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.2012年6月；23(11):2066-75.
doi:10.1091/mbc。E11-10-0884。 Epub 2012年4月11日。

层粘连蛋白B1缺失是衰老相关的生物标志物

亚当·弗洛伊德 1, 雷米·马丁·拉贝奇, 马可·德马里亚, 朱迪斯·坎皮西
附属公司

层粘连蛋白B1缺失是衰老相关的生物标志物

亚当·弗伦德等。 分子生物学细胞. 2012年6月.

摘要

细胞衰老是一种有效的肿瘤抑制机制，可阻止细胞增殖，并与衰老有关。然而，由于缺乏简单、独特的衰老状态生物标志物，衰老研究受到阻碍。衰老细胞会发生特征性的形态变化，包括细胞核增大，通常不规则，染色质重组。因为核膜的改变会影响核形态和基因表达，所以我们检查了衰老细胞的核膜。我们在这里显示，当DNA损伤、复制衰竭或癌基因表达诱导人类和小鼠原代细胞株衰老时，层粘连蛋白B1会丢失。层粘连蛋白B1的缺失不依赖于p38丝裂原活化蛋白激酶、核因子-κB、共济失调毛细血管扩张突变激酶或活性氧信号通路，它们是衰老表型的正调节因子。然而，p53或pRB抑癌途径的激活足以诱导层粘连蛋白B1的丢失。层粘连蛋白B1在mRNA水平上的下降是由于mRNA稳定性的下降，而不是凋亡过程中caspase介导的降解。最后，辐射诱导小鼠组织衰老后，层粘连蛋白B1和mRNA表达下降。我们的研究结果表明，层粘连蛋白B1的缺失可以作为培养物和体内衰老的生物标志物。

