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神经科学杂志。2010年5月26日；30(21): 7377–7391.
数字对象标识：10.1523/JNEUROSCI.0924-10.2010
预防性维修识别码：PMC6632397型
PMID：20505105

半胱氨酸链蛋白-α防止GABA能突触中活性依赖性退化

巴勃罗·加西亚·琼科·克莱门特,1 格洛丽亚·坎特罗,1,* 莱昂纳多·戈梅斯·桑切斯,1,* 佩德罗·利纳雷斯-克莱门特,1 何塞·马丁内斯·洛佩斯,1 拉斐尔·卢扬,2和拉斐尔·费尔南德斯·查康通讯作者1
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

可以看出，神经递质的持续释放给突触前蛋白带来了持续的负担，这可能会损害神经末梢功能。这种假设和可能保护高度活跃突触的分子机制值得研究。在缺乏突触前耳蜗半胱氨酸串蛋白-α（CSP-α）的敲除小鼠的海马培养物中，我们观察到高活性突触结合蛋白2（Syt2）表达的GABA能突触进行性退化，但令人惊讶的是谷氨酸能终末没有退化。在CSP-α基因敲除小鼠中，篮细胞终末发生突触变性体内在齿状回颗粒细胞上存在正常的谷氨酸能突触。与此一致，在这些小鼠的海马培养物中，由自发GABA释放引起的微型IPSC的频率逐渐下降，而由自发谷氨酸释放引起的小型兴奋性AMPA受体介导电流（mEPSCs）的频率是正常的。然而，mEPSC振幅逐渐减小。值得注意的是，在缺乏CSP-α的培养物中长期阻断谷氨酸能传递，可以有效地将表达Syt2的GABA能突触从神经退化中拯救出来。这些发现表明，神经活动增强会增加突触的脆弱性，CSP-α在生理高活动方案下对维持突触前功能至关重要。

介绍

众所周知，神经末梢通过释放神经递质和循环突触小泡的特殊分子机制实现快速的神经元通讯(苏霍夫，2004). 这就提出了一个问题，即维持的突触活动是否会对损害突触完整性的神经终端造成负担。半胱氨酸串蛋白-α（CSP-α）是一种突触囊泡蛋白，含有Hsp40家族耳蜗的典型DNAJ结构域(冈德森和乌姆巴赫，1992年;Schmitz和Fernández-Chacón，2009年). CSP-α最初被认为是突触囊泡融合或通过电压依赖性通道调节钙内流的一种必需元素(冈德森和乌姆巴赫，1992年;Umbach等人，1994年;Zinsmaier等人，1994年). 然而，最近，它被认为是突触分子机制的关键元素，该机制致力于拯救由活动依赖性应激所揭示的突触蛋白(Fernández-Chacón等人，2004年;Chandra等人，2005年). 由于神经功能缺陷，缺乏CSP-α的小鼠存活<3个月(Fernández-Chacón等人，2004年). 在出生后早期发育期间，CSP-α对Held花萼的神经递质释放不是必需的，但在以后的年龄，由于突触前终末的神经退行性变，CSPα的缺失会导致神经递质的释放不足(Fernández-Chacón等人，2004年). 最快的突触变性发生在感光带突触中，到出生后第14天时会严重受损（P14）(Schmitz等人，2006年)而神经肌肉接头处的退化发展较慢(Fernández-Chacón等人，2004年;Ruiz等人，2008年). 这些观察结果表明，由于突触囊泡的强烈循环，例如感光细胞中发生的循环，CSP-α在膜运输量较大的突触中的需求可能更大(斯特林和马修斯，2005年)或专门在高频下传递快速可靠信号的突触，如Held的花萼(Joshi和Wang，2002年). 然而，关于突触活动是退化表型的主要原因的实验证据仍然缺乏。有趣的是，可溶性N个-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体（SNARE）复合物(Fasshauer等人，1998年;苏霍夫，2004;Rizo和Rosenmund，2008年)CSP-α基因敲除小鼠脑内SNAP25蛋白水平显著降低，SNARE复合体变得不稳定(Chandra等人，2005年). 值得注意的是，α-突触核蛋白的过度表达部分恢复了SNARE复合体的稳定性，表明CSP-α和α-突触核蛋白协同伴侣SNARE复合物(Chandra等人，2005年). 然而，尽管令人信服的生物化学数据表明CSP-α在大脑中具有普遍作用，但对其在小中枢突触中的作用研究甚少。在这里，我们使用来自缺乏CSP-α的小鼠的长期海马培养物来揭示GABA能突触群发展为进行性神经退行性表型。相反，谷氨酸能突触对CSP-α的丢失不太敏感，但间接经历了稳态可塑性变化，这可能会补偿GABA能量输入的丢失。值得注意的是，我们发现GABA能突触的退化可以通过谷氨酸能阻滞剂对网络兴奋性的药理学降低来部分修复。这些观察结果表明，高突触活性增加了神经末梢的脆弱性，CSP-α是在这些条件下防止突触衰竭的关键因素。

材料和方法

神经细胞培养。

初级海马神经元的制备基本上如前所述(Fernández-Chacón等人，2001年)来自P0野生型（WT）和CSP-α敲除（KO）同卵小鼠(Fernández-Chacón等人，2004年)并在含有抗生素的化学定义培养基（补充谷氨酰胺和B-27；Invitrogen）中培养40天。每4天更换一部分培养基。将神经元放在盖玻片上，盖玻片覆盖有连续的（无微粒）大鼠星形胶质细胞饲养层，饲养层用有丝分裂抑制剂FUdR（氟脱氧尿苷）处理，密度为35000个细胞/孔。为了剥夺谷氨酸能活性，将神经元培养物与25μ米(对)-氨基-5-磷酸（APV）和10μ米2,3-二羟基-6-硝基-7-氨磺酰-苯并[如果]喹喔啉-2,3-二酮（NBQX），为期3周，从第10天到第30天在体外（DIV）。每天添加药物，每4天更换部分培养基。

组织准备。

在用2%三溴乙醇（0.15 ml/10 mg）深度麻醉后，对照组和CSP-α突变小鼠经心灌注0.1米PBS，pH 7.4，然后在0.1中加入4%多聚甲醛（PFA）米磷酸盐缓冲液（PB），pH 7.4。取出大脑，在4°C的4%PFA中后固定6-8小时，在30%蔗糖中冷冻保护，然后在冷冻切片机上在冠状面以40μm的厚度切片。所有动物实验均按照美国国立卫生研究院（NIH）的要求进行实验动物护理和使用指南并经塞维利亚大学动物使用研究委员会批准。

免疫细胞化学。

海马神经元培养物在4%PFA中固定30分钟，用PBS冲洗三次，然后用0.3%Triton X-100渗透5分钟，然后再用PBS冲洗3次2小时，然后在4°C下与不同的一级抗体孵育过夜，然后在PBS中进行三次洗涤。然后在室温下应用Alexa 488-结合山羊抗鼠（1:1000；Invitrogen）和Cy3-结合山羊抗兔（1:1000，Jackson ImmunoResearch）二级抗体2小时，随后进行三次PBS洗涤。使用ProLong Gold防褪色试剂（Invitrogen）安装盖玻片，并使用共焦显微镜（Leica TCS-SP2）进行检查。将海马切片用0.5%Triton X-100透化10分钟，用PBS漂洗三次，并在2%正常FBS、0.1%Triton X-100的PBS中封闭1小时。然后将切片与不同的一级抗体在4°C下孵育过夜，然后在PBS中洗涤三次。Alexa 488缀合的山羊抗小鼠（1:1000；Invitrogen）然后在室温下应用Cy3-共轭山羊抗兔二级抗体（1:1000；Jackson ImmunoResearch）1小时，然后进行三次PBS洗涤。将切片安装在载玻片上，并用ProLong Gold防褪色试剂（Invitrogen）覆盖。

