。学生t吨测试；以SEM表示的误差条(**P（P）*< 0.05).

**图2。**
P5 WT和P5 WT-的感觉神经元的超微结构分析日期^{dt-Tg4号机组}老鼠。(**A、 A’**)培养5d的WT感觉神经元未显示任何自噬体、自溶体和受损的线粒体(**B、 B’**)线粒体受损（星号）和双膜自噬体积聚（箭头）在日期^{dt-Tg4号机组}感觉神经元。(**C、 C’**)单膜自溶体空泡与电子密度隔离材料（箭头）也存在于日期^{dt-Tg4号机组}感觉神经元。A、B和C（20000X，比例尺：500 nm）以及A'、B'和C'（60000X，比例尺：500 nm）的放大倍率和比例尺。

**图3。**
来自日期^{dt-Tg4号机组}老鼠。**（A）**)来自WT或日期^{dt-Tg4号机组}将小鼠培养7天，并对TUB3进行抗原标记。这两种基因型都表现出广泛的神经突起分支和活力（比例尺：20μm）。(B类)*Dst-A1型*和*图纸-A2*通过RT-PCR评估，转录物存在于WT皮层神经元中。(**C和D**)WT（C）和日期^{dt-Tg4号机组}（D）皮层神经元表现出相似的自噬通量（n=2）。如有指示，用自噬诱导剂（500 nM雷帕霉素）或自噬阻断剂（30μM氯喹）处理神经元2小时。每条通道代表一只老鼠的皮层神经元裂解物。裂解培养物，用SDS-PAGE分离总蛋白（10μg/条），用抗LC3B抗体进行抗原标记识别内源性LC3。Actin充当加载控件。(**E和F**)WT（E）和日期^{dt-Tg4号机组}（F）小鼠用抗LC3B染色（比例尺：10μm）。箭头和箭头分别代表神经元胞体或轴突内的LC3-II点。(**G公司**)每个WT的LC3-II穿孔平均数（34.39±2.442）和日期^{dt-Tg4号机组}（34.45±5.774）胞体无显著差异（Studentt吨测试，*P（P）*= 0.99; n=3，每n分析40个细胞）。(**H（H）**)每μm长度轴突LC3-II点的平均数量在WT（0.3114±0.02426）和*国防科技部*^{dt-Tg4号机组}（0.2955±0.01625）个神经元（学生t吨测试，*P（P）*= 0.71; n=3，每n分析40个细胞）。

**图4。**
来源于日期^{数字电视-电视4}老鼠。(**A和B**)来自WT（A）或日期^{dt-Tg4号机组}(B类)将小鼠培养5天，并对TUB3和CASP3进行抗原标记。这两种基因型都表现出广泛的神经突起分支，并且没有CASP3阳性神经元（比例尺：20μm）。(**C和D**)重量(C类)以及日期^{dt-Tg4号机组}(天)显示不同的自噬通量曲线（n=2）。如有指示，用自噬诱导剂（500 nM雷帕霉素）或自噬阻断剂（30μM氯喹）处理神经元2小时。请注意，在日期^{dt-Tg4号机组}感觉神经元流量测定。每条通道代表一只老鼠的感官裂解物。裂解培养物，用SDS-PAGE分离总蛋白（10μg/条），用抗LC3B抗体进行抗原标记识别LC3-I和LC3-II。Actin充当加载控件。

**图5。**
外源性DST-A2在小鼠感觉神经元中的表达*计划/日期*^{dt-Tg4号机组}小鼠可改善自噬缺陷。(A类)TUBB3和CASP3的抗原标记表明症状前（P5）*计划/日期*^{dt-Tg4号机组}感觉神经元成熟，形成广泛的神经突起，不发生凋亡（比例尺：50μm）。(B类)P5自噬通量*计划/日期*^{dt-Tg4号机组}感觉神经元正常工作。P5 WT的典型EM显微照片(C类),*计划/日期*^{数字电视-电视4}(天)、和日期^{dt-Tg4号机组}(E类)感觉神经元。WT和*PrP/Dst公司*^{dt-Tg4号机组}显微照片上没有积累的自噬体、单膜自溶体和受损的线粒体。日期^{dt-Tg4号机组}另一方面，感觉神经元充满了双膜自噬体（箭头）。（放大20000X，比例尺：500 nm）。

**图6。**
症状前的感觉神经元（P5）*计划/日期*^{dt-Tg4号机组}老鼠，但不是来自日期^{dt-Tg4号机组}小鼠，有效降解自噬体底物SQTSM1和泛素化蛋白。(A类)营业额[¹⁴C] 在完全培养基中培养的细胞中测量L-缬氨酸标记的长寿命蛋白质。实验在存在或不存在30μM氯喹的情况下进行。数据表示为4小时内降解的细胞蛋白百分比。WT（n=6）和日期^{dt-Tg4号机组}(*P（P）*<0.05），以及日期^{dt-Tg4号机组}（n=5）和*计划/日期*^{dt-Tg4号机组}（n=6）(*P（P）*< 0.05). 报告值为平均值±SD(B类)P5重量，日期^{数字电视-电视4}、和*计划/日期*^{dt-Tg4号机组}通过western blot分析感觉神经元裂解物的SQTSM1和LC3-II蛋白水平。日期^{dt-Tg4号机组}与WT相比，感觉神经元显示LC3-II蛋白水平显著增加(*P（P）*<0.01，n=3）和*计划/日期*^{dt-Tg4号机组}感觉神经元(*P（P）*<0.05，n=3）。日期^{dt-Tg4号机组}与WT和*计划/日期*^{dt-Tg4号机组}感觉神经元(*P（P）*<0.05，n=3）。WT和*计划/日期*^{dt-Tg4号机组}感觉神经元。通过密度计进行定量，并标准化为肌动蛋白标准；方差分析，事后邓内特t吨测试；误差条表示为SEM(C类)定性western blot分析表明P5中多泛素化蛋白在200-50 kDa之间增加日期^{dt-Tg4号机组}感觉神经元。

**图7。**
外源性DST-A2在小鼠感觉神经元中的表达*计划/日期*^{dt-Tg4号机组}小鼠部分恢复DNAIC1水平。DST功能丧失对DMC有细胞特异性影响。**（A）**)WT和WT的免疫印迹分析日期^{dt-Tg4号机组}P15脑（皮层）裂解物表明DNAIC1蛋白水平没有显著变化(*P（P）*>0.05，n=3）。(B类)第15页日期^{dt-Tg4号机组}DRG裂解物显示DNAIC1蛋白水平显著下降(*P（P）*<0.05，n=3），与P15 WT DRG相比。学生t吨测试，误差条表示SEM(**P（P）*< 0.05). 图表表示按照肌动蛋白标准进行标准化的膜密度分析。(C类)WT感觉神经元DNAIC1的P5荧光免疫印迹分析，日期^{dt-Tg4号机组}、和*计划/日期*^{dt-Tg4号机组}老鼠。WT和日期^{dt-Tg4号机组}(*P（P）*<0.05），但不在*PrP/Dst公司*^{dt-Tg4号机组}和WT(*P（P）*>0.05），以及*计划/日期*^{dt-Tg4号机组}和日期^{dt-Tg4号机组}(*P（P）*> 0.05; n＝3）。这表明当DST-A2恢复时，DNAIC1水平出现部分救援。印迹定量(C类)使用奥德赛成像系统，并归一化为α-微管蛋白标准。方差分析，事后Dunnettt吨测试；以SEM表示的误差条(**P（P）*< 0.05).

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