SAMHD1于2000年首次被描述为人类先天免疫系统的一种成分，名称为树突状细胞衍生的IFN-γ诱导蛋白（DCIP）(1). DCIP mRNA在大多数人体器官中组成性表达，骨骼肌和心脏的信号特别大。在真细菌和太古宙以及从线虫到人类的真核生物中发现了远缘相关基因序列。该蛋白质后来被重命名为SAMHD1(2)当人们意识到其结构包含两个先前已知的蛋白质模块时：一个N-末端短杀菌-α（SAM）结构域(三)和一个中心更长的HD域(4)组氨酸（H）和天冬氨酸（D）的保守双链。SAM结构域是一个假定的蛋白质-蛋白质和蛋白质-核酸相互作用模块，HD结构域存在于多种磷酸水解酶家族中(4).
中的突变SAMHD1公司Aicardi–Goutières综合征是一种先天免疫反应缺陷的遗传性神经退行性疾病(5). 此外，SAMHD1是HIV-1感染的限制因子(2). 其他慢病毒通过与靶向SAMHD1的蛋白（Vpx）共感染来逃避泛素依赖性降解的限制(6,7).
限制需要一个正常运行的HD域。纯蛋白和含有HD结构域的较短片段都被发现是一种不寻常的三磷酸水解酶，将dNTP降解为脱氧核苷+三磷酸，从而耗尽感染细胞合成病毒DNA所需的脱氧核苷酸(8–11).
在大肠杆菌50多年前(12). 这种酶是一种dGT酶，可将dGTP水解为脱氧鸟苷+三磷酸。其他最近发现的同源微生物酶对dNTP具有更广泛的底物特异性。因此粪肠球菌能够水解所有四种典型dNTP的寡聚酶(13)除了dGTP特异的底物位点变构位点外，还含有。一种酶来自嗜热菌也能水解所有四种dNTP，但只能用dTTP+dATP作为变构效应器(14).
哺乳动物SAMHD1的底物特异性与粪大肠杆菌dN基础。这两种酶都有能力水解所有四种dNTP，但仅在存在dGTP的情况下。特异性的结构基础尚未得到详细分析。SAMHD1对dNTPs的水解及其调控在概念上与脱氧核苷酸的合成及其受核糖核苷酸还原酶（RNR）的调控有关(15). 在这两种情况下，有可能与四种不同底物作用的低聚酶都使用dNTP作为变构效应器来指导其底物特异性。
不平衡的dNTP池降低DNA聚合酶的保真度并增加突变率(16–19). 令人惊讶的是，dNTP的过剩可能会给DNA复制带来问题大肠杆菌(20)在真核生物中(21). 在酿酒酵母dNTP池的大量本构膨胀导致细胞周期G1期的阻滞(22). 正确的比例也很重要。酵母RNR变构位点氨基酸的特定取代影响其底物特异性，从而改变了dNTP池的相对比例和细胞的突变模式(19).
我们的实验室长期以来一直对供应和调节dNTP池的酶感兴趣。哺乳动物细胞含有两种不同的dNTP合成途径：(我)在细胞溶质中，RNR催化脱氧核苷酸的从头合成(ii（ii）)在细胞质和线粒体中，脱氧核苷激酶将脱氧核苷类磷酸化为其5′-磷酸，再磷酸化为dNTP。RNR和其他几种合成酶是细胞周期调节的，在S期具有最高的活性。细胞溶质和线粒体中的分解代谢5′-核苷酸酶与合成的脱氧核苷激酶相对抗，后者微调脱氧核苷类5′-磷酸盐的细胞内浓度。额外的分解代谢酶（脱氨酶和磷酸化酶）通过清除循环中的脱氧核苷，有助于建立最终的库水平。因此，联锁合成和分解代谢酶的组合设置每个dNTP的细胞内浓度(23).