初级抗体。

本研究中使用了以下小鼠单克隆初级抗体和浓度：谷氨酸脱羧酶65（GAD65）（GAD-6；1:1000；由D.I.Gottlieb博士开发（密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院）并从国家儿童健康和人类发展研究所赞助开发并由爱荷华州大学维护的发育研究杂交瘤库中获得，gephyrin（1:1000；突触系统），GluR1（1:50；Santa Cruz生物技术），MAP2a-b（1:1000，Millipore生物科学研究试剂），突触短肽2/VAMP2（Cl69.1；1:1000；突触系统）和突触结合蛋白2（znp-1；1:200；斑马鱼国际资源中心，由美国国立卫生研究院国家研究资源中心拨款P40 RR012546支持）。使用了以下兔多克隆初级抗体和浓度：钙调素（CR）（1:1000；Swant），CSP[R807；1:1000；Thomas Südhof博士（加利福尼亚州帕洛阿尔托斯坦福大学医学院）慷慨捐赠(Fernández-Chacón等人，2004年)]，parvalbumin（PV）（1:1000；Swant），突触蛋白[E028；1:1000；Thomas Südhof博士慷慨赠送(Südhof等人，1989年)]囊泡GABA转运体（VGAT）（1:1000；突触系统）和囊泡谷氨酸转运体1（VGLUT1）（1:100；突触体系）。

免疫细胞化学图像的定量分析。

使用徕卡TCS-SP2共焦显微镜（目标：HCX PL APO 40×/63×）从一系列z（z）-轴截面，然后使用NIH ImageJ软件进行分析。为了将我们的分析局限于突触点，并避免受到整体背景和弥漫性突触蛋白染色的污染，我们首先手动去除与微管相关蛋白（MAP2）染色无关的突触蛋白阳性像素。接下来，将来自红色（突触素）和绿色（MAP2）通道的灰度图像分别转换为使用相同阈值级别的二值图像。根据突触阳性像素数除以MAP2阳性像素数的比值，使用阈值图像估计突触密度。通过从阈值化红色通道（VGAT荧光）和阈值化绿色通道（synaptobevin 2/VAMP2荧光）中减去像素来计算GABA能突触的比例（百分比）。减法后留下的像素被认为是非GABA能突触。使用GAD65和突触素抗体进行了类似的实验。通过分割阈值GAD65和VGLUT1信号，建立了GABA能和谷氨酸能点刺之间的关系。使用与奥林巴斯BX61显微镜相关联的计算机辅助体视工具箱（CAST）软件量化培养中不同神经元的数量。MAP2信号显示神经元总数。使用MAP2和PV抗体对PV阳性中间神经元进行双重标记。使用MAP2和CR抗体鉴定CR阳性中间神经元。为了计算synaptotagmin 2（Syt2）阳性GABA能突触的百分比，从红色通道的阈值VGAT荧光中减去绿色通道的阈值Syt2荧光。在缺乏活动的培养物中，抗突触蛋白抗体检测到的荧光信号强度较弱。在这些条件下，共焦显微镜检测荧光所需的激光功率高于用于分析未处理培养物的激光功率。在任何情况下，激光强度总是相同的，以比较处理的WT和处理的KO培养物。

体视学分析。

根据光学解剖仪方法，使用Olympus BX61显微镜（Olympus）对过氧化物酶标记的PV免疫阳性细胞进行定量。CAST-Grid软件包（奥林巴斯）生成了具有已知帧面积（aF）的采样帧，并引导机动化X–Y阶段（先前的Proscan；先前的科学仪器）。通过海马体的整个前后轴，每隔七个截面（280μm的距离）对神经元数量进行量化。在每只动物中测量了9到12个连续切片。使用4倍物镜确定整个海马体的一侧，使用40倍物镜计算神经元数量。免疫阳性细胞的数值密度（ND）（以每立方毫米细胞为单位）使用以下表达式估计：

方程式图像

哪里我是解剖器计算的体剖面数，n个是分析的截面数，F类是每个切片的帧数，aF是帧的面积（15686.7μm2)，SF是样品的体积收缩系数，如前所述测定(Jinno等人，1998年). 平均面积收缩系数为0.95，平均厚度收缩系数为0.80。神经元密度通过样本的平均体积收缩因子（0.76）进行校正，这与对照组和突变组的脑切片相同。

定量免疫荧光强度。

使用Olympus Fluoview FV1000共焦显微镜（目标：PLAPON 60×；数值孔径1.42）获取图像。每个区域（CA1和海马齿状回）和每个基因型收集两个光学切片间距为1.4μm的堆栈。由激光功率决定的光照强度对每窝幼崽来说总是相同的。使用NIH ImageJ软件的Analyze particles模块对图像进行分析。首先，将来自红色（PV）和绿色（Syt2）通道的灰度图像分别转换为使用相同阈值水平的每个基因型的二值图像。使用每个堆栈的阈值图像（每个堆栈总共约36张图像）和分析粒子模块计算点滴密度。为了避免背景污染，点子的最小尺寸设置为10像素。为了分析小白蛋白染色，将最大斑点大小设置为200像素，以排除体脂蛋白染色。然后，使用SPSS统计软件对收集的数据进行分析。

Colocalization分析。

使用ImageJ插件通过强度相关分析研究突触标记之间的共定位程度：http://www.uhnres.utoronto.ca/facilities/wcif/imagej/color_analysis.htm#_ftn1，根据的研究Li等人（2004）简单地说，针对每个像素，每个通道（12位灰度，垂直轴）的像素强度绘制为与平均值（PDM）之差的乘积：PDM=（红色强度-平均红色强度）×（绿色强度-平均绿色强度）。从该图中，获得了两个参数：计算的强度相关商（ICQ）和曼德重叠系数(对). 正ICQ值表示两个信号之间的依赖关系。对数值范围在1到0之间，数值接近1表示高度共定位。

蛋白质生物化学。

为了进行免疫印迹分析，将CSP-αWT和KO小鼠的大脑放入冰镇PBS中，提取海马，然后在裂解液中均匀化[50 m米HEPES，pH 7.4，1%Triton X-100，150 m米氯化钠，5米米EDTA，10米米纳2高功率放大器4，并补充蛋白酶抑制剂（Sigma-Aldrich）：1 m米氟化钠，1米米纳三VO（旁白）4，1米米PMSF、亮氨酸肽（2μg/ml）、抑肽酶（2μg/ml）和胃蛋白酶抑制素A（1μg/ml。使用BCA分析（Pierce）测定蛋白质浓度。使用如下抗体通过SDS-PAGE和免疫印迹分析野生型和CSP-αKO小鼠海马蛋白的等量：CSP-β（R807；1:2000）、Hsc70（3C5；突触系统；1:1500）、突触球蛋白2（znp-1；ZIRC抗体；1:1500，突触结合蛋白1（Cl 41.1；突触系统；1:2000）和α-肌动蛋白（A 2066；Sigma-Aldrich；1:5000）作为负载对照。对于定量，使用ECL Plus（GE Healthcare）显示过氧化物酶标记的二级抗体（Promega；抗鼠，1:10000；抗兔，1:15000），并使用ChemiDoc XRS系统（Bio-Rad）成像。

