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.2010年5月26日；30(21):7377-91.
doi:10.1523/JNEUROSCI.0924-10.2010。

半胱氨酸串蛋白-α防止GABA能突触活动依赖性变性

巴勃罗·加西亚·朱科·克莱门特 1, 格洛丽亚·坎特罗, 莱昂纳多·戈梅斯·桑切斯, 佩德罗·利纳雷斯-克莱门特, 何塞·A·马丁内斯·洛佩斯, 拉斐尔·卢扬, 拉斐尔·费尔南德斯·查科
附属公司

半胱氨酸串蛋白-α防止GABA能突触活动依赖性变性

巴勃罗·加西亚·琼科·克莱门特等。 神经科学. .

摘要

可以看出，神经递质的持续释放给突触前蛋白带来了持续的负担，这可能会损害神经末梢功能。这种假设和可能保护高度活跃突触的分子机制值得研究。在缺乏突触前耳蜗半胱氨酸串蛋白α（CSP-alpha）的敲除小鼠的海马培养物中，我们观察到高活性突触结合蛋白2（Syt2）表达的GABA能突触进行性退化，但令人惊讶的是谷氨酸能终末没有退化。在CSP-alpha基因敲除小鼠中，当齿状回颗粒细胞上存在正常的谷氨酸能突触时，篮子细胞终末的突触变性在体内发生。与此一致，在这些小鼠的海马培养物中，由自发GABA释放引起的微型IPSC的频率逐渐下降，而由自发谷氨酸释放引起的小型兴奋性AMPA受体介导电流（mEPSCs）的频率是正常的。然而，mEPSC振幅逐渐减小。值得注意的是，在缺乏CSP-alpha的培养物中长期阻断谷氨酸能传递，可以有效地将表达Syt2的GABA能突触从神经退化中拯救出来。这些发现表明，神经活动增强会增加突触的脆弱性，CSP-alpha在生理性高活动方案下对维持突触前功能至关重要。

