Developmental regulation of MURF ubiquitin ligases and autophagy proteins nbr1, p62/SQSTM1 and LC3 during cardiac myofibril assembly and turnover

doi:10.1016/j.ydbio.2010.12.024

.2011年3月1日；351(1):46-61.

doi:10.1016/j.ydbio.2010.12.024。 Epub 2010年12月23日。

心肌肌原纤维组装和周转过程中MURF泛素连接酶和自噬蛋白nbr1、p62/SQSTM1和LC3的发育调控

苏·佩雷拉¹, 马克·R·霍尔特, Baljinder S Mankoo公司, 马蒂亚斯·高特尔

附属公司

PMID： 21185285
PMCID公司：项目经理3047806
内政部： 2016年10月10日/j.ydbio.2010.12.024

心肌肌原纤维组装和周转过程中MURF泛素连接酶和自噬蛋白nbr1、p62/SQSTM1和LC3的发育调控

苏·佩雷拉等。求文献一篇. 2011.

.2011年3月1日；351(1):46-61.

doi:10.1016/j.ydbio.2010.12.024。 Epub 2010年12月23日。

作者

苏·佩雷拉¹, 马克·R·霍尔特, Baljinder S Mankoo公司, 马蒂亚斯·高特尔

附属

¹英国伦敦SE1 1UL盖伊校区纽亨特之家细胞和分子生物物理Randall分部和心血管分部伦敦国王学院BHF卓越研究中心。

PMID： 21185285
PMCID公司：下午3047806
内政部： 2016年10月10日/j.ydbio.2010.12.024

摘要

纹状体肌肉特异性三分基序（TRIM63/MURF1、TRIM55/MURF2和TRIM54/MURF3）蛋白在泛素介导的肌肉蛋白周转中起泛素E3连接酶的作用。尽管MURF在肌肉萎缩中起着独特的作用，但其在横纹肌发育和出生后早期适应性中的表达动态在很大程度上尚不清楚。在此，我们发现MURF2在胚胎第8.5天小鼠心脏分化开始时表达，并代表分化心肌的敏感标记。在心脏发育过程中，表达从50kDa转移到60kDa A亚型，这在出生后占主导地位。相反，MURF1在出生后表现出强烈的上调，而MURF3在出生前没有显著表达。MURF2的表达与自噬相关蛋白LC3、p62/SQSTM1和nbr1的表达相似。新生大鼠心肌细胞中MURF2的SiRNA敲低破坏了翻译后微管修饰和肌原纤维组装，并且仅通过上调MURF3而非MURF1进行部分补偿。MURF2和MURF3的敲除严重破坏了有序Z带和M带的形成，可能是由于微管蛋白动力学的扰动。这些结果表明，泛素介导的蛋白质周转，尤其是MURF2在心肌分化的早期步骤中发挥着未被认识的作用，MURF3提供了MURF2缺陷的部分补充。

PubMed免责声明

数字

**补充图7**
在缺乏MURFs 2和3的心肌细胞中过度表达MURF2可以挽救NRC中的肌原纤维结构。

图1
MURF家族成员和相关UPS/自噬蛋白在心脏中的发育表达。A.从胚胎（E）到出生后（P）阶段小鼠心脏裂解物的Western blot分析。MURF2亚型标记为p50A和p60A（此处：用山羊抗MURF2检测）全长SRF（FL）和抑制亚型SRF-Δ5。B.针对GAPDH水平归一化的Western blot的密度分析图。用全长MURF2和MURF1引物对从小鼠心脏分离的cDNA进行RT-PCR，显示MURF2的发育调节水平和剪接变异体表达。D.从3组独立实验获得的RT-PCR数据图显示MURF1表达的晚发性；误差线表示标准偏差。对GAPDH表达E的数据进行归一化。Western blot显示出生后第9天和成年期左心室（LV）和左心房（LA）之间MURF2 p50A和p60A亚型的差异表达。E：胚胎日；P：产后日；Wk：周。

图2
小鼠胚胎心脏全山制剂展示体内将MURF2组织为M波段。A–B类。MURF2广泛表达于E8.5初级心脏管的气球状区域（红色箭头）。虽然α-肌动蛋白染色在此阶段显示有组织的Z带，但MURF2染色没有明显的条纹（插入B）。C–D。在E9.5，MURF2在环状心脏中强烈表达（C中的红色箭头），并变为M带相关，如α-肌动蛋白阳性Z带之间的交替染色所示（D，底部插图），尽管在α-肌动蛋白染色组织较少的区域，MURF2的表达更具点状（D，顶部插图）。E–F。MURF2仍然强烈表达（E，红色箭头），并且更普遍地在E10.5环状心脏（F，底部插入物）中是肉质的，在含有非输送α-肌动蛋白（F，顶部插入物）的区域中保留非输送模式。BA=鳃弓，A=未来心房，V=未来心室，OFT=流出道，LA=左心房，LV=左心室。在该图的所有面板中，白色箭头表示插图框中放大2倍的区域。