电生理学。

使用EPC10放大器（HEKA）进行全细胞记录。使用Pulse 8.74软件（HEKA）在1 kHz下过滤数据，并在20 kHz下采集数据。电池电压固定在−70 mV。贴片电极的电阻为2–3 MΩ。对串联电阻（75%）和单元电容（5–25 pF）进行了补偿，分析中仅包括串联电阻<10 MΩ的记录。AMPA受体（AMPAR）微诱发突触后电流（mEPSC）记录的外部溶液包含140 m米氯化钠，2.4米米KCl，10米米HEPES，10米米葡萄糖，4米米氯化钙2和4米米氯化镁2，305毫摩尔，pH值7.4。内部吸管溶液由10 m组成米氯化钠，120米米葡萄糖酸钾，10 m米HEPES，1米米K-EGTA，4.6米米氯化镁2，4米米纳2ATP，15米米磷酸肌酸和20 U/ml磷酸肌酸激酶，290 mOsm，pH 7.4。记录通常在1μ米河豚毒素，25μ米APV和25μ米荷包牡丹碱。在NMDA受体（NMDAR）mEPSC记录的情况下，外部溶液含有140 m米氯化钠，2.4米米KCl，10米米HEPES，10米米葡萄糖，2.7米米氯化钙2、和10μ米甘氨酸，305 mOsm，pH 7.4(Rosenmund等人，1993年). 内部移液管溶液与用于AMPAR-mEPSC记录的溶液相同。记录通常在1μ米河豚毒素，10μ米NBQX和25μ米荷包牡丹碱。当记录GABA受体微型IPSC（mIPSC）时，外部溶液与用于AMPA mEPSC记录的溶液相同。用于mIPSC记录的内部吸管解决方案包括135 m米氯化铯，10米米HEPES，1米米K-EGTA，4.6米米氯化镁2，4米米纳2ATP，0.3米米纳2GTP，15米米磷酸肌酸和20U/ml磷酸肌酸激酶，305mOsm和pH 7.4。用1μ米河豚毒素，10μ米NBQX和25μ米APV。所有药物均来自Ascent Scientific。所有微型突触后电流都是通过Axograph X（分子器件）程序进行分析的，该程序使用一种非常灵敏的方法，该方法基于通过与用户选择的模板进行比较来自动搜索假定的突触事件(克莱门茨和贝克，1997年). 录音首先以0.5 kHz的频率进行数字过滤。从每个记录（60秒持续时间）中手工挑选出几个（六个）随机事件，并取其平均值，以得到一个具有代表性的模板。该程序使用该模板来调整一个函数的值，该函数生成一个新的模板，该模板具有线性基底区域，随后是理想的突触时间进程。该程序使用新模板检测突触事件。mEPSC（AMPA和NMDA）的检测阈值设置为基线标准偏差的2.5倍，mIPSC的检测阈值为基线标准差的3.2倍。对单个细胞捕获的微型电流进行平均，以确定每个细胞的平均振幅和波形。通过从两种基因型记录的25个细胞中随机选择每个细胞100个微型突触后电流振幅来确定控制与CSP-αKO振幅分布之间的关系，以产生相等数量的事件。根据先前公布的方法，WT和KO事件按升序排序，然后根据WT振幅绘制KO振幅(Turrigiano等人，1998年). 在每种情况下，定义了与加法、随机加法或乘法函数数据的最佳拟合。

电子显微镜。

对两种类型的样品进行了电子显微镜处理：海马神经元培养物和从小鼠大脑中分离的海马。海马神经元培养物固定在2%PFA和1.5%戊二醛中米PB，pH 7.4，持续4 h。为了获得海马，通过腹腔注射三溴乙醇（300 mg/kg）对小鼠进行深度麻醉，并在0.1米PB，pH 7.4，然后取出大脑并解剖海马。培养物和组织样品均用PBS冲洗三次，并进行标准电子显微镜处理。这包括使用四氧化锇（0.1的1%）进行治疗米PB），乙酸铀酰块染色，梯度系列乙醇脱水，Durcupan（Fluka）树脂平包玻片。在超微切片机（Reichert Ultracut E；Leica）上在70–90 nm处切割感兴趣的区域，并收集在200目镍网格上。对1%醋酸铀酰水溶液滴加雷诺兹柠檬酸铅进行染色。超微结构分析在JEOL-1010电子显微镜中进行。为了确定WT和KO培养物中GABA能和谷氨酸能突触的相对丰度，在每个基因型的三种不同动物的培养物中进行量化。随机选择的区域在最终放大35000倍时被捕获。计算了15个细胞/动物（共45个细胞）和5个树突/细胞（共225个树突）的胞体和树突轴上GABA能突触的数量。我们还计算了10个5.25μm样本中树突轴和棘上谷氨酸能突触的数量2每只动物（总面积157.5μm2). 由于GABA能突触主要建立在树突轴上，我们计算出GABA能神经突触的密度为每100μm树突长度的数量。然而，由于谷氨酸能突触主要建立在树突棘和轴上，我们计算了谷氨酸能神经元突触的密度作为面积的函数（单位：平方微米）。我们没有研究单个样本中GABA能突触与谷氨酸能突触的相对丰度。相反，我们比较了WT和KO小鼠两种类型突触的数量。因此，用于GABA能突触和谷氨酸能突触的不同指标非常有效，在数量上对我们的目的非常有用。对三对同窝出生的小鼠（P30–P36）进行脑切片分析，包括三只KO、一只WT和两只杂合小鼠。

电子显微镜免疫组织化学。

如前所述，使用预埋免疫金法对小鼠海马CSP-α免疫反应性进行电子显微镜检查(Lujan等人，1996年). 简单地说，通过灌注4%多聚甲醛和0.05%戊二醛将大脑固定在0.1米磷酸盐缓冲液，pH 7.4。接下来，在可控震源（Leica VT1000S）上切割切片（60μm），然后在含有10%正常山羊血清（TBS-NGS）的Tris缓冲盐水中孵育1小时。封闭后，在最终蛋白浓度为1-2μg/ml、在含有1%NGS的TBS中稀释的抗CSP-α中孵养48小时。我们成功使用了两种兔多克隆抗体：R807(Fernández-Chacón等人，2004年)和154-003来自Synaptic Systems。两种抗体的突触前标记模式几乎相同。在TBS中多次清洗后，将切片在山羊抗兔IgG中孵育2小时，再将其与1.4nm金（纳米探针）在含有1%NGS的TBS中稀释1:100。在PBS中多次清洗后，将切片固定在同一缓冲液中稀释的1%戊二醛中10分钟。在双蒸馏水中清洗，然后使用HQ银试剂盒（纳米探针）对金颗粒进行银增强。然后用四氧化锇（0.1中的1%）处理切片米PB），用乙酸铀酰块染色，在梯度系列乙醇中脱水，用Durcupan（Fluka）树脂平埋在玻片上。在超切片机（Reichert Ultracut E；徕卡）上以70-90 nm的波长切割感兴趣区域，并收集在200目镍网格上。对1%醋酸铀酰水溶液滴加雷诺兹柠檬酸铅进行染色。超微结构分析在JEOL-1010电子显微镜中进行。为了测试电子显微镜程序中的方法特异性，一级抗体要么被省略，要么被一级抗体种类的5%（v/v）正常血清取代。在这些条件下，没有观察到选择性标记。

统计。

数值表示为平均值±SEM。通常，每个培养物对应不同的小鼠。图中的误差条表示SEM。

结果

CSP-αKO培养中GABA能突触的进行性和特异性减少

新生CSP-αKO小鼠海马神经元(Fernández-Chacón等人，2004年)他们的WT窝友在大鼠星形胶质细胞上培养，与小鼠星形胶质细胞相比，后者在维持长期神经元培养方面更可靠（高达40 DIV）。根据阈值化二值图像评估突触密度，即标记有一般突触前标记物（突触素）的像素数与标记有体脂蛋白标记物（MAP2）的像素之间的比率（见材料和方法）。突变体和对照神经元发育同样良好，在长达～3周的时间内观察到突触总数逐渐增加在体外（11 DIV WT:synapsin/MAP2比值，0.49±0.06，n个=2个培养基，22个字段；KO:0.48±0.05，n个=2种文化，20个领域；19 DIV重量：1.12±0.11，n个=2个培养基，20个字段；KO:0.99±0.06，n个=2个文化，20个字段）(图1A类,B类). 然而，在培养1个月（30天）后对突触进行的检查表明，缺乏CSP-α的神经元无法维持在对照组同窝培养中观察到的典型的高数量突触（WT:突触蛋白/MAP2比值，1.03±0.06，n个=3种文化，30个领域；KO:0.75±0.04，n个=3种文化，30个领域）(图1A类,B类). 这些观察结果与CSP-α在维持突触稳定性中的作用一致。然后我们研究了表型对每个突触的影响是否相等，或者其影响是否局限于特定的突触群。使用GABA能（GAD65）和谷氨酸能（VGLUT1）突触的特定标记来量化相同培养物中抑制性突触和兴奋性突触的比例(图1C类). 出乎意料的是，我们发现CSP-αKO小鼠30个DIV培养物中GABA能突触的比例与WT培养物中的比例相比显著降低[WT，VGAT/（VGAT+VGLUT1）比值，0.35±0.02，n个=3个培养基，30个字段；KO，0.12±0.025，n个=3个文化，28个领域]。这一观察强烈表明，在CSP-αKO培养物中，GABA能突触的数量特别减少。然而，另一种可能的解释是，尽管突触数量普遍减少，CSP-αKO中谷氨酸能突触的数量上调。

