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。2013年8月27日；110(35):14272-7.
doi:10.1073/pnas.131203310。 Epub 2013年7月15日。

脱氧核苷酸三磷酸水解酶SAMHD1是哺乳动物细胞DNA前体库的主要调节因子

伊丽莎·弗兰佐林 1, 乔瓦娜·蓬塔林, 奇亚拉·兰帕佐, 克里斯蒂娜·米亚齐, 保拉·费拉罗, 伊莉萨·帕伦博, 彼得·赖查德, 维拉·比安奇
附属机构

脱氧核苷酸三磷酸水解酶SAMHD1是哺乳动物细胞DNA前体库的主要调节因子

伊丽莎·弗兰佐林等。 美国国家科学院程序。 。

摘要

无菌α基序和含HD域蛋白1（SAMHD1）是一种将脱氧核苷三磷酸（dNTPs）转化为脱氧核苷类的三磷酸水解酶。这种酶最近被鉴定为人类先天免疫系统的一种成分，通过清除病毒DNA合成所需的dNTP来限制HIV-1感染。SAMHD1具有深刻的进化根源，在人体器官中普遍存在。在这里，我们确定了SAMHD1在调节培养的人类细胞中的dNTP池中的一般功能。该蛋白是核蛋白，在细胞周期中有不同的表达，在静止期最大，在S期最小。用特异性siRNAs治疗肺或皮肤成纤维细胞导致SAMHD1消失，同时失去对dNTP池大小和dNTP失衡的细胞周期调节。细胞聚集在G1期，池过大，停止生长。去除siRNA后，池恢复正常，细胞重新生长，但只有在SAMHD1重新出现后。在静止培养中，SAMHD1下调导致dNTP池显著扩大。在所有情况下，对dGTP的影响最大，dGTP是SAMHD1的首选底物。核糖核苷酸还原酶是一种在S期细胞中最大限度诱导的细胞溶质酶，负责dNTPs的从头合成。因此，在哺乳动物细胞中，控制dNTP池大小的两种主要酶的细胞周期调节被调整为DNA复制的要求。还原酶的合成在S期达到峰值，SAMHD1的分解代谢在G1期达到最大，此时大量的dNTP池会阻止细胞准备新一轮DNA复制。

关键词：细胞周期阻滞；dGTP池；dNTP法规。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1。
图1。
SAMHD1在培养的人细胞中的表达。(一个)不同细胞系SAMHD1 mRNA和蛋白的相对水平。通过RT实时PCR在转化的细胞系（THP1、HEK293和Jurkat）以及未转化的肺和皮肤成纤维细胞中测量mRNA的相对量。通过免疫印迹法在转化细胞、肺和野生型皮肤成纤维细胞以及p53R2或线粒体胸腺嘧啶核苷（TK2）或脱氧鸟苷（dGK）激酶突变的皮肤纤维细胞的提取物中检测SAMHD1蛋白。(B)增殖（P）、融合（C）和静止（Q）WT皮肤和肺成纤维细胞SAMHD1的免疫印迹。星号标记一个不特定的带（加载控制）。(C)免疫荧光显示SAMHD1（绿色）的核定位和RNR的R1（绿）和R2（红）亚单位在肺成纤维细胞中的胞浆定位。(D类)肺成纤维细胞增殖培养中S期细胞频率（实心圈）和SAMHD1蛋白丰度（方形开口）之间的反向关系。(E类)静止肺（黑色）和皮肤（灰色）成纤维细胞中SAMHD1的含量与汇合处数量的关系。免疫印迹显示肺成纤维细胞中SAMHD1信号增加。
图2。
图2。
在siRNA转染和随后去除siRNA期间SAMHD1 mRNA和蛋白的下降和恢复。接种后24小时，用抗SAMHD1-siRNA转染肺成纤维细胞增殖培养物48小时。然后将细胞重新放置在无siRNA培养基中并生长14天，每3-4天更换一次培养基。在指定的时间测量SAMHD1 mRNA（开环）和蛋白质（填充菱形）。条形图表示两个类似实验中的数值范围。
图3。
图3。
SAMHD1沉默对肺成纤维细胞生长的影响。(一个)细胞在转染抗SAMHD1（开环）或对照（填充环）siRNA的培养物中生长24–72小时。来自三个实验的数据。酒吧是SE。(B)转染培养物中G1（黑色）、S（灰色）和G2/M（白色）细胞的百分比。S相电池的频率显示在每个控制（C）和沉默（Si）样品的上方。(C)用对照（填充圈）或抗SAMHD1（开放圈）siRNAs转染培养物18–48小时并在过去30分钟内用BrdU培养的BrdU阳性细胞的频率。数据来自两个相同的实验。每个时间点至少对500个细胞进行评分。频率按2×2χ进行比较2分析*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.001. 酒吧是SE。
图4。
图4。
SAMHD1沉默对循环肺成纤维细胞dNTP池的影响。转染两个单独的抗SAMHD1 siRNA（方形、三角形）或对照siRNA（闭合圆）期间，dNTP池大小与循环培养中S期细胞丢失之间的关系。
图5。
图5。
SAMHD1-沉默和对照肺成纤维细胞的池大小之比。(一个)用对照或抗SAMHD1 siRNA转染增殖培养物24小时（白色）、48小时（灰色）或72小时（黑色）。数据来自三个独立的实验。(B)在血清饥饿期间，用siRNAs转染肺（宽条）、WT（灰色）或p53R2突变（薄条）皮肤成纤维细胞10天的静态培养。数据来自每个细胞系的四到六个实验。所有钢筋均为SEM。
图6。
图6。
SAMHD1-沉默后肺成纤维细胞生长和细胞周期进展缓慢恢复。(一个)转染48小时后，将对照组（填充圈）和SAMHD1-沉默的（开放圈）肺成纤维细胞的细胞生长移植到无siRNA培养基中。(B)控制培养物（填充方形、填充圆形）和沉默培养物（开放方形、开放圆形）中G1-（方形）和S期（圆形）细胞的频率。条形图英寸一个和B显示两个独立实验中相同时间点的值范围。(C)在无siRNA培养的指定日期，SAMHD1（x）、R2（填充正方形）和p53R2（填充三角形）的丰度。左侧以aribitrary单位报告右侧免疫印迹的定量。注意培养物中R2表达和S期细胞（开环）频率之间的平行性。
图7。
图7。
SAMHD1 siRNA沉默后肺和皮肤成纤维细胞中大的dNTP池持续存在。在没有siRNA的14天内，沉默细胞和对照细胞中dGTP（实心圆）、dCTP（开圆）、dTTP（实心方形）和dATP（开三角形）池大小的平均比率。来自肺成纤维细胞实验的数据（图6和图S4一个)和皮肤成纤维细胞(图S3和图S4B). 条形图显示值的范围。
图8。
图8。
DNA复制所需的dNTP池由合成和分解代谢酶调节。合成发生于(我)RNR在细胞溶质中的从头合成(ii（ii）)通过胞浆和线粒体中的脱氧核苷激酶回收脱氧核苷类。在5′-脱氧核苷酸酶的最终干预下，dNTPs逐步分解为脱氧核糖体。磷酸化酶和脱氨酶进一步降解胞浆中的脱氧核苷。三磷酸水解酶SAMHD1位于细胞核中，直接将dNTP降解为脱氧核苷。
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