SAMHD1相关三磷酸水解酶基因编码在多种细菌和Archea中的出现表明，该酶具有深层进化起源，其功能比作为病毒感染的保护物更广泛。在这里，我们描述了SAMHD1存在于人肺和皮肤成纤维细胞的细胞核中，在S期含量最低，静止细胞中的蛋白质大量增加。siRNA下调SAMHD1增加了细胞内dNTP池，尤其是dGTP，导致四个池的比例发生变化。在增殖细胞中，该治疗干扰了dNTP池大小的正常细胞周期相关调节，并导致G1期细胞周期延迟。池的扩大取决于RNR活性，因为RNR p53R2亚单位不活跃的静止突变皮肤成纤维细胞缺乏dNTP的积累。我们认为SAMHD1是调节细胞dNTP浓度的酶网络中的独特参与者，并防止dNTP的过度生产，主要在S期以外发挥其活性。
结果
SAMHD1在培养细胞中的表达。
我们发现SAMHD1蛋白和mRNA存在于多种人类细胞系的提取物中(). 单核细胞THP1细胞的SAMHD1含量最高，Jurkat T细胞为阴性。未转化的肺和皮肤成纤维细胞显示SAMHD1的中间表达，我们选择这些细胞进行实验。在增殖细胞提取物中，SAMHD1表现为双链，可能是翻译后修饰所致(). 蛋白质的浓度随着细胞增殖而发生显著变化，融合和静止的成纤维细胞比循环细胞含有更多的SAMHD1。通过荧光显微镜，我们检测到与早期工作一致(5)SAMHD1只存在于细胞核中()与已知的蛋白R1和R2的细胞质位置相反，RNR的两个亚单位催化从头合成dNTPs(24,25). SAMHD1的荧光信号存在于所有细胞中，但其强度有显著差异，表明该蛋白的浓度随细胞周期中细胞位置的不同而不同(). 比较同一培养物中R2和SAMHD1的丰度()，我们发现具有强SAMHD1信号的细胞R2为阴性，而具有强R2信号的细胞只有弱SAMHD1-荧光。这两种蛋白质不仅存在于不同的细胞隔室中，而且在细胞周期中也有不同的表达。RNR在S期特异性诱导，为核DNA复制提供dNTP(26)，但其R2亚单位在DNA复制完成后降解，在静止细胞中缺失(27,28). 荧光数据以及中所示的结果表明SAMHD1的最大表达发生在S期以外，当DNA复制不发生时，该酶主要降解dNTPs。事实上，在含有不同数量S期细胞的循环培养中，我们发现SAMHD1浓度与S期细胞频率之间存在明显的反向关系(). 此外，在静止的肺成纤维细胞培养中，所有细胞核都有强烈的SAMHD1信号()免疫印迹分析表明，SAMHD1在血清饥饿期间在培养物中逐渐积累().
SAMHD1在培养的人细胞中的表达。(A类)不同细胞系SAMHD1 mRNA和蛋白的相对水平。通过RT real-time PCR测定转化细胞系（THP1、HEK293和Jurkat）以及非转化肺和皮肤成纤维细胞中mRNA的相对量。通过免疫印迹法在转化细胞、肺和野生型皮肤成纤维细胞以及p53R2或线粒体胸苷（TK2）或脱氧鸟苷（dGK）激酶突变的皮肤成纤维细胞的提取物中检测SAMHD1蛋白。(B类)增殖（P）、融合（C）和静止（Q）WT皮肤和肺成纤维细胞SAMHD1的免疫印迹。星号标记一个不特定的带（加载控制）。(C类)免疫荧光显示SAMHD1（绿色）的核定位和RNR的R1（绿）和R2（红）亚单位在肺成纤维细胞中的胞浆定位。(D类)肺成纤维细胞增殖培养中S期细胞频率（实心圈）和SAMHD1蛋白丰度（方形开口）之间的反向关系。(E类)静止肺（黑色）和皮肤（灰色）成纤维细胞中SAMHD1的含量与汇合处数量的关系。免疫印迹显示肺成纤维细胞中SAMHD1信号增加。
