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。2011年4月8日；286(14):12024-32.
doi:10.1074/jbc。M110.168625。 Epub 2011年2月12日。

Snail1和twist在上皮细胞向间充质细胞转化过程中调节ZEB1表达的功能合作

纳塔莉亚·戴夫 1, 桑德拉·瓜伊塔·埃斯特鲁拉斯, 苏珊娜·古塔拉, 弗里亚斯法院, 曼纽尔·贝尔特兰, 桑德拉·佩罗, 安东尼奥·加西亚·德·埃雷罗斯
附属机构

Snail1和twist在上皮细胞向间充质细胞转化过程中调节ZEB1表达的功能合作

纳塔莉亚·戴夫等。 生物化学杂志。 。

摘要

蜗牛1和Zeb1是上皮-间质转化（EMT）过程中诱导的E-钙粘蛋白转录阻遏物。在本文中，我们分析了EMT期间控制Zeb1表达的因素。在用TGF-β处理的NMuMG细胞中，在Zeb1上调前添加细胞因子1小时后（需要6-8小时），可诱导蜗牛1 RNA和蛋白质。Zeb1基因的表达是由RNA水平增加以及蛋白质稳定性增强引起的，并且明显依赖于蜗牛1，因为该蛋白质的耗竭阻止了Zeb1蛋白和RNA的上调。除Snail1外，Twist转录因子的缺失会延缓TGF-β对Zeb1的刺激，或降低其他细胞模型中Zeb1表达，这表明Zeb1也需要该因子。因此，Snail1和Twist在Zeb1的诱导中协同作用：Zeb1 mRNA的最大表达需要两个cDNA的共同转染；虽然Twist耗竭可延缓TGF-β对Snail1的上调，但对于Twist蛋白的快速增加以及细胞因子诱导的Twist1 mRNA的后期上调来说，Snaill是必需的。除了对Twist的这种影响外，Snail1还诱导Ets1的核移位，这是Zeb1表达所需的另一个因素。Twist和Ets1都与ZEB1启动子结合，尽管与不同的元件结合：虽然Ets1与近端启动子相互作用，但Twist与转录起始位点上游的700-bp序列相互作用。这些结果表明，Snail1在多个水平上控制Zeb1的表达，并在Zeb1基因转录诱导中与Twist协同作用。