图3
MURF2在心肌肌原纤维生成过程中与体内微管蛋白相关。A.MURF2与α-微管蛋白在E8.5共同定位于未成熟肌原纤维形成区域，白色箭头位于上部放大区域（放大2倍）。在出现规则的α-肌动蛋白交叉条纹的区域，这种共生作用消失了（放大区域下方的白色箭头）。B.在E9.5处观察到MURF2和所有微管蛋白的类似模式，并且仍局限于组织α-肌动蛋白的区域（C）。D.MURF2与稳定的谷氨酰化微管集共定位（此处为E9.5，左侧放大图），尤其是在未成熟肌原纤维发生区（右侧放大图）。

图4
MURF2 p50A或p60A的siRNA敲低会导致心肌细胞中的肌聚体断裂。用改良的H1-GFP质粒表达的MURF2亚型特异性siRNAs转染新生大鼠心肌细胞。转染细胞通过GFP的表达进行鉴定。用抗所有A亚型的HPC抗体检测MURF2-A亚型。用HP60抗体特异性检测MURF2 p60亚型。A–B类。p50A特异性敲除导致转染48小时后NRC中M带（肌膜蛋白）和Z带（α-肌动蛋白）的紊乱，如规则条纹（插入物）的丢失所示。α-肌动蛋白染色模式是典型的新生肌原纤维。C–D。p60A特异性敲除也观察到类似的紊乱，但在较少的细胞中。A–D中的白色箭头表示插图中放大的区域。

图5
MURF2 p50A敲除破坏NRC中的微管翻译后修饰。A.p50A的缺失导致稳定的谷氨酰化微管群的水平降低。B.乙酰化微管几乎没有变化。C.相反，在p50A水平耗尽的NRC中，动态酪氨酸化微管池被强烈上调。转染细胞通过GFP表达进行鉴定（分离通道中的红色星号）。D.对每次治疗50个细胞的不同微管蛋白染色的每个转染细胞的平均强度进行量化（见材料和方法）。误差条表示标准误差。采用单因素方差分析进行统计分析（glu-tub减少p<0.001，tyro-tub增加p<0.006）。乙酰基亚基的变化不显著。

图6
MURF-家庭成员可以显示部分补偿*在体外*A.NRC中MURF2-A p50A的敲除导致MURF3上调。通过GFP表达（分离通道中的红色星号）鉴定siRNA转染的细胞，并显示MURF3水平增加。B.降低MURF2-A水平不会导致增加MURF1水平。C.比率成像显示MURF2敲除细胞中MURF3上调。D.对照siRNA构建物不会影响MURF3与肌凝蛋白的比率。GFP、内源性肌球蛋白和MURF3的单独通道，以及用于转染细胞轮廓的覆盖GFP掩模的比率图如C和D所示。假彩色刻度范围指示器显示的比率范围为0（黑色）到3（白色）。比例尺：10μm。E.比率分析证实MURF2敲除下的MURF3上调非常显著（p<0.0001）。数据基于每次治疗50多个心肌细胞。

图7
MURFs 2和MURFs 3的双重敲除导致成熟的肉质结构广泛丢失。A.表达MURF2+3特异性siRNA的新生大鼠心肌细胞减少了MURF2和-3的表达。B.两个MURFs的两次击倒（如图所示：MURF2）严重破坏了M波段组件。C.在缺乏MURF2和3的细胞中，Z带也同样被破坏。D.与未转染和对照siRNA转染细胞相比，表达siRNA的心肌细胞中成熟肌体结构的百分比；误差条代表3个独立实验的SE，每个实验的细胞数超过50个。采用单因素方差分析进行统计分析（*=p<0.05；**=p<0.01；**=p<0.001）。未转染和对照siRNA转染细胞之间没有显著差异。

图8
MURF2和-3的缺失导致不同微管修饰的中断。A–C。表达MURF2+3的NRC特异性siRNA具有还原的谷氨酰化（Glu-tub）、乙酰化（Acetyl-tub”）和酪氨酸化（Tyr-tub）微管（用星号标记）。D.平均强度量化证实，与对照组相比，翻译后修饰微管的所有亚群均显著减少，但谷氨酰化微管蛋白受影响最严重。数据表示超过60个细胞±SE的平均微管蛋白强度。单因素方差分析用于统计分析（*=p<0.05；***=p<0.001）。

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