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CSP-α缺失时突触总数逐渐减少。A类，三个不同时间点WT和CSP-αKO神经元培养物中MAP2（绿色）和突触蛋白（白色）表达的共焦图像。B类与WT培养物相比，CSP-αKO中的突触蛋白/MAP2比率仅在30 DIV时降低。误差条显示SEM。C类，GABA能（抗GAD65；绿色；星号）和谷氨酸能（抗VGLUT1；白色或红色；箭头）突触点的共聚焦图像表明30 DIV时CSP-αKO培养物中GABA能点的比例下降。

为了区分这两种可能性，我们首先使用特定抗体，然后使用电子显微镜直接量化GABA能突触的数量。使用抗突触前总标记synaptobevin 2/VAMP2的抗体标记所有突触，然后通过附加的抗GABA转运体VGAT抗体标记来量化与GABA能末端相对应的比例(图2). 在11 DIV时，突变神经元和对照神经元之间的GABA能末端比例没有显著差异（31±1.5%，n个=3个培养基，30个字段，用于WT；25.5 ± 1.4%,n个=3个培养基，30个字段，用于KO）。相比之下，较老的CSP-α-KO培养物（30 DIV）与对照组相比，GABA能突触数量显著减少（42.5±3.6%，n个=WT的3种培养物，31个领域；21.6 ± 2.3%,n个=3种培养物，30个字段，用于KO；第页≤0.001，Mann–Whitney秩和检验）。使用GAD65作为GABA能标记也获得了类似的结果（数据未显示）。这些观察结果表明，在没有CSP-α的情况下，GABA能突触最初建立，但后来退化，可能是因为维持失败。CSP-α被认为通过促进GABA合成酶（GAD65和GAD67）与VGAT之间蛋白质复合物的稳定性，参与GABA向突触囊泡的转运(Hsu等人，2000年). 因此，用抗GAD65和VGAT抗体检测GABA能标记的减少可能归因于这些蛋白在正常的GABA能突触前终末中的特异性降解。

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CSP-αKO海马神经元培养中GABA能突触点的逐渐减少。在用抗突触素brevin 2/VAMP2（绿色；星号）和抗VGAT（白色和红色）抗体标记的11 DIV的WT和CSP-αKO海马神经元培养物的两种不同放大倍数的共聚焦图像中，在与非GABA能突触点（星号）共存的共定位点（箭头）识别GABA能的突触点。A类在11 DIV时，WT和CSP-αKO培养物中GABA能点的百分比相似。B类，在30DIV时，与野生型培养物（42.5%）相比，CSP-αKO中GABA能点的百分比显著降低（21.6%）。

为了探索这种可能性，我们用电子显微镜检查了老年（30 DIV）海马培养物。谷氨酸能终末被鉴定为充满圆形突触小泡的小轴突终末，并在突触后位置形成不对称突触，具有显著的电子密集特化(图3; 补充图1，网址为网址：www.jneurosci.org作为补充材料）。对照组和突变组培养物中谷氨酸能末端的数量没有变化（1.14±0.09个突触/μm2,n个=3只WT小鼠；0.99±0.05突触/μm2,n个=3只小鼠用于KO）。GABA能突触被鉴定为中到大的终末，充满扁平的突触小泡，突触后位置没有显著的突触后特化(图3; 补充图1，网址为网址：www.jneurosci.org作为补充材料）。WT培养物富含GABA能终末，而CSP-αKO培养物中GABA能突触的大小和数量明显减少（7.1±0.55突触/100μm，n个=3只WT小鼠，2.8±0.33个突触/100μm，n个=3只小鼠在30 DIV时出现KO；第页=0.002，学生的t吨与WT培养物相比，CSP-αKO减少了61.3%。此外，在CSP-αKO神经元中，正常树突通常没有GABA能输入(图3H（H）). 这些观察结果与以下观点一致：在CSP-αKO培养物中，GABA能突触的一个亚群逐渐消失，可能是因为突触前变性，而谷氨酸能突触则得以保留。接下来，我们研究了特定类型的GABA能突触对CSP-α缺失的敏感性是否不同。

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培养中GABA能和谷氨酸能突触的超微结构分析。野生型谷氨酸能和GABA能突触的电镜显微照片(A–G)和KO(H–M)神经元培养。A–G在WT中，GABA能轴突终末（inh）与细胞体（胞体）和树突轴（Den）建立抑制性突触，谷氨酸能轴突末梢（b）与海马神经元的树突轴和棘建立兴奋性突触。H–米在KO中，还检测到GABA能（inh）和谷氨酸能（exc）轴突终末，但GABA能轴突终末梢的尺寸通常小于WT中的尺寸。比例尺为0.5μm。WT和KO培养液中谷氨酸能突触的密度没有变化，但KO培养物中GABA能突触显著减少（见结果）。

CSP-αKO GABA能神经元中表达Syt2的篮子细胞突触的高易损性

CA1锥体细胞由至少16种不同类型的GABA能神经元支持，这些神经元具有不同的生理、形态和神经化学特性(Freund和Buzsáki，1996年;Somogyi和Klausberger，2005年;Klausberger和Somogyi，2008年). 在所有海马中间神经元中，含PV的中间神经元、篮细胞和轴突细胞具有最高的动作电位放电率(Pawelzik等人，2002年;Klausberger等人，2003年). 有趣的是，培养物中的皮层PV阳性中间神经元也具有快速尖峰特性(Kinney等人，2006年). 突触囊泡蛋白Syt2是海马篮细胞终末亚群的突触前标志物(Pang等人，2006年;福克斯与桑斯出版社，2007年;Kerr等人，2008年)（补充图2，网址：网址：www.jneurosci.org作为补充材料）。此外，在腔隙分子层的较小突触群中也检测到Syt2（补充图2，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料）和在副室(Su等人，2010年). 因此，我们首先用GABA转运体VGAT和Syt2抗体对1个月龄的培养物进行染色(图4A类). WT培养物中富含含有Syt2的突触，Syt2总是与VGAT共定位(图4A类). 相反，在CSP-α-KO培养物中，30次DIV后存活的GABA能末端均未表达Syt2(图4A类,B类). 该观察结果表明，在缺乏CSP-α的情况下，表达Syt2的GABA能终端更容易受到攻击。在WT培养物中，几乎所有Syt2阳性斑点都呈现PV免疫反应(图4C类)表明培养物中大多数Syt2表达突触是由PV表达篮细胞形成的。接下来，我们使用抗PV和CR的抗体分别标记高活性和低活性的中间神经元(Gulyás等人，2006年). 我们还使用了针对MAP2的抗体来标记所有培养的神经元的胞体。老年培养物（36–39 DIV）中WT神经元总数比年轻培养物（18–20 DIV）减少24.7%(图4C类，左侧面板）。然而，在同一时期，CSP-αKO培养物中神经元数量的减少幅度更大（减少50.9%），表明CSP-。然后我们检查了CR-阳性中间神经元的数量，发现尽管与年轻培养物相比，老年培养物中神经元的数量减少了，但WT（48.6%）和CSP-α突变体（51.2%）神经元的减少相似(图4C类，中间面板）。相比之下，我们发现含PV神经元的数量存在显著差异：在旧WT培养基中，含PV的神经元数量比年轻WT培养物中的数量减少了41.9%。然而，令人惊讶的是，我们在CSP-αKO培养物中没有检测到任何PV阳性神经元在体外检查年龄（18-20岁和36-39岁DIV）(图4C类，右侧面板）。确定我们的文化结果是否反映了类似的情况体内，我们检查了标记有PV抗体的P31海马切片(图5)并进行定量体视学测量。令人惊讶的是，与我们的在体外观察发现，WT和同窝突变脑中海马PV神经元的数量没有差异（1610±185个神经元/mm三,n个=7只WT小鼠，相比之下，1659±182个神经元/mm三,n个=7只CSP-αKO小鼠；第页=0.853，学生的t吨测试）。然而，令人惊讶的是，我们发现变异人脑中PV阳性轴突投射到的锥体层和颗粒层的PV标记比对照人脑中弱得多(图5A类,B类,C′–F′; 补充图3，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料），这表明PV阳性终末的数量减少，与突触变性一样。与此一致，我们还发现突变体中这些层的Syt2标记比WT中弱得多(图5A类,B类,C–F类; 补充图3，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料）。

