表面活性蛋白A，平滑肌表型调节和血管重塑的新调节因子

动物：

Sprague-Dawley大鼠的雄性退休饲养者，体重450至500克，从Envigo购买。SPA缺陷（SPA−/−）小鼠购自杰克逊实验室（Sftpa1^tm1Kor公司，库存编号：004964）。基因外显子3和4的部分（碱基对795到1049）sftpa1型通过插入PGK-neo盒删除基因⁸.所有动物均在动物护理设施的常规条件下饲养，并按照国家医学研究学会制定的实验动物护理原则和《实验动物护理和使用指南》接受人道护理。所有动物手术程序均由佐治亚大学动物护理和使用委员会批准。性别是心血管疾病的关键生物变量⁹由于这是第一份研究SPA在血管疾病中的功能的报告，因此本研究仅使用雄性动物。然而，我们将在未来的研究中通过包括雄性和雌性动物来研究SPA在血管重塑中是否具有性别特异性作用。

细胞培养：

如前所述，通过酶消化法从大鼠或小鼠主动脉收集SMC^2,10,11简单地说，主动脉被分离并用1 mg/ml胶原酶消化30分钟。然后去除外膜和内皮，将剩余的培养基组织用于蛋白质提取或在含有10%胎牛血清（FBS，Hyclone）和5%L-谷氨酰胺的Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM，Invitrogen）中培养过夜。然后，将组织切成小块，用含有0.25 mg/ml胰蛋白酶、1 mg/ml胶原酶和0.5 mg/ml弹性蛋白酶的DMEM培养30分钟。通过添加10ml DMEM和10%FBS停止消化。收集细胞并用培养基清洗2次。然后将细胞维持在含有10%FBS和5%L-谷氨酰胺的DMEM中，温度为37°C，湿度为5%CO₂在空中。每48小时更换一次培养基。通过平滑肌α-肌动蛋白（ACTA2）和平滑肌肌球蛋白重链（MYH11）的表达确认原代培养的SMC。SMCs<6个通道，70%的汇流用于后续实验。在本研究中，SMC不是克隆种群。在PDGF-BB或20%FBS处理前，细胞饥饿24小时。

Western Blot分析：

如前所述进行Western blot¹²用含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液（50mmol/L Tris-HCI，pH 7.4，1%Triton X-100，0.25%wt/vol脱氧胆酸钠，150mmol/L NaCl，1mmol/L EGTA，0.1%SDS）从新分离的SMC或培养的原代SMC中提取蛋白质（Thermo Scientific）。使用BCA蛋白质分析试剂（Thermo Scientific）测定蛋白质浓度。用9%SDS-PAGE分离蛋白质并转移到PVDF膜（Bio-Rad）上。在室温下用5%的非脂肪乳封闭膜1小时，然后在4°C下用一级抗体孵育过夜，然后用HRP-结合二级抗体（Sigma-Aldrich）孵育1小时。使用增强化学发光试剂（Millipore）检测蛋白质带。免疫印迹试验使用抗SPA（Santa Cruz，Cat#SC13977，1μg/ml）、平滑肌α-肌动蛋白（ACTA2，Sigma-Aldrich，Cat#A2547，1μg/ml）、肌钙蛋白（Myocd，Abcam，Cat#Ab22073，1μg/m）或平滑肌肌球蛋白重链（MYH11，Biomedical Technologies Inc.，Cat#BT-562，2μg/ml）的一级抗体。

定量PCR（qPCR）：

如前所述进行qPCR¹²简单地说，使用1 ml Trizol试剂（Invitrogen）溶解动脉组织或SMC。然后将裂解产物转移到无RNase微型离心管中，并在室温（RT）下培养5分钟。然后向每个管中添加0.2 ml氯仿并剧烈摇晃15秒。在室温下孵育2分钟并在4°C下14000×g离心15分钟后，将上层水相转移到含有0.5 ml异丙醇的新试管中，并在室温下培养10分钟。然后通过4°C离心（14000×C）15分钟沉淀RNA。去除上清液，用1 ml 70%乙醇清洗RNA颗粒。将RNA溶解在20μl无RNase水中。使用iScript cDNA合成试剂盒（Bio-Rad）将1μg总RNA逆转录为cDNA。qPCR在Stratagene Mx3005 qPCR热循环机上进行，使用SYBR Green主混合物（安捷伦科技公司，加利福尼亚州拉霍亚）。本研究使用的引物序列为：SPA的5’TCC TGG AGA CTT CCA CTA CCT 3'（正向）和5’CAG GCA GCC CTT ATC ATT CC 3'（反向）；5‘CGC CAT CTA TGA GAA AAC C 3’（正向）和5‘GAT ACG CCA GGA ATT GT 3’（反向）用于TGF-β1；5“GAT GGG CTC TCT CCA GAT CAG 3'（正向）和5“GGC TGC ATC ATTC TTG TCA CTT 3'（反向）用于Myocardin；2011车型年款的5“GCT AAT CCA CCC CCG GAG TA 3”（前进）和5“TCG CTG AGC TGC CCT TTC T 3”（后退）；ACTA2为5‘AAT GGC TCT GGG CTC TGT AAG 3’（正向）和5‘CAC GAT GGA TGG GAA AAC AGC 3’（反向），亲环素为5‘CAG ACG CCA CTG TCG CTT T 3’（向前）和5’TGT CTT TGG AAC TTT GTC TG 3’（逆向）。