增殖细胞中SAMHD1的siRNA沉默抑制细胞周期进展和dNTP池的细胞周期依赖性调节。
循环肺转染()或皮肤成纤维细胞(图S1)针对SAMHD1的siRNAs在24小时内有效地耗尽了mRNA的细胞，而蛋白质则逐渐下降。当48小时后，我们将沉默的细胞转移到无siRNA培养基中的新平板上时，mRNA在几天后重新出现，蛋白质则更晚(和图S1). 在siRNA转染过程中，SAMHD1沉默培养物的生长速度比非沉默对照慢，在较低密度下生长停滞，S期细胞较少，同时G1细胞增加(和图S2A类和B类). 为了更密切地跟踪SAMHD1下降引起的细胞周期变化，我们在转染siRNA的18到48小时之间的不同时间点用BrdU刺激循环肺成纤维细胞30分钟，并用免疫荧光法测定BrdU阳性细胞的百分比(). 在所有时间点，对照培养物中阳性细胞的频率保持在30%左右。相反，在沉默18小时后，BrdU-阳性S期细胞的数量已经明显减少，30小时后，当沉默培养物中的S期细胞数量仅为对照组的一半时，这种减少会变得更加明显。甚至SAMHD1的不完全下调()影响非转化成纤维细胞的细胞周期进展。
在siRNA转染和随后去除siRNA期间SAMHD1 mRNA和蛋白的下降和恢复。接种后24小时，用抗SAMHD1-siRNA转染肺成纤维细胞增殖培养物48小时。然后将细胞重新放置在无siRNA培养基中并生长14天，每3-4天更换一次培养基。在指定的时间测量SAMHD1 mRNA（开环）和蛋白质（填充菱形）。条形图表示两个类似实验中的数值范围。
SAMHD1沉默对肺成纤维细胞生长的影响。(A类)细胞在转染抗SAMHD1（开环）或对照（填充环）siRNA的培养物中生长24–72小时。来自三个实验的数据。酒吧是SE。(B类)转染培养物中G1（黑色）、S（灰色）和G2/M（白色）细胞的百分比。S相电池的频率显示在每个控制（C）和沉默（Si）样品的上方。(C类)用对照（填充圈）或抗SAMHD1（开放圈）siRNAs转染培养物18–48小时并在最后30分钟内用BrdU培养的BrdU阳性细胞的频率。数据来自两个相同的实验。每个时间点至少对500个细胞进行评分。频率按2×2χ进行比较2分析*P（P）< 0.05; **P（P）<0.001。酒吧是SE。
在增殖细胞群中，四种dNTP的浓度取决于强烈诱导核糖核苷酸减少的S期细胞的频率(26). 在沉默实验期间，生长的对照培养物变得越来越拥挤，其S期细胞的百分比下降(). 因此，dNTP池的大小也下降了，dGTP始终代表最小的池(). SAMHD1-沉默培养物中S期细胞的减少速度快于对照组()，但dNTP池没有显示相应的减少。在我们用两种不同的抗SAMHD1 siRNA或对照siRNA转染肺成纤维细胞，并在沉默相关池大小至S期细胞频率的过程中，转染72小时后达到最低值。在沉默培养基中，SAMHD1的逐渐丢失稳定了细胞池，干扰了S期外正常细胞周期依赖性下调(). 在增殖的WT皮肤成纤维细胞中沉默SAMHD1也获得了类似的结果(图S2C类). 沉默细胞和对照细胞的dNTP池之间的比率增加(和图S2D类)因为在没有SAMHD1的情况下，dNTP衰减较慢，而不是dNTP的实际积累。当SAMHD1在静止细胞中被沉默时，观察到了不同的情况。
SAMHD1沉默对循环肺成纤维细胞dNTP池的影响。转染两个单独的抗SAMHD1 siRNA（方形、三角形）或对照siRNA（闭合圆）期间，dNTP池大小与循环培养中S期细胞丢失之间的关系。