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数字

图1。
图1。
CSP-α缺失时突触总数逐渐减少。A类，三个不同时间点WT和CSP-αKO神经元培养物中MAP2（绿色）和突触蛋白（白色）表达的共焦图像。B与WT培养物相比，CSP-αKO中的突触蛋白/MAP2比率仅在30 DIV时降低。误差条显示SEM。C类，GABA能（抗GAD65；绿色；星号）和谷氨酸能（抗VGLUT1；白色或红色；箭头）突触点的共聚焦图像表明30 DIV时CSP-αKO培养物中GABA能点的比例下降。
图2。
图2。
CSP-αKO海马神经元培养中GABA能突触点的逐渐减少。在用抗突触素brevin 2/VAMP2（绿色；星号）和抗VGAT（白色和红色）抗体标记的11 DIV的WT和CSP-αKO海马神经元培养物的两种不同放大倍数的共聚焦图像中，在与非GABA能突触点（星号）共存的共定位点（箭头）识别GABA能的突触点。A类在11 DIV时，WT和CSP-αKO培养物中GABA能点的百分比相似。B，在30DIV时，与野生型培养物（42.5%）相比，CSP-αKO中GABA能点的百分比显著降低（21.6%）。
图3。
图3。
培养中GABA能和谷氨酸能突触的超微结构分析。野生型谷氨酸能和GABA能突触的电镜显微照片(A–G)和KO(H–M)神经元培养。A–G在WT中，GABA能轴突终末（inh）与细胞体（胞体）和树突轴（Den）建立抑制性突触，谷氨酸能轴突末梢（b）与海马神经元的树突轴和棘建立兴奋性突触。H–M在KO中，还检测到GABA能（inh）和谷氨酸能（exc）轴突终末，但GABA能轴突终末梢的尺寸通常小于WT中的尺寸。比例尺为0.5μm。WT和KO培养液中谷氨酸能突触的密度没有变化，但KO培养物中GABA能突触显著减少（见结果）。
图4。
图4。
在缺乏CSP-α的培养物中，Syt2-阳性GABA能突触显著减少。A类在两种不同放大倍数的海马神经元培养物上，用抗VGAT（红色）和抗Syt2（绿色）抗体标记的共聚焦图像确定了在WT培养物中GABA能突触点与Syt2共定位（箭头）而不是共定位（星号）。在CSP-αKO培养物中，存在GABA能点（星号），但不存在Syt2-阳性点。在WT培养中，30 DIV时共定位VGAT/Syt2阳性点的百分比为55.2±2.7%(n个=4种培养物；60个字段）。在CSP-αKO培养基中，未检测到Syt2-阳性斑点(n个=4种培养物；60个字段）。B，WT神经元培养物共聚焦图像的最大投影显示Syt2-（绿色）和PV-阳性斑点（红色）。大多数Syt2阳性点状细胞来自PV阳性神经元（虚线边界矩形），只有少数斑点没有Syt2/PV共定位（连续边界矩形）。该图像不具有代表性，它被选为显示不与PV共定位的罕见Syt2突触。C类左，与WT相比，用抗MAP2抗体标记的CSP-αKO神经元的数量显著减少（平均密度：18-20 DIV WT，15.3±1.8个神经元/mm2,n个=2个培养基，10个盖玻片；KO，16.6±2.3个神经元/mm2,n个=2个培养物，10个盖玻片，无显著差异；36–39 DIV WT，11.6±1.3个神经元/mm2,n个=2个培养基，12个盖玻片；KO，8.1±1.0个神经元/mm2,n个=2个培养基，12个盖玻片；第页=0.045，学生的t吨测试）和不同时间点KO文化之间(第页=0.002，学生的t吨测试）。用抗CR抗体标记的WT和CSP-αKO神经元数量中度、类似的渐进性减少（平均密度：18-20 DIV WT，2.1±0.3个神经元/mm2,n个=2个培养基，10个盖玻片；KO，2.2±0.6个神经元/mm2,n个=2个培养基，10个盖玻片；36–39 DIV WT，1.1±0.2个神经元/mm2,n个=2个培养基，12个盖玻片；KO，1.0±0.2个神经元/mm2,n个=2个培养基，12个盖玻片）。对，WT中PV表达神经元数量的逐渐减少与CSP-αKO培养中未检测到PV阳性神经元形成对比（WT中18–20 DIV的平均密度：0.6±0.1个神经元/mm2,n个=3个培养基，8个盖玻片；36–39 DIV:0.4±0.1个神经元/mm2,n个=3个培养基，11个盖玻片；第页≤0.001，Mann–Whitney秩和检验）。误差条表示SEM。
图5。
图5。