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在缺乏CSP-α的培养物中，Syt2-阳性GABA能突触显著减少。A类在两种不同放大倍数的海马神经元培养物上，用抗VGAT（红色）和抗Syt2（绿色）抗体标记的共聚焦图像确定了在WT培养物中GABA能突触点与Syt2共定位（箭头）而不是共定位（星号）。在CSP-αKO培养物中，存在GABA能点（星号），但不存在Syt2-阳性点。在WT培养中，30 DIV时共定位VGAT/Syt2阳性点的百分比为55.2±2.7%(n个=4种培养物；60个字段）。在CSP-αKO培养基中，未检测到Syt2-阳性斑点(n个=4种培养物；60个字段）。B类，WT神经元培养物共聚焦图像的最大投影显示Syt2-（绿色）和PV-阳性斑点（红色）。大多数Syt2阳性点状细胞来自PV阳性神经元（虚线边界矩形），只有少数斑点没有Syt2/PV共定位（连续边界矩形）。该图像不具有代表性，它被选为显示不与PV共定位的罕见Syt2突触。C类，左，与WT相比，用抗MAP2抗体标记的CSP-αKO神经元数量的更强的渐进性减少（平均密度：18-20 DIV WT，15.3±1.8个神经元/mm2,n个=2个培养基，10个盖玻片；KO，16.6±2.3个神经元/mm2,n个=2种培养物，10份盖玻片，无显著差异；36–39 DIV WT，11.6±1.3个神经元/mm2,n个=2个培养基，12个盖玻片；KO，8.1±1.0个神经元/mm2,n个=2个培养物，12个盖玻片；第页=0.045，学生的t吨测试）和不同时间点KO文化之间(第页=0.002，学生的t吨测试）。用抗CR抗体标记的WT和CSP-αKO神经元数量中度、类似的渐进性减少（平均密度：18-20 DIV WT，2.1±0.3个神经元/mm2,n个=2个培养基，10个盖玻片；KO，2.2±0.6个神经元/mm2,n个=2个培养基，10个盖玻片；36–39 DIV WT，1.1±0.2个神经元/mm2,n个=2个培养基，12个盖玻片；KO，1.0±0.2个神经元/mm2,n个=2个培养基，12个盖玻片）。对，WT中PV表达神经元数量的逐渐减少与CSP-αKO培养中未检测到PV阳性神经元形成对比（WT中18–20 DIV的平均密度：0.6±0.1个神经元/mm2,n个=3个培养基，8个盖玻片；36–39 DIV:0.4±0.1个神经元/mm2,n个=3个培养基，11个盖玻片；第页≤0.001，Mann–Whitney秩和检验）。误差条表示SEM。

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CSP-αKO海马突触Syt2和PV标记减少和篮细胞终末变性。A类,B类，来自WT的共焦图像(A类)和CSP-αKO(B类)海马切片标记有抗Syt2（绿色）和抗PV（红色）抗体。体视学分析显示，在P31-P40，CSP-αWT和CSP-βKO海马体PV阳性体（箭头）的数量没有差异。然而，请注意锥体层和颗粒细胞层中突触标记（箭头）的强度不同。Syt2染色也在腔隙分子层（点）检测到。通过标签配置文件z（z）-axis显示同质抗体穿透整个切片。C–D类〃，WT中的CA1区域(C–C〃）和KO(D–D”）海马切片。在KO地层金字塔（星号）中可以看到较弱的Syt2（绿色）和PV（红色）标记。E–F〃，WT中的齿状回(E–E〃）和KO(F–F″). 在CSP-αKO（星号）中PV阳性点减少。来自四名WT和四名KO室友的数据。G–L兴奋性的EM分析(H（H）,L（左）)和抑制(G公司,I–K型)齿状回中的突触。在WT中，GABA能轴突末端（bt）(G公司)在颗粒细胞体（GC）周围建立GABA能突触的篮子细胞的突触大小适中，充满突触小泡。在CSP-αKO小鼠中(I–K型)，这些终末较小，突触小泡较少。相反，谷氨酸能轴突终末（b）与齿状回分子层中的树突状轴（Den）或棘（s）建立兴奋性突触，或与躯体抑制性突触接近，两者在WT中几乎相似(H（H）)和CSP-αKO(L（左）)老鼠。SO，oriens地层；SP，金字塔层；SR，辐射层；ML，分子层；GCL，颗粒细胞层。

对一般GABA能标记物（VGAT和GAD65）的抗体而言，这些染色强度的差异不太明显（数据未显示），这表明该表型对其他类型的GABA能突触的影响不如对篮细胞Syt2阳性突触的强烈。根据这一解释，对1个月龄WT和CSP-αKO小鼠脑切片中齿状回的电子显微镜检查(图5G–L)突变体小鼠的篮形细胞末端投射到颗粒细胞上，显示出明显的退化迹象(图5我,J型，英国）。这些变化包括抑制性轴突末端的尺寸减小。相反，在WT和KO脑切片中，齿状回分子层或颗粒细胞层接近GABA能突触的谷氨酸能突触与之相似(图5G–K型，GC）。

接下来，我们从不同年龄的小鼠中分离海马，以量化蛋白质水平(图6). WT和CSP-αKO小鼠在任何年龄段的关键突触蛋白（如synaptobevin 2/VAMP2和synaptotagmin1）水平均无差异。相反，3周龄时CSP-αKO海马体中Syt2和PV蛋白水平显著降低(图6). 总之，因此，表达Syt2的海马GABA能突触，来自快刺篮子细胞，在没有CSP-α的情况下发生退化，而谷氨酸能突触似乎正常。然而，在突变体中，表面上正常的谷氨酸能突触和年轻的GABA能突触可能存在形态分析无法检测到的功能异常。因此，为了检查突触前功能，我们研究了培养神经元中抑制性和兴奋性突触的神经递质的自发释放。

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CSP-αKO小鼠出生后Syt2和PV海马蛋白水平下降。A类，用CSP-α、Hsc70、Syt2、PV、syntobrevin 2/VAMP2（Syb2）、syntotagmin 1（Syt1）和α-actin抗体标记的P16、P20、P28和P32的WT和CSP-a-αKO小鼠海马蛋白的代表性免疫印迹。B类，通过直接化学发光测量和相对于α-肌动蛋白水平评估标准化蛋白质水平。数据绘制为平均值±SEM；n个=每个基因型和每个标记4个；统计显著性由Student的t吨测试。

CSP-αKO培养中mIPSC频率的逐渐降低

在1个月大的培养物（30–33 DIV）中，我们记录了由单个突触小泡在河豚毒素存在下自发释放GABA导致的mIPSC，以阻断动作电位，以及NBQX和APV，以阻断谷氨酸能输入。在WT培养基中，所有记录的神经元都呈现抑制性输入，GABA可逆地阻断了这些输入A类受体拮抗剂荷包牡丹碱。在刚刚超过一半的WT神经元（52%）中，mIPSC频率足够低（<13 Hz），可以可靠地区分和隔离单个事件（补充图4，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料）。我们将这些记录归类为“I型自发反应”。然而，其余记录（48%）显示mIPSC的频率非常高，其中单个事件的时间重叠阻碍了可靠的事件检测和mIPSC频率的量化。我们将这些记录称为“II型自发反应”。我们推断，与II型反应神经元相比，具有I型反应的神经元接收到的抑制性输入更少。在CSP-αKO培养物中也检测到这两种类型的反应，尽管比例不同：75%的I型（低频）反应和10%的II型（高频）反应。我们将这种向I型反应的转变解释为突变体中功能抑制输入的减少，可能是因为实际GABA能接触的数量减少。与此观点一致，我们还确定15%的记录突变神经元没有mIPSC（补充图4，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料），可能是因为他们没有GABA能量接触。此外，我们进一步分析了I型反应，发现突变培养物中mIPSC频率显著降低（9.1±0.3 Hz，n个=4个培养物，37个细胞，用于WT，5.0±0.4 Hz，n个=4个培养物，53个细胞，用于30 DIV的KO；第页≤0.001，Mann-Whitney秩和检验），但单个mIPSC的大小没有变化（38.5±2.9 pA，n个=4个培养物，37个细胞，用于WT，36.0±2.6 pA，n个=4个培养物，53个细胞，用于30 DIV的KO）(图7A类,B类). 这可能再次反映了抑制性输入数量的功能性减少。与30 DIV时降低的mIPSC频率相比，两种频率都没有降低（4.9±0.4 Hz，n个=3个培养物，52个细胞，用于WT，7.1±0.6 Hz，n个=3个培养物，40个细胞，用于KO；第页=0.007，Mann–Whitney秩和检验）或mIPSC大小（48.7±3.6 pA，n个=3个培养物，52个细胞，用于WT，58.8±3.8 pA，n个=3个培养物，40个细胞，用于KO；第页=0.056 Mann–Whitney秩和检验），在较年轻的突变培养物（11 DIV）中与同窝对照相比(图7C类,D类). 有趣的是，在CSP-αKO培养基中，11 DIV的频率甚至稍高。尽管这一观察结果强化了年轻时抑制性输入的数量没有减少的观点，但确实表明CSP-α的缺失可能会导致突触前功能的轻微早期不稳定。上述一组实验与GABA能突触数量的减少一致，有力地支持了CSP-α对于长时间保持抑制输入的完整性至关重要的观点。因此，我们接下来评估了CSP-α随时间推移特异性支持谷氨酸能突触功能的能力。