SAMHD1-沉默和对照肺成纤维细胞的池大小之比。(A类)用对照或抗SAMHD1 siRNA转染增殖培养物24小时（白色）、48小时（灰色）或72小时（黑色）。数据来自三个独立的实验。(B类)在血清饥饿期间，用siRNAs转染肺（宽条）、WT（灰色）或p53R2突变（薄条）皮肤成纤维细胞10天的静态培养。数据来自每个细胞系的四到六个实验。所有钢筋均为SEM。
静止成纤维细胞中SAMHD1的沉默增加了dNTP池的大小。
上述实验显示了含有处于细胞周期不同阶段细胞的循环培养物中SAMHD1缺失的结果。我们现在转向SAMHD1-沉默和控制的肺成纤维细胞、野生型皮肤成纤维细胞和缺乏p53R2活性的突变皮肤成纤维纤维细胞的更均匀培养结果(29)因血清饥饿而静止。这些培养物含有不到3%的S期细胞，用SAMHD1 siRNAs转染后，保留了不到10%的mRNA，并且只有最小的SAVHD1蛋白。在四到六个独立的类似实验中，每个成纤维细胞系，我们测量了四个dNTP池(表S1)并计算了静音导致的池大小增加(). 在肺和野生型皮肤成纤维细胞中，SAMHD1的丢失增加了所有四个池，尤其是dGTP池。在p53R2突变的成纤维细胞中，相对于WT皮肤成纤维细胞的增加较小，与dGTP的差异非常显著(P（P）<0.01），对dCTP不太显著(P（P）<0.05），对dATP和dTTP无显著影响。由于蛋白质R2在达到静止状态时被降解，dNTP的合成依赖于p53R2活性，在突变细胞中有缺陷。突变成纤维细胞在缺乏SAMHD1的情况下无法积累dNTPs，这反映了p53R2依赖性核糖核苷酸还原在静止期dNTPss合成中的关键作用(30,31). 沉默的成纤维细胞中具有活性p53R2酶的池的扩大表明，SAMHD1参与了dNTP池的持续周转，也参与了DNA复制的缺失。
siRNA沉默后SAMHD1的恢复。
去除siRNA后，SAMHD1-沉默的成纤维细胞恢复平衡的dNTP池和正常生长的速度有多快？首先，我们用SAMHD1或对照siRNA转染野生型肺或皮肤成纤维细胞培养物48小时（抑制期）。然后，我们将细胞以低密度重新放置在缺乏siRNA的新鲜培养基中，并继续培养12–14天，在此期间，每3-4天更换一次培养基（释放期）。在抑制期内，SAMHD1下调对细胞生长、细胞周期进展和dNTP池的影响如上所述(和和图S2).
在释放期间，对照肺成纤维细胞重新开始生长，接种后S期细胞的百分比最高。在我们结合了用相同的基本方案进行的两个实验的结果，其中在部分不同的时间点对培养物进行分析。在这些实验中，沉默细胞的生长在4-6天内仍然受到强烈抑制()恢复期开始后6天左右出现S期细胞峰值(). 沉默导致皮肤成纤维细胞的生长延迟相似，但它们的生长速度较慢，最终的生长速度较低(图S3). 6天后，他们还出现了S期细胞的小峰值(图S3B). 两种细胞株在去除siRNA后都有恢复生长的能力，但只有在延迟期延长后才能恢复生长。
SAMHD1-沉默后肺成纤维细胞生长和细胞周期进展缓慢恢复。(A类)转染48小时后，将对照组（填充圈）和SAMHD1-沉默的（开放圈）肺成纤维细胞的细胞生长移植到无siRNA培养基中。(B类)对照（填充正方形、填充圆形）和沉默（开放正方形、开放圆形）培养物中G1期（正方形）和S期（圆形）细胞的频率。条形图英寸A类和B类显示两个独立实验中相同时间点的值范围。(C类)在无siRNA培养的指定日期，SAMHD1（x）、R2（填充正方形）和p53R2（填充三角形）的丰度。左侧以aribitrary单位报告右侧免疫印迹的定量。注意培养物中R2表达和S期细胞（开环）频率之间的平行性。
