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.2011年4月29日；286(17):15050-7.
doi:10.1074/jbc。M110.202747。 Epub 2011年3月14日。

Smad3介导的心肌沉默：调控平滑肌分化启动的新机制

谢伟兵 1, 李祖国, 约瑟夫·米亚诺, 龙晓春, 陈世友
附属公司

Smad3介导的心肌沉默：调控平滑肌分化启动的新机制

谢伟兵等。 生物化学杂志. .

摘要

TGF-β和肌钙蛋白（MYOCD）对平滑肌细胞（SMC）的分化都很重要，但它们在调节SMC发育启动方面的确切作用尚不清楚。在TGF-β诱导多能干C3H10T1/2祖细胞SMC分化过程中，我们发现TGF-α在刺激18小时之前未显著诱导Myocd mRNA表达。另一方面，在TGF-β治疗后2或4小时，早期SMC标记物如SMα-actin、SM22α和SM calponin可检测到。这些结果表明，在TGF-β诱导的SMC分化的起始阶段，Myocd表达被阻断。与内源性表达一致，Myocd启动子活性在TGF-β刺激后18小时才升高。令人惊讶的是，Smad信号对Myocd的表达具有抑制作用，因为阻断Smad信号可以增强Myocd启动子的活性。Smad3而非Smad2的过度表达抑制了Myocd启动子的活性。相反，Smad3的shRNA敲除允许TGF-β在诱导的初始阶段激活Myocd启动子。Myocd被PI3激酶信号及其下游靶点Nkx2.5激活。有趣的是，Smad3不影响PI3激酶的活性。然而，Smad3与Nkx2.5发生物理交互。在TGF-β诱导的早期阶段，这种相互作用阻断了Nkx2.5与Myocd启动子的结合，导致Myocd mRNA表达受到抑制。此外，Smad3以剂量依赖的方式抑制Nkx2.5激活的Myocd启动子活性。综上所述，我们的结果揭示了Smad3介导的在SMC分化起始阶段抑制Myocd的新机制。