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30 DIV时CSP-αKO海马培养物中mIPSC频率降低，但幅度不变。A类,C类30和11 DIV时WT和KO神经元培养中的mIPSC；荷包牡丹碱可逆地废除了mIPSC。B类，30DIV时WT和KO海马神经元培养物的mIPSC振幅的直方图和累积分布。插图，两种基因型的平均mIPSC轨迹。D类11 DIV.插图中WT和KO海马神经元培养物mIPSC振幅的直方图和累积分布，两种基因型的平均mIPSC轨迹。

CSP-αKO培养物中AMPAR介导的mEPSC大小逐渐减小

为了研究谷氨酸的自发释放，我们在老化培养物（30–33 DIV）中记录了存在河豚毒素的AMPAR型mEPSCs。该分析显示，与对照组相比，突变培养物中的mEPSC频率没有变化（14.8±0.8 Hz，n个=5个培养物，34个细胞，用于WT，13.0±0.8 Hz，n个=5个培养物，25个细胞，用于在30DIV下的KO；第页=0.136，学生的t吨测试）(图8A类,B类). 然而，我们惊讶地发现，mEPSC振幅显著降低，约为对照mEPSC大小的一半（22.3±2.2 pA，n个=5个培养物，34个细胞，用于WT，11.7±1.1 pA，n个=5个培养物，25个细胞，用于30 DIV的KO；第页≤0.001，Mann–Whitney秩和检验）。我们研究的所有培养物都证实了这一观察结果。动力学改变与粒径减小无关：放大从多个mEPSC获得的平均轨迹，得到与平均WT mEPSC轨迹一致的轨迹。这一发现引发了这样一种想法，即尽管我们在培养的谷氨酸能突触中没有发现任何结构变化，但CSP-α可能在突触前功能中发挥一些与保护突触终末无关的调节作用，例如谷氨酸填充突触小泡。考虑到这种缺陷（而不是进行性缺陷）应该已经在年轻培养基中检测到，我们测定了11和21 DIV时AMPAR型mEPSCs的振幅和频率，但发现突变培养基和对照组中记录的mEPSC在振幅（22.2±3.3 pA，n个=4个培养物，19个细胞，用于WT和19.5±3.6 pA，n个=4个培养物，16个细胞，用于11 DIV的KO；20.1±3.4微安，n个=4个培养物，17个细胞，用于WT，18.9±3.5 pA，n个=4个培养物，15个细胞，用于21 DIV或频率（13.6±0.5 Hz，n个=4个培养物，19个细胞，用于WT，11.9±0.9 Hz，n个=4个培养物，16个细胞，用于11 DIV的KO；15±1.0赫兹，n个=4个培养物，17个细胞，用于WT，13.9±0.9 Hz，n个=4个培养物，15个细胞，用于21 DIV的KO）(图8C类,D类)（未显示数据）。因此，我们得出结论，与GABA能突触的情况类似，谷氨酸能突触中的功能变化也是渐进的，并且取决于培养期。然而，与GABA能端的变化相比，我们无法检测到谷氨酸能端的任何结构缺陷。为了进一步了解谷氨酸能传递的功能变化，我们扩大了研究范围，分析NMDAR介导的mEPSCs。

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长期CSP-αKO海马培养中AMPAR介导的mEPSCs的下调。A类CSP-αKO培养物中AMPAR介导的mEPSCs的正常频率与30 DIV NBQX培养物中WT的正常频率相比可逆阻断了AMPAR mEPSCs。B类在30 DIV条件下，CSP-αKO培养物中AMPAR介导的mEPSCs的大小显著减少。两种基因型的直方图和振幅累积分布（误差条表示SEM）。基因型和叠加归一化KO反应的插入平均AMPAR mEPSC波形均无动力学差异。C类，11 DIV时两种基因型AMPAR介导的mEPSCs的正常频率。D类两种基因型的直方图和振幅累积分布显示，在11 DIV的CSP-αKO和WT培养物中，AMPAR介导的mEPSC的大小相似。插入两种基因类型的平均AMPAR mEPSC波形（误差条表示SEM）。

在缺乏CSP-α的情况下AMPAR的突触降尺度

在不添加镁的镀液中存在河豚毒素和NBQX2+，我们测量了老年海马培养物（30DIV）中单个突触小泡释放谷氨酸时NMDA受体激活所产生的mEPSCs。与AMPAR型mEPSC振幅显著降低相比，我们发现振幅没有显著差异（17.7±2.2 pA，n个=3个培养物，18个细胞，用于WT，20.8±2.4 pA，n个=3个培养物，19个细胞，用于30 DIV的KO；第页=0.054，Mann–Whitney秩和检验）或来自CSP-αKO和WT同窝小鼠的培养物之间NMDAR型mEPSC的动力学(图9A类,B类). 然而，我们确实发现NMDAR介导的mEPSC的频率有小幅度但显著的增加（3.2±0.2 Hz，n个=3个培养物，18个细胞，用于WT，4.1±0.2 Hz，n个=3个培养物，19个细胞，用于KO；第页=0.028，学生的t吨测试）。沉默突触可能参与这一现象(Gomperts等人，1998年)有待于进一步研究。在谷氨酸释放突触前缺陷的情况下，我们预计AMPAR型和NMDAR型mEPSCs的振幅都会降低。因此，由于我们只观察到AMPAR型mEPSCs减少，我们推断谷氨酸能突触的功能改变是由于谷氨酸能AMPAR表达或转运的突触后改变引起的(马利诺和马伦卡，2002年). 这是一种有点出乎意料的可能性，因为CSP-α以前没有定位于突触后末端。尽管如此，我们直接研究了CSP-α的突触后表达。这是通过用CSP-α抗体对海马培养物进行免疫细胞化学标记来实现的，首先使用突触前标记物synaptobrevin 2/VAMP2(Baumert等人，1989年)，然后使用突触后标记GluR1(Craig等人，1993年)和卟啉(Kirsch和Betz，1995年). 正如预期的那样，CSP-α和synaptobrevin 2/VAMP2在突触前终末共定位。相反，GluR1和凝胶蛋白标记的斑点出现在CSP-α标记的前面，但没有重叠（补充图5，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料）。这些观察结果表明CSP-α是突触前蛋白。然而，由于共聚焦荧光显微镜可能仍然缺乏完全分离突触前和突触后标记所需的高空间分辨率，我们使用抗CSP-α抗体对小鼠海马切片进行免疫电子显微镜技术。这表明，使用两种不同的抗体（见材料和方法），兴奋性和抑制性神经元突触前末端的CSP-α有显著标记（补充图6，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料）。虽然可以在突触后末端检测到一些标记，但其水平极低（1297个金颗粒中只有18个位于树突中，占检测到的所有金颗粒的0.08%），可能是因为残留的背景染色。因此，我们得出结论，CSP-α只是突触前蛋白，而不是突触后蛋白。