在转移到无siRNA条件后，长滞后期与SAMHD1 mRNA和蛋白质的缓慢恢复平行(和图S1)可能是由于细胞在48小时转染期间内化的siRNA的稳定性。我们通过Western blotting跟踪SAMHD1在肺成纤维细胞中的再现，同时测量RNR的两个小亚单位，即蛋白质R2和p53R2(). R2的变化模式与S期细胞一致，而p53R2在整个释放期更稳定。
我们测定了之前的siRNA处理对肺和皮肤成纤维细胞释放期间dNTP池大小的影响(图S4A类和B类). 在这两种情况下，所有四个池中都出现了几乎相同的急剧池增加，在恢复的第三到第六天达到峰值，此时细胞含有一些SAMHD1 mRNA，但SAMHD1-蛋白尚未返回。dNTP峰值与S期细胞的小峰值在时间上一致。
这两种细胞系在池变化的时间和它们的增加方面都表现出高度相似的行为。因此，我们将图S4A类和B类并将受抑制细胞和对照细胞的平均池大小分开，以计算每个池的大小增加(). 最令人印象深刻的是6天后dGTP的峰值。此时dGTP占总细胞池的20%以上，是循环细胞群中dGTP百分比的两倍多。当SAMHD1稍后可用时，池值正常化，细胞生长恢复。这些结果清楚地表明，SAMHD1不仅是维护正常规模的dNTP池所必需的，而且也是其正常比例所必需的。
SAMHD1 siRNA沉默后肺和皮肤成纤维细胞中大的dNTP池持续存在。在没有siRNA的14天内，沉默细胞和对照细胞中dGTP（实心圆）、dCTP（开圆）、dTTP（实心方形）和dATP（开三角形）池大小的平均比率。来自肺成纤维细胞实验的数据(和图S4A类)和皮肤成纤维细胞(图S3和图S4B类). 条形图显示值的范围。
讨论
到目前为止，SAMHD1的主要兴趣集中在其抗慢病毒作用的机制上。对我们来说，它存在于大多数哺乳动物器官和许多细胞系中，这表明它在哺乳动物细胞中的DNA前体调控中具有更普遍的作用。我们之前已经展示了在这些细胞中，dNTP池的平衡是如何由合成和分解代谢活动的相互作用产生的，总结如下并证明了脱氧核苷激酶和5′-脱氧核苷酸酶之间底物循环的调节作用(32,33). 我们现在假设SAMHD1提供了额外的独特水平的分解代谢干预。在细胞周期的G1期，这种酶通过总去磷酸化作用去除细胞核中潜在的危险过剩的DNA前体。当DNA复制需要大量dNTP时，与细胞周期相关的酶调节使其在S期的活性降至最低。RNR的细胞周期调控与SAMHD1相反，在S期提供最大活性。
DNA复制所需的dNTP池由合成和分解代谢酶调节。合成发生于(我)RNR在细胞溶质中的从头合成(ii（ii）)通过胞浆和线粒体中的脱氧核苷激酶回收脱氧核苷类。在5′-脱氧核苷酸酶的最终干预下，dNTPs逐步分解为脱氧核糖体。磷酸化酶和脱氨酶进一步降解胞浆中的脱氧核苷。三磷酸水解酶SAMHD1位于细胞核中，直接将dNTP降解为脱氧核苷。
我们通过研究SAMHD1如何参与调节非转化人类成纤维细胞中的细胞dNTP池来获得这一概念的证据，这些成纤维细胞保持对细胞周期进程的正常控制。当我们通过RNA干扰下调增殖成纤维细胞中SAMHD1的表达时，我们检测到G1/S转变的早期紊乱，G1中的细胞逐渐积累，S期细胞减少，导致细胞生长缓慢(). 与SAMHD1表达正常的对照细胞相比，S期细胞的减少并没有伴随dNTP池大小的平行下降(). 早些时候，在芽殖酵母中报道了由组成性高的dNTP池产生的G1延迟，这归因于Cdc45的负载受到干扰，Cdc45是DNA复制起源处预引发复合物的一种成分(22). 在增殖的成纤维细胞中，仅在72小时后，SAMHD1沉默产生的dNTP池相对于对照组稍低但具有可比性的扩张()然而，当细胞池总数几乎没有改变时，S期细胞的频率开始下降(). 与酵母实验相反，我们的实验是用不同步的细胞群进行的，我们无法测量G1细胞中特异性发生的池变化。然而，SAMHD1的下调可能在早期阶段影响了G1小池，并使其升高到足以触发G1被捕，目前机制尚不明确。