大鼠颈动脉损伤模型：

如前所述，建立大鼠颈动脉球囊损伤模型^1,2,11简单地说，大鼠通过吸入异氟醚麻醉。将2F Fogarty动脉栓塞术球囊导管（Baxter Edwards Healthcare，Irvine，CA，USA）插入左侧颈外动脉，并向胸主动脉推进4 cm，进入颈总动脉。用20μl生理盐水将球囊充气，然后在内皮剥脱过程中不断旋转，将球囊撤回颈动脉分叉处。该程序再重复两次，以确保完全内皮剥脱。术后1、3、7和14天，用生理盐水灌注球囊损伤的动脉段并将其取出。然后用4%多聚甲醛固定血管段，并将其包埋在石蜡中，然后进行形态计量学和组织学分析。

小鼠颈动脉损伤模型：

如前所述，对小鼠颈动脉进行机械诱导内皮剥脱¹³简单地说，用于动脉损伤的环氧树脂探针是通过在3-0尼龙缝线上形成环氧树脂珠制成的。缝合线上的珠子略大于颈动脉的直径。通过持续吸入异氟醚麻醉8周龄WT或SPA−/−小鼠。将小鼠固定，并用洗剂脱毛剂去除颈部的毛发。在解剖显微镜下暴露整个左颈动脉，包括其远端分叉。颈动脉外支在近端形成环状，并用6-0丝线在远端结扎（美国Fine Science Tools）。在6-0丝线之间进行横向动脉切开，树脂探针在颈总动脉内插入、推进和抽出五次。手术后14天内60分钟内完成手术，用生理盐水灌注受伤的动脉段并取出。然后用4%多聚甲醛固定血管段，并将其包埋在石蜡中，然后进行形态计量学和组织学分析。

组织形态计量学分析和免疫组织化学染色（IHC）：

通过连续切割对照和损伤动脉段，制作5μm厚的石蜡切片。收集每组血管段中均匀分布的10个切片进行分析。按照标准程序，使用改良苏木精-伊红（H&E）或Elastica van Gieson试剂对这些切片进行染色。图像是用尼康显微镜（尼康美国公司）拍摄的。用Image-Pro Plus软件测量损伤动脉的管腔周长、内部弹性层和外部弹性层。将受损SPA−/−动脉的新生内膜区域归一化为受损WT动脉，设为1。对于IHC染色，将切片重新水化，并在柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0，Abcam，ab93678）中用微波炉煮沸10分钟，以提取抗原。然后用0.3%过氧化氢孵育切片，用0.3%Triton X-100在PBS中渗透30分钟，用5%山羊血清封闭1小时，并在4°C下用初级SPA抗体孵育过夜。HRP-结合二级抗体（Sigma-Aldrich）在RT下孵育1 h。使用3,3'-二氨基联苯胺（DAB）检测SPA染色，并使用苏木精对切片进行复染。使用尼康显微镜采集染色图像，并使用Image J软件测量IHC阳性染色的强度。每组染色强度的平均值取自10个动脉切片。为了量化蛋白质水平，将每组IHC阳性信号减去背景信号的平均值校准为未损伤血管中染色强度的平均值，其中还减去背景信号。与对照组相比，蛋白质水平显示为信号强度的倍数增加，通过以下公式进行评估：[（损伤血管的IHC染色强度平均值-背景信号）/（未损伤血管IHC着色强度平均值–背景信号）]。

SP-A蛋白的表达和纯化：

人SPA cDNA克隆来自DNASU质粒库（Cat#HsCD00951577）。使用LR克隆酶II混合酶（ThermoFisher，Cat#11791020）将pDONR221（网关供体）中的SPA cDNA重组到哺乳动物网关目的载体pDEST™17（Thermo Fisher、Cat#11803012）。然后将该载体（pDEST-SPA）转化为BL21（DE3）活性细胞（New England Biolabs，Cat#C2527I），并用1 mM异丙基β-d-硫代吡喃半乳糖苷（ThermoFisher，Cat#15529019）诱导SPA蛋白表达24小时。用xTractor Buffer（日本Takara，Cat#63562）提取SPA蛋白并使用Capturem™His-Tagged纯化miniprep试剂盒进行纯化（日本塔卡拉，Cat#635710）。使用Microcon-10kDa离心过滤装置（Millipore，Cat#MRCPRT010）浓缩纯化的SP-A蛋白。

资金来源

这项工作得到了美国国立卫生研究院（HL123302、HL119053、HL135854和HL147313）的资助。