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在不存在CSP-α的情况下AMPAR-mEPSC的乘法降尺度。A类30 DIV时WT和CSP-αKO神经元培养中的NMDAR mEPSCs。B类，WT和KO培养物在30 DIV插入时NMDAR mEPSC振幅的直方图和累积分布，基因型和重叠归一化反应的平均NMDAR m EPSC轨迹。C类左，根据排名CSP-αKO AMPAR mEPSC振幅绘制排名控制AMPAR m EPSC振幅。定义了加法、随机加法或乘法函数数据的最佳拟合。最佳拟合：KO=WT×0.43−1.14（乘法函数）。右侧，WT和KO AMPAR mEPSC的累积振幅直方图。WT分布根据前面的乘法函数进行变换，并与KO数据一起绘制。D类，左，根据分级KO mIPSC振幅绘制的分级控制mIPSC幅度。数据的最佳拟合是一个斜率为0.97的乘法函数（KO=WT×0.97−2.78）。右，WT和KO NMDAR mEPSC振幅比较的类似图。最佳拟合：KO=WT×1.1+1.57（乘法函数）。接近1的斜率表明CSP-αKO培养物中mIPSC和NMDAR-mEPSC的大小没有增加。

排除了CSP-α的直接突触后作用后，我们质疑兴奋性突触的变化是否可能是抑制性输入初始缺陷的结果。消除突触抑制会增加神经元网络的动作电位放电。在这些条件下，稳态可塑性机制通过移除AMPAR来削弱兴奋性突触，从而将神经元放电恢复到正常水平(Turrigiano等人，1998年;Turrigiano和Nelson，2004年). 事实上，在培养的神经元中，用荷包牡丹碱（GABA的拮抗剂）阻断GABA能突触传递A类受体，导致谷氨酸能突触的突触缩小，其典型特征是AMPAR型mEPSC的大小减小(Turrigiano等人，1998年). 由于这种特征与CSP-αKO谷氨酸能突触的表型惊人地相似，我们假设观察到的AMPAR介导的mEPSCs的缩小是由于通过稳态可塑性机制实现的突触缩放。为了研究这一点，我们通过对从对照和突变培养物中记录的所有细胞的mEPSC振幅进行升序排列，研究了WT和CSP-αKO mEPSC幅度分布之间的关系。如前所述(Turrigiano等人，1998年)，我们绘制了对照CSP-αKO振幅的控制振幅，所得关系适用于不同的模型（加法、随机加法和乘法函数）(图9C类，左侧面板）。这些数据仅通过斜率为0.43的线性函数进行了良好拟合，表明对照和突变幅度之间的关系遵循乘法模型。根据该线性函数对对照培养物中的事件进行缩放后，所得的累积分布与累积突变分布重叠(图9C类，右侧面板）。当对GABA介导mIPSC和NMDAR介导mEPSC的分布进行相同类型的分析时，结果表明，对于这两种分布，WT和CSP-αKO事件之间的关系是线性的，斜率接近1（GABA能mIPSC斜率=0.97，NMDA-mEPSC斜率=1.1）(图9D类). 因此，我们的数据表明，在没有CSP-α的情况下，海马谷氨酸能突触通过对突触后表面AMPA-型受体的特异性调节而发生稳态可塑性变化。这是在抑制性输入功能减少时的预期反应，因此，与在缺乏CSP-α的情况下观察到的GABA能突触减少一致。然而，这提出了一个新的问题：为什么GABA能的CSP-α对长时间突触维持的需求高于谷氨酸能的终末？一种可能的解释是GABA能突触小泡特别需要CSP-α(Hsu等人，2000年;Jin等人，2003年)，但我们没有看到一般GABA能表型或mIPSC大小减少。然而，由于某些GABA能神经元的放电速率比主细胞高几倍(Csicsvari等人，1999年;Jonas等人，2004年)动作电位放电频率可能是触发抑制性终末比其他终末更早退化的关键因素。如果这个假设是正确的，那么应该通过降低培养物中的网络兴奋性来改善表型，这是我们接下来研究的一种可能性。

GABA能突触在阻断兴奋性传递后从退化中解救出来

为了降低培养中神经元网络的兴奋性，我们使用APV和NBQX阻断谷氨酸能突触(Thiagarajan等人，2005年;Mateos等人，2007年)并比较WT和CSP-αKO培养物对照条件下GABA能突触的相对数量。图10A类显示WT和CSP-αKO培养物保持了大量标记有synaptobrevin 2/VAMP2抗体的突触。然而，正如之前所观察到的(图2B类)与WT相比，CSP-αKO培养物中GABA能标记物VGAT对海马培养物的染色显著减弱。与未处理培养物相比，经谷氨酸能阻滞剂处理的两种基因型培养物中synaptobrevin 2/VAMP2标记水平也降低。相反，与未经处理的培养物相比，经谷氨酸能阻滞剂处理的CSP-αKO培养物中GABA能突触的标记显著增加(图10A类)。

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长期阻断谷氨酸能突触传递后，在缺乏CSP-α的培养物中GABA能突触点的恢复。A类谷氨酸能传播阻断3周后，30 DIV时WT和KO神经元培养物突触前染色的突触素2/VAMP2和VGAT共聚焦图像。B类在KO培养物中谷氨酸能阻断后30 DIV处Syt2突触标记的恢复(n个=3种培养基）。右侧面板显示左侧面板中选定区域的放大，但面板CSP-α（控制）除外，其中右侧面板的亮场图像显示存在无标记神经元。

GABA能突触的百分比是根据VGAT和Syb2的双重阳性像素与30 DIV神经元培养的Syb2阳性像素总数之间的比率计算的。来自突变培养物的数据被标准化为处理过的和未处理过的同窝WT培养物之间观察到的变化。尽管与WT相比，突变体中GABA能突触的数量仅得到了部分拯救，但GABA能神经元突触的数目却急剧增加：在处理过的突变体培养物与未处理过的突变培养物中标记的GABA能神经突触数量几乎是未处理突变体培养液的三倍（未处理的KO比率：0.19±0.03，n个=3个培养基，30个字段；处理KO比：0.54±0.043，n个=3种文化，40个领域；第页≤0.001，Mann–Whitney秩和检验）。

此外，在检测的每个阶段，突变培养物中都没有Syt2标记(图4A类)在缺乏兴奋性突触传递的突变培养物中被逆转(图10B类). 我们也用PV抗体对培养物进行染色，但在处理过的CSP-αKO培养物中，我们没有发现PV标记的恢复。然而，鉴于PV的表达是由高水平的神经活动触发的，解释这些结果是困难的(江和斯旺，2005年)并被NMDAR拮抗剂阻断(Kinney等人，2006年)事实证明，在处理过的WT培养物中，PV标记水平也大大降低（数据未显示）。这些观察结果与突触活动是CSP-α缺失产生突触表型的主要原因这一概念一致，并支持CSP-β作为一种伴侣蛋白的概念，特别适合保护突触免受活动诱导的应激。