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数字

图1：
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层粘连蛋白B1的缺失与多种类型的细胞衰老有关。（A） 拉明B1降低DNA损伤诱导的衰老。HCA2细胞接受模拟照射（PRE）或照射（10-Gy x射线）并允许衰老（SEN（XRA））。使用识别C末端表位的两种无关的层粘连B1抗体中的任何一种，通过Western印迹分析全细胞裂解产物。（B） 拉明B2不会降低DNA损伤诱导的衰老。HCA2细胞被模拟照射（PRE）或照射并允许衰老（SEN（XRA））。通过Western blotting分析全细胞裂解产物。（C） SEN（XRA）细胞中的层粘连蛋白B1下降。BJ细胞被模拟照射（PRE）或照射并允许衰老（SEN（XRA））。使用识别内部表位的第三层粘连蛋白B1抗体通过蛋白质印迹分析全细胞裂解物。（D） 拉明B1在复制衰老中下降。HCA2细胞培养至复制性衰老（SEN（REP）；～70人口翻倍）。通过Western blotting分析全细胞裂解产物。（E） 拉明B1在RAS诱导的衰老中下降。HCA2细胞被缺乏插入物（PRE）或表达致癌RAS的慢病毒感染V12版本并允许衰老（SEN（RAS））。通过Western blotting分析全细胞裂解产物。（F） 在MKK6诱导的衰老中，层蛋白B1下降。HCA2细胞被缺乏插入物（PRE）或表达组成活性MAP激酶激酶6突变体（MKK6EE）的慢病毒感染，并允许其衰老（SEN（MKK 6）。通过Western blotting分析全细胞裂解产物。（G） XRA后WI-38细胞中的层粘连蛋白B1下降。照射WI-38细胞（SEN（XRA））并使其衰老。模拟照射PRE细胞。通过Western blotting分析全细胞裂解产物。（H） 层蛋白B1在静止细胞中不下降。HCA2细胞在含有10%血清（PRE）的培养基、无血清培养基中培养48 h以诱导静止（QUI），或照射并允许衰老（SEN（XRA））。通过Western blotting分析全细胞裂解产物。（一） 辐照诱导衰老后48h内，层蛋白B1下降。HCA2细胞接受模拟照射（PRE）或照射（XRA）。通过Western blotting分析在指定时间点收集的细胞核（N）和细胞质（C）提取物。RPA用作核馏分的装载控制；微管蛋白作为细胞质部分的负荷控制。
图2：
图2：
衰老时拉明B1的丢失独立于p38 MAPK、NF-κB、ATM和ROS信号。（A） p38 MAPK抑制不能逆转DNA损伤诱导的衰老中层粘连蛋白B1的下降。将p38 MAPK抑制剂SB203580（SB；10μM）添加到SEN（XRA）HCA2细胞中48 h。通过Western blotting分析全细胞裂解产物。模拟照射PRE细胞。（B） p38 MAPK抑制不能阻止DNA损伤诱导的衰老中层粘连蛋白B1的下降。SB在XRA前加入HCA2细胞。细胞被模拟辐照（PRE）或辐照（XRA）。通过Western blotting分析在指定时间点收集的全细胞裂解物。每天更换SB。（C） p38 MAPK抑制不能逆转或阻止RAS诱导的层粘连B1下降。HCA2细胞被表达致癌RAS的慢病毒感染第12版并允许衰老（SEN（RAS））。未添加SB（–），感染后第8天添加48小时（+SB 48小时），或在感染前添加并维持10天（+SB cont）。前新生对照组（PRE）感染了无插入载体。通过Western blotting分析全细胞裂解产物。（D） p38 MAPK抑制可阻止但不能逆转MKK6诱导的层粘连蛋白B1的下降。HCA2细胞被表达MKK6EE的慢病毒感染并允许衰老（SEN（MKK6））。未添加SB（–），感染后第8天添加48小时（+SB 48小时），或在感染前添加并维持10天（+SB cont）。前新生对照组（PRE）感染了无插入载体。通过Western blotting分析全细胞裂解产物。（E） RelA缺失不能阻止DNA损伤诱导的层粘连蛋白B1下降。HCA2细胞被一种慢病毒感染，该慢病毒表达两种针对RelA（shRelA）或GFP（shGFP；对照）的shRNAs，并被选中。然后对细胞进行辐照并使其衰老（SEN（XRA））。对呈现对照（PRE）进行模拟照射。通过Western blotting分析全细胞裂解产物。（F） ATM耗竭并不能阻止DNA损伤引起的层粘连蛋白B1下降。HCA2细胞被表达shRNA对抗ATM（shATM）或GFP（shGFP；对照）的慢病毒感染并选择。然后对细胞进行辐照并使其衰老（SEN（XRA））。对前新生对照组（PRE）进行模拟照射。