当细胞进入S期时，核糖核苷酸还原被诱导合成核DNA复制所需的dNTP(26). 在这里，RNR的S期特异性R2亚单位的细胞含量与S期细胞的频率平行变化(). 值得注意的是，SAMHD1变异表现出相反的行为，随着S期细胞的减少而增加，并在静止培养中积累(). 这种差异表明，当细胞不复制其核DNA时，这种酶具有保持池低的特殊作用。事实上，当SAMHD1在因血清饥饿而静止的细胞中被沉默时，池中的细胞数量实际大幅增加(和表S1)揭示了这种酶通常抑制非增殖细胞池。SAMHD1的丢失不仅扩大了四个dNTP池的大小，还改变了它们的相对比例，与原始池组成相比，dGTP的百分比增加了一倍多。当SAMHD1在增殖细胞中沉默时，对池大小的相对比率产生了类似但较小的影响().
有趣的是，在生长细胞和静止细胞中，SAMHD1敲除引起的主要变化与dGTP池有关，dGTP通常是最小的池。这些结果反映了SAMHD1对dGTP作为底物的偏好，并表明较小的dGTP池大小可能不是由于通过核糖核苷酸还原的低dGTP合成，而是由于SAMHD1.的更有效分解代谢。考虑到dGTP作为RNR和SAMHD1的变构效应器，后一种酶对dGTP浓度的抑制可能对这两种酶都有有趣但尚未确定的调节作用。
迄今为止可用的数据表明，SAMHD1的S期外活动具有两个主要功能：(我)在细胞增殖过程中，它将G1池维持在正确的水平，以便有规律地转变为S，可能是通过启动前复合物的正常组装，以及(ii（ii）)通过降低dNTP池，它剥夺了入侵病毒必需的DNA前体。早在20世纪90年代初，McIntosh就提出了一个概念，即dNTP池的细胞周期相关变体可能是对病毒感染的防御适应(34). 最近关于SAMHD1抗慢病毒活性的发现直接证实了先前的说法。SAMHD1的另一个作用可能是控制多细胞动物细胞中的dNTP池大小，多细胞动物因血液中与食物摄入有关的脱氧核苷浓度突然达到峰值而经历周期性波动。
S期以外的调节dNTP池对DNA修复和线粒体DNA复制的保真度很重要。不平衡的dNTP池对核基因组和线粒体基因组的不稳定作用是众所周知的，与分解代谢酶基因缺陷相关的严重人类疾病就是例证(35–37). SAMHD1突变引起的Acardi–Goutières综合征表型的潜在机制尚不清楚，但线粒体DNA偶尔出现缺失可能与dNTP池异常有关。最近报道的dGTP池对端粒长度稳态的特定影响(38)进一步强调了控制dGTP的重要性。
最近的研究表明，甲基化SAMHD1公司启动子调控人T细胞基因表达(39)并且该蛋白被循环细胞中的细胞周期蛋白A2/CDK1复合物磷酸化(40,41). 免疫印迹观察到的双重SAMHD1信号()可能取决于后一种现象。SAMHD1丰度与S期细胞频率之间的反向关系，以及不同细胞和组织中SAVHD1的可变水平(1)()可能是这些和其他未知监管机制的结果。与SAMHD1相反，有助于dNTP池平衡的5′-核苷酸酶是组成性表达的蛋白质，其实验下调不会导致dNTP库大小的显著改变(33,42). SAMHD1显然是dNTP池周转的主要调节器，其丢失对细胞dNTP库在静止和增殖期间的组成有很大影响。