讨论

先前对缺乏突触囊泡蛋白CSP-α的KO小鼠的研究得出了两个重要假设：（1）突触活动增加了神经末梢的脆弱性；（2）CSP-β是防止突触活动诱导的分子应激导致突触衰竭的分子机制的一部分(Fernández-Chacón等人，2004年;Chandra等人，2005年;Schmitz等人，2006年). 在这里，我们提供了实验证据来支持海马突触中的这些概念。更具体地说，我们已经证明Syt2表达的GABA能突触(Pang等人，2006年;福克斯与桑斯出版社，2007年;Kerr等人，2008年)由神经元建立，这些神经元通常以非常高的频率（～200 Hz）激发动作电位(Ylinen等人，1995年;Csicsvari等人，1999年)随着时间的推移，它们极度依赖CSP-α来维持其功能和结构的完整性，因此在CSP-β基因去除后会发生渐进性退化。相反，来自神经元的相邻谷氨酸能突触通常以较低频率（～1 Hz）触发动作电位(Csicsvari等人，1999年;Frerking等人，2005年)在没有CSP-α的情况下，没有突触前变性的迹象。这些结论基于以下发现：首先，通过免疫荧光和电子显微镜，我们证实了GABA能突触的进行性变性在体外(图1​1​–4)和体内(图5). 值得注意的是，在齿状回颗粒细胞上形成突触的篮形细胞终末显示出突触前神经变性的明显迹象(图5I–K型). 其次，我们已经确定了一个重要的体内Syt2蛋白水平降低(图6)突变小鼠海马中Syt2阳性篮细胞终末(图5; 补充图3，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料），并表明在基本上未检测到Syt2阳性终末的神经元培养中，这种减少更大(图4). Syt2也在较小的突触群中检测到，例如在不表达或表达低水平PV的腔隙分子层(图5A类，点）。很可能，这些神经元在我们的文化中代表性较差，因为不与PV共定位的表达Syt2的突触数量极低(图4C类). 我们不能排除其他共表达Syt2和PV的中间神经元在我们的培养物中与篮细胞混合，但无论如何，它们对CSP-α的缺乏也非常敏感。此外，PV蛋白水平(图6)PV阳性末端也减少体内但体视学方法定量的PV阳性神经元数量没有变化(图5; 补充图3，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料）。有趣的是，虽然没有在体外与WT相比，突变体中CR-阳性GABA能神经元的变化，在缺乏CSP-α的培养物中未检测到PV-阳性神经元(图4). 这可能反映了PV阳性神经元的更高脆弱性，因为大多数海马PV表达细胞是快速尖峰的(Pawelzik等人，2002年)这一群体包括最活跃的海马中间神经元：篮细胞和轴索枝形吊灯细胞(Howard等人，2005年;Freund和Katona，2007年). 相反，CR-阳性细胞活性较低，能量需求较低(Gulyás等人，2006年). 因此，CSP-α的去除可能会破坏对PV表达神经元生存至关重要的神经营养因子的摄取和逆行运输，从而产生初始突触前障碍(Tao和Poo，2001年). 很可能，这种返老还童的过程在培养中要快得多，因为神经元是从更具滋养作用的生理海马生态位中移除的。由于CSP-αKO小鼠死亡较早（6-8周龄），因此只检测到PV蛋白水平和PV突触染色的显著变化体内(图5,​,6).6). 可以预见，如果小鼠存活数月，那么将检测到PV阳性体细胞数量减少。基于CSP-α神经元特异性敲除的未来实验体内允许延长寿命，将有助于调查该问题。第三，GABA能突触传递的电生理测量与我们的形态学观察一致，显示CSP-αKO突触中mIPSC的频率逐渐降低(图7)但单个mIPSC的大小或动力学没有变化。相反，与WT相比，AMPAR介导的mEPSCs在突变体中的频率正常(图8)尽管这些突触后电流的振幅显著降低（50%）。两个关键发现支持了mEPSC大小减少是由内稳态可塑性变化引起的这一观点：（1）这种机制是突触后的，因为在NMDAR介导的mEPSC的大小或动力学中未检测到任何变化，以及（2）来自突变体和WT的AMPAR介导的EPSC之间的等级振幅比较遵循乘法关系（斜率=0.43）(Turrigiano等人，1998年). 谷氨酸能突触的这种可塑性反应预计会增加网络的兴奋性，因此，独立地支持了CSP-α神经元培养中GABA能功能受损的观点。补充图7中给出了概述这种解释的模型（可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料）。

综上所述，上述观察结果表明，高突触活性是增加神经末梢脆弱性的一个主要因素，这可以通过CSP-α介导的机制加以预防。我们的结果进一步证实了这一结论，即在海马培养物中剥夺兴奋性传递足以挽救缺乏CSP-α的Syt2表达GABA能突触的神经退化(图10). 在控制条件下，谷氨酸能传递是网络兴奋性的主要促进剂(Thiagarajan等人，2005年;Mateos等人，2007年)在缺乏CSP-α的培养物中，我们未能检测到Syt2染色(图4A类,B类,​,1010B类). 相比之下，在长时间（3周）阻断AMPAR和NMDAR后，我们首次在CSP-αKO培养基中检测到Syt2阳性斑点(图10B类)以及GABA能突触数量的显著增加（三倍）(图10A类). 在WT培养中，Syt2的突触表达仅在培养第二周后进行了强有力的免疫检测（数据未显示）。我们认为，在对照培养条件下，缺乏CSP-α的Syt2表达突触是不稳定的，并迅速退化(图3,​,4),4)这使得用免疫技术很难检测到它们。这种情况有所改善体内其中，尽管Syt2染色显著减少，但仍可以检测到(图5)这可能是因为生理海马生态位提供了比培养物更好的营养支持，或者在网络兴奋性方面得到了更好的控制。无论如何，在培养中谷氨酸能剥夺时，Syt2阳性突触的显著增加可能归因于新突触的形成和受损程度较低的终末的重新激活，一旦它们从高突触活性的负担中释放出来，这些终末就会变得更具活力。在WT文化中缺乏兴奋性活动(图10A类)，我们观察到与未经处理的培养物相比，GABA能突触的数量减少了30.4%，这与之前报道的结果一致(Hartman等人，2006年). 鉴于WT培养物中GABA能突触的数量没有增加，我们无法根据药物治疗的次级神经营养作用来解释突变培养物中的GABA能神经突触的增加。我们不能排除谷氨酸能阻断时Syt2的表达可归因于与篮形细胞不同的其他细胞类型中Syt2活性依赖性抑制的丧失。然而，这不太可能，因为这意味着GABA能突触在活动剥夺时会意外激活。我们最简约的解释是，谷氨酸能阻滞剂（1）直接限制GABA能神经元的突触后去极化，（2）间接减少到达突触前GABA能终末的动作电位数量，因此（3）通过减少GABA负载突触小泡的诱发胞吐来防止突触前变性。此外，谷氨酸能突触失活降低钙2+通过L型钙的流入2+-海马培养中的通道(Thiagarajan等人，2005年)从而可能减少钙2+由尖峰去极化和降低静息[Ca触发的瞬态2+] (Magee等人，1996年). 重要的是，L型钙2+通道不参与GABA能突触的低频突触传递(Jensen等人，1999年;Jensen和Mody，2001年). 然而，在海马γ节律的典型高频序列（40 Hz）中，它们对快速尖峰篮细胞释放GABA至关重要(Jensen和Mody，2001年). 因此，L型钙的二次还原2+通道在通过阻止钙离子来保护Syt2阳性突触前终末方面可能至关重要2+过载和大量GABA释放。无论如何，本研究首次报道，在培养的神经元中，CSP-α依赖性神经退行性和突触表型适用于未来研究将CSP-β与防止活动依赖性突触衰竭联系起来的分子机制。

总之，我们的研究表明，基础动作电位放电频率高的神经元容易发生突触前变性。突触囊泡蛋白CSP-α是一种重要生理机制的关键组成部分，在潜在的有害条件下维持突触前功能，例如在高频突触囊袋循环期间发生的条件。我们的研究突出了两个海马突触的特性的显著差异：（1）高度依赖CSP-α的Syt2-阳性GABA能突触和（2）谷氨酸能突触，它们的正常功能显然不需要CSP-β。对于进化上保守的蛋白质来说，这种情况原则上是令人惊讶的(Schmitz和Fernández-Chacón，2009年)并且在所有突触类型中普遍表达(Kohan等人，1995年). 然而，CSP-α在许多突触中的确切作用可能只有在生理极端或病理生理环境中才变得明显，例如癫痫期间的突触老化或突触过载。我们对培养神经元的观察为进一步研究健康和疾病中突触伴侣活动的分子机制奠定了基础。

脚注

这项工作得到了西班牙科学与创新部（MICINN）资助BFU2007-66008、安达卢西亚政府资助P07-CVI-02854和卡洛斯三世研究所（ISCIII）（R.F.-C.）的支持；卡斯蒂利亚社区委员会-拉曼查拨款PAI08-0174-6967（R.L.）；欧洲地区基金会（Fondo Europeo de Desarrollo Regional）、安达卢西亚政府拨款（Junta de Andalucia Grant P06-CVI-02392）和欧盟第六框架计划（欧洲神经科学研究所网络）拨款LSHM-CT-2005-019063。G.C.得到Sara Borrell计划（ISCIII）的支持，L.G.-S得到Formación de Personal Investigator计划（MICINN）的支持。我们感谢托马斯·苏霍夫博士对本手稿前一版本的建议和评论，感谢克里斯蒂安·罗森蒙德博士和玛丽卢斯·蒙特西诺斯博士的建议，感谢何塞·罗泽斯博士对本手稿的评论，感谢亚历杭德罗·阿罗约、玛丽亚·里韦罗、塞萨尔·德西雷斯、伊齐亚尔·贝尼托和胡安·L。Ribas（塞维利亚大学研究中心，Tecnología e Innovación de la Universidad de Sevilla）为您提供了卓越的技术援助。

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文章来自神经科学杂志由以下人员提供神经科学学会