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图1。
图1。
TGF-β在NMuMG细胞中诱导Zeb1需要表达Snail1。 面板A，NMuMG细胞与TGF-β（5 ng/ml）孵育指定时间；制备蛋白提取物或分离RNA，并用Western blot或qRT-PCR进行分析。左边的面板展示了三个实验中具有代表性的Western blot；这个中央控制面板，三次实验结果的密度分析结果的平均±S.D。值是指在1小时（蜗牛1）或6小时（Zeb1）时获得的值。这个右侧面板表示三个独立实验的平均±S.D。面板B，NMuMG细胞，转染shRNA特异性蜗牛1（mshRNA，见补充“方法”)或用TGF-β孵育扰乱对照，并用Western blot或RT-PCR分析指示基因的表达。该图显示了三个实验的代表性Western blot或平均±S.D(B类).面板C，NMuMG细胞转染pcDNA3-Zeb1和pcDNA3-Snail1-HA或空质粒。在加入CHX之前，细胞也与TGF-β孵育24小时。细胞培养基中添加CHX以阻止蛋白质合成，在指定时间后制备蛋白质提取物并进行Western blot分析。65%的抑制Zeb1号机组用鼠抗蜗牛1的siRNA代替图中的shRNA，在12小时时获得RNA诱导。
图2。
图2。
蜗牛1控件Zeb1号机组信使核糖核酸水平。 面板A和B类，RNA是从稳定转染Snail1-HA或感染表达人逆转录病毒的所示细胞系中制备的蜗牛1shRNA(hshRNA1)或加扰的对照shRNA。通过qRT-PCR测定指示基因的表达。数值表示为蜗牛1对对照细胞的折叠刺激（用空质粒转染）(一个)或相对于感染对照shRNA的细胞的表达百分比(B类). 另一人Zeb1表达受到45%和55%的抑制蜗牛1shRNA(hshRNA2)分别位于MiaPaca-2和SW-620。面板C，1004/+29的活动ZEB1号机组在转染稳定表达Snail1-HA或用TGF-β处理48小时的所示细胞系后，确定启动子。系统地包括三种硅酸盐，并重复至少三次实验。该图显示了3-5个实验的平均±S.D。表达Snail1的细胞获得的值与具有对在RWP1细胞和对SW-480和NMuMG细胞<0.05；NMuMG和TGF-β处理的NMuMG-细胞之间的差异也存在统计学差异(对< 0.05).面板D和E类，RNA是从RWP1、RWP1-Snail1中制备的(D类)或用TGF-β处理1或24小时的NMuMG细胞(E类). 当需要时，使用特定的siRNA抑制NMuMG细胞中Snail1的表达(msiRNA基因). miR-200的表达按照“实验程序”所示进行测定。作为对照，验证未扩增DNA。分析山松醇进行RNA检测以确定使用了等量的RNA。
图3。
图3。
Twist和Snail1在Zeb1表达中合作。5微克扭转1将hshRNA1或非靶向控制载体转染到RWP-1蜗牛1(面板A)、SW-620或MiaPaca-2细胞(面板B). 用嘌呤霉素（2.5μg/ml）筛选转染细胞群，并通过定量分析(一个)或半定量RT-PCR(B类). 另一个获得了类似的结果扭转1shRNA(hshRNA2)在RWP-1蜗牛1细胞中ZEB1号机组表达率为55%。面板C，用含有Twist或Snail1 cDNA的表达质粒转染RWP-1细胞；用G418筛选细胞群体，并通过RT-PCR分析所示基因的表达。面板D，用所示cDNA和pGL3瞬时转染RWP-1细胞-ZEB1号机组发起人。48小时后测定萤光素酶活性。该图显示了结果的平均±S.D(D类)或进行三个代表性实验(A、 B类、和C).
图4。
图4。
Snail1和Twist相互调节其在NMuMG细胞中的表达。 面板A和B类、NMuMG细胞表达干扰或shRNAs特异性蜗牛1或扭转1与TGF-β孵育指定时间；制备蛋白质提取物或分离RNA并用Western blot分析(世界银行) (一个)或qRT-PCR(B类).面板C和D类,扭转1核糖核酸(C)和蛋白质(D类)在转染Snail1-HA或对照质粒的RWP-1或HT-29 M6细胞中进行分析。在面板E如有必要，NMuMG细胞经TGF-β处理24小时，或向体外表达Snail1的RWP1细胞或对照质粒补充CHX以阻断蛋白质合成。在指定时间后制备蛋白质提取物，并通过Western blot进行分析。图中显示了具有代表性的结果(一个和D类)或平均±范围(B类,C、和E类)进行了两次实验。
图5。
图5。
Twist和Ets1与Zeb1启动子中的不同元件相互作用。 面板A和E类、扭曲分析(一个)或其他1(E类)绑定到中指定的元素ZEB1号机组启动子由ChIP按照“实验程序”进行面板B如前所述，在SW-620、RWP-1对照或转染蜗牛1的RWP-1中测定−1004/+29或−147/+29 DNA片段的启动子活性。Snail1转染细胞和Snail1细胞之间的差异具有统计学意义对对于−1004/+29启动子和对−147/+29启动子<0.05。两个启动子的活性差异也很显著(对<0.05）。面板C、SW-620或RWP-1蜗牛1细胞转染，对照组为ETS1型-特异性shRNA（hshRNA1）。另一种方法也获得了类似的效果ETS1型SW-620细胞中的shRNA（hshRNA2）导致ETS1型RNA水平。选择后，获得RNAETS1型和泽布1通过qRT-PCR测定。面板D用TGF-β处理指定时间的NMuMG或RWP-1对照，制备细胞核和细胞组分，并用Snail1转染。在细胞核中测定指示蛋白质的水平(NMuMG公司)或核和细胞溶质部分（RWP1细胞）。聚ADP-核糖聚合酶(PARP项目)-1和拉明B被用作核分数的对照；丙酮酸激酶(派克)，用于细胞溶质部分。此图中的结果与代表性结果相对应(面板C)或三个实验的平均±S.D。
图6。
图6。
Snail1和TGF-β对Zeb1表达的不同调节水平的方案。TGF-β上调蜗牛1的表达，增加了作用于不同水平的Zeb1蛋白：1）它减少了miRNA200的表达，从而破坏了Zeb1号机组RNA；2） 通过抑制参与Zeb1降解的未知泛素连接酶的功能，刺激Zeb1蛋白的稳定性；和3）激活Zeb1号机组基因转录。这种刺激是由两个转录因子Twist和Ets1的激活介导的，它们结合在Zeb1号机组发起人。蜗牛1也会上调调节Zeb1号机组在几个水平上的转录，因为它促进Ets1向细胞核的移位，增加Twist蛋白的稳定性，并且是刺激扭转1TGF-β引起的RNA。此外，TGFβ对蜗牛1的全面上调也需要Twist表达（由虚线).
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