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数字

图1。
图1。
TGF-β诱导Myocd公司SMC早期标记激活后的表达。 A类和B类SMC标记物激活后，TGF-β诱导内源性心肌蛋白低水平表达。半定量RT-PCR检测mRNA表达的时间依赖性诱导(A类)和qPCR(B类). 亲环素是一种内部控制。Myocd公司TGF-β治疗18小时（5 ng/ml）后显著激活，而SMC早期标记物学报2,胶转蛋白、和Cnn1号机组在TGF-β诱导2或4小时时被激活。*，对与对照组（0h）相比，差异有统计学意义（p<0.05）。C类，通过Western blotting检测SMC早期标记的蛋白表达，并将其归一化为TUBA1。*，对与对照组（0h）相比，<0.05。D类，TGF-β激活Myocd公司SMC早期标记基因激活后的启动子活性。这个Myocd公司直到TGF-β刺激后18小时，启动子才被激活。*，对与车用治疗组（0h）相比，<0.01。
图2。
图2。
Smad信号被抑制Myocd公司在C3H10T1/2细胞中表达。 A类显性负Smad4（ΔSmad4）或Smad7增强对Smad信号的阻断Myocd公司启动子活性。用载体（−）或TGF-β处理细胞18小时*，对与pcDNA 3.0转染组和TGF-β治疗组相比，<0.01。B类，阻断Smad信号增强内源性Myocd公司表达式。用载体（−）或TGF-β处理细胞18 h，并进行qPCR检测Myocd公司mRNA表达。ΔSmad4增加Myocd公司表达式.*，对与pcDNA 3.0和TGF-β治疗组相比，<0.01。C类，Smad3（S3），但不是Smad2（S2），被阻断Myocd公司启动子活性。用载体或TGF-β处理细胞18小时*，对与经TGF-β治疗的pcDNA 3.0（Ctrl）或Smad2转染组相比，<0.01。D类，内源性Smad3被腺病毒Smad3 shRNA有效地击倒。E类，shRNA敲低Smad3阻断Smad3依赖的启动子活性。*，对与腺病毒（Ad）-GFP-和TGF-β治疗组相比，<0.01。F类和G公司，Smad3的击倒导致激活Myocd公司发起人(F类)和内源性Myocd公司表达式(G公司)在TGF-β诱导的早期（4和8小时），以及未经TGF-，对与Ad-GFP治疗组相比，每个时间点均<0.01。
图3。
图3。
Smad3在细胞核内滞留受阻Myocd公司在TGF-β诱导的晚期启动子激活。 A类免疫组化显示，TGF-β处理2h后，Smad3在细胞核（DAPI）中积聚。在诱导18小时时，Smad3的大部分穿梭回细胞质。腺病毒shRNA（Ad-shXPO4）敲低exportin 4后，Smad3大部分滞留在细胞核中。B类腺病毒shRNA抑制了exportin 4 mRNA的表达。C类和D类，Smad3的保留被阻止Myocd公司启动子激活(C类)和内源性mRNA表达(D类)在TGF-β诱导的晚期（18小时）。*，对与Ad-GFP治疗组和TGF-β治疗18小时组相比，P<0.01。
图4。
图4。
转化生长因子-β诱导的Myocd公司通过PI3K信号表达。 A类，PI3K抑制剂阻断TGF-β诱导的Myocd公司启动子活性。p38 MAPK的通路特异性抑制剂（SB203580，10μ米)，ERK（U0126，10μ米)，Rho激酶（Y27632，10μ米)，或PI3K（LY294002，10μ米)如图所示，在TGF-β治疗前2 h添加到细胞中。*，对与不含抑制剂的TGF-β治疗组相比，<0.01。B类和C类，PI3K抑制剂阻断TGF-β诱导的内源性Myocd公司表达式。10T1/2细胞接受或不接受通路抑制剂治疗2 h，然后接受载体或TGF-β（5 ng/ml）治疗18 h。Myocd公司用半定量RT-PCR检测mRNA水平(B类)和qPCR(C类). *,对与不含抑制剂的TGF-β治疗组相比，<0.01。D类PI3K和Smad3信号均在TGF-β治疗2 h时激活。E类，Smad3未阻断PI3K信号通路。Smad3的shRNA敲除对PI3K诱导的Akt磷酸化没有影响。
图5。
图5。
Nkx2.5介导的TGF-β-PI3K激活Myocd公司表达式。 A–C，Nkx2.5在TGF-β诱导后2 h即被激活。用qPCR检测NKx2.5 mRNA的表达(A类)Western blotting检测蛋白表达(B类)并归一化为TUBA1(C类). *,对与车用治疗组（0h）相比，<0.05。D类，Nkx2.5激活心肌启动子，有或没有18小时TGF-β诱导。**，对与车用pcDNA处理组相比<0.01；#，对与载体处理的Nkx2.5组相比<0.05；*，对与TGF-β处理的pcDNA组相比，<0.01。E类，Nkx2.5结合位点突变（NKEmt）被阻断Myocd公司启动子活性。Myocd公司用载体或TGF-β处理启动子转染细胞18小时，对与车辆处理的野生型相比<0.01(重量)发起人；*，对与TGF-β处理的WT启动子相比，<0.01。F类，Nkx2.5未能激活NKE突变Myocd公司发起人。10T1/2细胞与WT或NKEmt联合转染Myocd公司如图所示，启动子带有pcDNA或Nkx2.5表达质粒。然后将细胞饥饿18小时，然后进行荧光素酶分析。*，对与Nkx2.5转染的WT启动子相比，<0.01。
图6。
图6。
Smad3在SMC分化起始阶段与Nkx2.5发生物理相互作用。 A类在TGF-β诱导的早期，Smad3与Nkx2.5共同定位于10T1/2细胞的细胞核中。免疫染色显示，Smad3在TGF-β诱导的第2、4和8小时转位到细胞核中并与Nkx2.5共定位，但在转化生长因子-β诱导的18小时被穿梭回细胞质并与Nk x2.5分离。B类，内源性Smad3与Nkx2.5共同免疫沉淀。用Nkx2.5抗体或正常IgG免疫沉淀TGF-β处理的10T1/2细胞的细胞裂解物，并用Smad3抗体印迹。C类，内源性Nkx2.5与Smad3共同免疫沉淀。用Smad3抗体或正常IgG免疫沉淀细胞裂解物，并用Nkx2.5抗体印迹。D类Smad3-Nkx2.5物理相互作用需要Smad3磷酸化。Alk5抑制剂SB431542阻断Smad3磷酸化和核转位，抑制Smad3与Nkx2.5的co-IP。
图7。
图7。
Smad3阻止了Nkx2.5绑定到Myocd公司启动子并抑制Nkx2.5介导的启动子激活。 A类和B类，ChIP分析表明Nkx2.5与Myocd公司启动子在TGF-β诱导（Ad-GFP）18小时前保持不变。然而，在TGF-β诱导的早期阶段（2小时），腺病毒shRNA敲低Smad3（Ad-shSmad3）显著增强了Nkx2.5与启动子的结合。A类，代表性半定量PCR结果。B类，qPCR结果。*，对在TGF-β治疗0或2小时时与Ad-GFP组相比<0.01。**，对与未经TGF-β治疗（0 h）的Smad3 shRNA组（Ad-shSmad3）相比，<0.01。C类，Smad3阻塞Nkx2.5诱导Myocd公司启动子活性呈剂量依赖性，对与Nkx2.5单独治疗组相比，<0.01。
图8。
图8。
TGF-β的控制机制Myocd公司SMC分化起始阶段的转录。在SMC分化的起始阶段，Smad3被TGF-β激活并转移到细胞核，在那里与Nkx2.5结合。此交互阻止Nkx2.5绑定到Myocd公司启动子，从而抑制Myocd公司在起始阶段后，Smad3被穿梭回细胞质，释放Nkx2.5，导致Myocd公司激活。由于MYOCD是SMC标记基因的一种极强激活剂，因此在TGF-β诱导的初始阶段抑制其表达可以温和而精确地调节SMC分化程序的启动。Smad3是SMC基因的温和激活剂。一旦平台建立，MYOCD激活将加速分化过程。
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