通过Western blotting分析全细胞裂解产物。（G） ROS抑制不能阻止DNA损伤诱导的层粘连蛋白B1下降。照射前向HCA2细胞中添加NAC（10 mM），并保持至XRA（SEN（XRA））后10天收集全细胞裂解物。对前新生对照组（PRE）进行模拟照射。NAC每天更换一次。通过Western blotting分析全细胞裂解产物。（H） ROS抑制不能阻止MKK6诱导的层粘连蛋白B1下降。在感染前将NAC（10mM）加入到HCA2细胞中，并持续到样品收集。在感染表达MKK6EE的慢病毒（SEN（MKK6））10天后收集全细胞裂解物。前新生对照组（PRE）感染了一种缺乏插入物的慢病毒。NAC每天更换一次。通过Western blotting分析全细胞裂解产物。
图3：
图3：
p53或p16的表达足以导致层粘连蛋白B1的丢失，这在mRNA水平上受到调节。（A） p53的稳定足以引起层粘连蛋白B1的下降。用5μM nutlin-3a或载体（PRE）处理HCA2细胞。连续处理4天后，通过Western blotting分析全细胞裂解物。（B） 异位p16INK4A（墨水）这种表达足以引起层粘连蛋白B1的下降。HCA2细胞被缺乏插入物（PRE）或表达p16的慢病毒感染INK4A（墨水）（第16页INK4a公司OE）并选择。感染4天后，用Western blotting分析全细胞裂解物。（C） 层蛋白裂解产物存在于凋亡细胞中，但不存在于衰老细胞中。用500nM staurosporine处理HCA2细胞24h诱导凋亡（Stauro）或照射4d后收集（SEN（XRA））。对前新生对照组（PRE）进行模拟照射。通过蛋白质印迹分析全细胞裂解物。（D） 半胱天冬酶抑制可防止葡萄孢霉素诱导的层粘连蛋白B1降解，但不能阻止衰老相关层粘连肽B1的下降。HCA2细胞用500 nM staurosporine处理24小时（Stauro）或照射4天后收集（SEN（XRA））。对前新生对照组（PRE）进行模拟照射。如有指示，从星形孢菌素/XRA之前开始添加泛胱天蛋白酶抑制剂z-VAD-fmk（z-VAD；100μM），并持续到收集全细胞裂解物。每天更换Z-VAD-fmk。（E） 衰老细胞中的层粘连蛋白B1 mRNA下降。HCA2和IMR-90细胞接受模拟辐射（PRE）或XRA处理。4天后分离总RNA，并通过定量逆转录-PCR进行分析。信号正常化为微管蛋白。（F） 衰老细胞中的层粘连蛋白B1 mRNA稳定性降低。HCA2细胞接受模拟辐射（PRE）或XRA处理。三天后，添加放线菌素D（最终1μg/ml）以停止转录。24小时后，分离总RNA，并通过定量RT-PCR进行分析。添加放线菌素D前的转录水平设置为100%。
图4：
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急性DNA损伤后，体内出现层粘连蛋白B1丢失。（A） 层粘连蛋白B1免疫荧光的代表性图像。HCA2细胞接受模拟照射（PRE）或照射（XRA），并允许衰老（SEN（XRA））。固定细胞并对层粘连B1进行免疫染色。（B） 通过免疫荧光验证层粘连蛋白B1定量：核强度直方图。HCA2细胞按A处理。使用细胞轮廓仪测量每个确定核区域的层粘连B1强度。p<0.0001（C）小鼠肝脏层粘连蛋白B1染色的代表性图像。对小鼠进行辐照（7-Gy XRA）或未经处理（对照）。12周后，取肝脏，切片，免疫染色检测层粘连蛋白B1。在每个确定的核区域测量了层蛋白B1的强度。（D） 照射后小鼠肝脏中的层粘连蛋白B1而非层粘连素C核强度下降：核层粘连强度直方图。对小鼠进行辐照或未经处理（对照）。12周后，采集肝脏，切片，并对其进行层粘连B1（顶部）和层粘连C（底部）的免疫染色。核染色用细胞轮廓仪定量。在对照组和XRA条件下，通过平均四只小鼠的相对贡献来计算垃圾箱数量。（E） 照射后小鼠肝脏中的层粘连蛋白B1而非层粘连素C核强度下降：平均核层粘连强度。D的数据表示为四只小鼠在对照和XRA条件下的平均层粘连强度的平均值。层粘连B1的p=0.02，层粘连C的p=0.71。（F）照射后层粘连B1mRNA在体内下降。在照射后12周，从对照小鼠和小鼠的肝脏、肺、肾和皮肤中获取。mRNA被纯化，层粘连蛋白B1 mRNA水平通过定量PCR测定，并归一化为微管蛋白。为了从每只小鼠的四个器官产生单个层粘连蛋白B1 mRNA值，对每个器官进行同等加权（每个器官的平均对照层粘连蛋白B1水平设置为1），并对每只小鼠进行合并。然后对每种情况下的整只小鼠池进行平均：对照组，n=4；7-Gy X射线衍射仪，n=5。
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