CSP-αKO海马突触Syt2和PV标记减少和篮细胞终末变性。A类,B，来自WT的共焦图像(A类)和CSP-αKO(B)海马切片标记有抗Syt2（绿色）和抗PV（红色）抗体。体视学分析显示，在P31-P40，CSP-αWT和CSP-βKO海马体PV阳性体（箭头）的数量没有差异。然而，请注意锥体层和颗粒细胞层中突触标记（箭头）的强度不同。Syt2染色也在腔隙分子层（点）检测到。通过标签配置文件z（z）-axis显示同质抗体穿透整个切片。C–D类〃，WT中的CA1区域(C–C〃）和KO(D–D〃）海马切片。在KO地层金字塔（星号）中可以看到较弱的Syt2（绿色）和PV（红色）标记。E–F〃，WT中的齿状回(E–E〃）和KO(F–F″). CSP-αKO中PV-阳性点状细胞减少（星号）。来自四名WT和四名KO室友的数据。G–L，兴奋性的EM分析(小时,L（左）)和抑制(G公司,I–K型)齿状回中的突触。在WT中，GABA能轴突末端（bt）(G公司)在颗粒细胞体（GC）周围建立GABA能突触的篮子细胞的突触大小适中，充满突触小泡。在CSP-αKO小鼠中(I–K型)，这些终末较小，突触小泡较少。相反，谷氨酸能轴突终末（b）与齿状回分子层中的树突状轴（Den）或棘（s）建立兴奋性突触，或与躯体抑制性突触接近，两者在WT中几乎相似(小时)和CSP-αKO(L（左）)老鼠。SO，oriens地层；SP，金字塔层；SR，辐射层；ML，分子层；GCL，颗粒细胞层。
图6。
图6。
CSP-αKO小鼠出生后Syt2和PV海马蛋白水平下降。A类，用CSP-α、Hsc70、Syt2、PV、syntobrevin 2/VAMP2（Syb2）、syntotagmin 1（Syt1）和α-actin抗体标记的P16、P20、P28和P32的WT和CSP-a-αKO小鼠海马蛋白的代表性免疫印迹。B，通过直接化学发光测量和相对于α-肌动蛋白水平评估标准化蛋白质水平。数据绘制为平均值±SEM；n个=每个基因型和每个标记4个；统计显著性由Student’st吨测试。
图7。
图7。
30 DIV时CSP-αKO海马培养物中mIPSC频率降低，但幅度不变。A类,C类30和11 DIV时WT和KO神经元培养中的mIPSC；荷包牡丹碱可逆地废除了mIPSC。B，30DIV时WT和KO海马神经元培养物的mIPSC振幅的直方图和累积分布。插图，两种基因型的平均mIPSC轨迹。D类11 DIV.插图中WT和KO海马神经元培养物mIPSC振幅的直方图和累积分布，两种基因型的平均mIPSC轨迹。
图8。
图8。
AMPAR介导的mEPSC在长期CSP-αKO海马培养物中的下调。A类CSP-αKO培养物中AMPAR介导的mEPSCs的正常频率与30 DIV NBQX培养物中WT的正常频率相比可逆阻断了AMPAR mEPSCs。B在30 DIV条件下，CSP-αKO培养物中AMPAR介导的mEPSCs的大小显著减少。两种基因型的直方图和振幅累积分布（误差条表示SEM）。基因型和叠加归一化KO反应的插入平均AMPAR mEPSC波形均无动力学差异。C类，11 DIV时两种基因型AMPAR介导的mEPSCs的正常频率。D类，两种基因型的直方图和振幅累积分布显示，在11个DIV的CSP-αKO和WT培养物中，AMPAR介导的mEPSC的大小相似。插图，两种基因型的平均AMPAR-mEPSC波形（误差条表示SEM）。
图9。
图9。
在没有CSP-α的情况下AMPAR mEPSCs的乘法降尺度。A类30 DIV时WT和CSP-αKO神经元培养中的NMDAR mEPSCs。B，WT和KO培养物在30 DIV插入时NMDAR mEPSC振幅的直方图和累积分布，基因型和重叠归一化反应的平均NMDAR m EPSC轨迹。C类左，根据排名CSP-αKO AMPAR mEPSC振幅绘制排名控制AMPAR m EPSC振幅。定义了加法、随机加法或乘法函数数据的最佳拟合。最佳拟合：KO=WT×0.43−1.14（乘法函数）。右，WT和KO AMPAR mEPSC的累积振幅直方图。WT分布根据前面的乘法函数进行变换，并与KO数据一起绘制。D类，左，根据分级KO mIPSC振幅绘制的分级控制mIPSC幅度。数据的最佳拟合是一个斜率为0.97的乘法函数（KO=WT×0.97−2.78）。右，WT和KO NMDAR mEPSC振幅比较的类似图。最佳拟合：KO=WT×1.1+1.57（乘法函数）。接近1的斜率表明CSP-αKO培养物中mIPSC和NMDAR-mEPSC的大小没有增加。
图10。
图10。
长期阻断谷氨酸能突触传递后，在缺乏CSP-α的培养物中GABA能突触点的恢复。A类谷氨酸能传播阻断3周后，30 DIV时WT和KO神经元培养物突触前染色的突触素2/VAMP2和VGAT共聚焦图像。B在KO培养物中谷氨酸能阻断后30 DIV处Syt2突触标记的恢复(n个=3种培养基）。右侧面板显示左侧面板中选定区域的放大，但面板CSP-α（控制）除外，其中右侧面板的亮场图像显示存在无标记神经元。
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