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科学进展。2017年8月；3（8）：e1700677。
2017年8月16日在线发布。 数字对象标识：10.1126/sciadv.1700677
预防性维修识别码：项目编号559209
PMID：28835921

线粒体基因表达受损引发成人肥胖

卡拉·佩克斯，1 尼古拉·费雷拉，1 塔拉·里奇曼，1 朱迪思·埃尔默，1 伊琳娜·库兹涅佐娃，1 Anne-Marie J.Shearwood公司，1 理查德·G·李，1 海伦娜·维奥拉，2 维多利亚·P·A·约翰斯通，2 万斯·马修斯，三 利维娅·胡尔，2,4 奥利弗·瑞克汉姆，1,5和亚历山大·菲利波夫斯卡1,5,*
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关联数据

补充资料

RNA结合蛋白的减少会损害线粒体的生物发生并改变细胞信号传导，从而导致肥胖。

摘要

线粒体基因表达对能量生产至关重要；然而，人们对它如何影响生理和新陈代谢缺乏了解。来自五肽重复序列（PPR）家族的几个蛋白质对线粒体基因表达的调节至关重要，但该家族其余成员的功能尚不清楚。我们创建了敲除小鼠来研究PPR域1（PTCD1）蛋白的作用，并表明PTCD1的丢失是胚胎致死性的，而单倍体杂合小鼠会发展为年龄诱导的肥胖。线粒体蛋白质在体内单倍体不足的分子缺陷和代谢后果以前还没有研究过。我们发现，PTCD1单倍体不足导致RNA代谢增加，以应对蛋白质合成减少和RNA加工受损，从而影响呼吸链的生物发生，导致轻度解偶联和线粒体形态改变。我们证明，随着年龄的增长，这些影响会导致成年期肥胖，从而导致肝脏脂肪变性和心脏肥大，从而对哺乳动物雷帕霉素途径靶点的组织特异性差异调节作出反应。我们的研究结果表明，线粒体基因表达的变化对能量代谢有长期影响，这为PTCD1的单倍体不足可能是代谢综合征发生的主要诱因提供了证据。

简介

线粒体通过氧化磷酸化（OXPHOS）提供生命所需的大部分能量，使其对细胞功能至关重要。这些细胞器的内共生起源导致其生物发生依赖于两个基因组，即核基因组和线粒体DNA（mtDNA）。线粒体DNA编码13种OXPHOS系统成员的多肽，以及22种转移RNA（tRNA）和2种核糖体RNA（rRNA），所有这些都是合成所需的。剩余的核编码蛋白在细胞质核糖体上翻译，并通过共转录或转录后导入线粒体。因此，OXPHOS系统的生物发生和能量生产依赖于线粒体和核基因表达的协调调节。mtDNA的表达主要由RNA结合蛋白在转录后水平调节，这些结合蛋白参与RNA的加工、稳定性、成熟、翻译和降解[由Rackham评论等. (1)还有Hällberg和Larsson(2)]. 越来越多的线粒体蛋白质被发现影响RNA代谢和蛋白质合成；然而，它们的分子功能、对细胞前向和逆行信号传导的影响以及它们在体内丢失的生理后果仍然没有得到很好的表征。

遗传修饰和环境信号，包括饮食，可以通过导致线粒体转录物或线粒体蛋白质缺陷而改变线粒体脂肪和碳水化合物代谢，从而导致线粒体功能障碍，从而减少能量生产，这是许多遗传病的主要症状(三). 对于线粒体基因表达受损如何对细胞信号传导和生物体内不同组织的生理学产生下游或逆行影响，我们的理解存在重大分歧。由于线粒体RNA-结合蛋白（mt-RBP）是核编码的，对线粒体RNA（mt-RNA）代谢的调节至关重要，因此需要研究其表达或丢失如何影响体内线粒体和细胞功能。

五肽重复序列（PPR）蛋白是一个RNA结合蛋白家族，由于其对RNA靶点的序列特异性识别，最近在基因表达领域引起了极大的兴趣(4，5). 真核生物中的PPR蛋白在转录、RNA剪接、加工、编辑和翻译等细胞器内的基因表达中具有多种调节作用(6). 在哺乳动物中，只有七种PPR蛋白，它们都是线粒体蛋白，每种蛋白在线粒体基因表达的转录后调节中都有不同的作用，包括转录、加工、稳定性和翻译[由Rackham和Filippovska综述(7)]. 尽管线粒体RNA聚合酶（POLRMT）在转录中的作用，核糖核酸酶（RNase）P亚基MRPP3在加工和核糖体组装中的作用、LRPPRC在聚腺苷酸化和翻译中的作用以及两种小核糖体亚基蛋白PTCD3和MRPS27以前都有过研究(8–14)，对PPR结构域1（PTCD1）和PTCD2蛋白知之甚少(15，16).

最初，我们确定PTCD1是一种调节细胞线粒体基因表达的线粒体基质蛋白(16). PTCD1的敲除影响线粒体生物生成和能量生产所需的线粒体tRNA（mt-tRNAs）的加工(16). 我们还发现PTCD1与线粒体RNase Z或ELAC2蛋白相关(17)进一步表明它可能参与mt-RNA处理。为了了解PTCD1在体内的作用，我们创建了第1部分基因在小鼠中的表达，使我们能够了解其丢失如何影响线粒体和细胞功能。纯合子敲除第1部分是胚胎致死性的，而杂合子小鼠对于PTCD1来说是单倍体的，并发展成成年期肥胖，这为在体研究线粒体基因表达受损如何导致代谢综合征的发生提供了一个模型。

PTCD1单倍体不足导致蛋白质合成减少，影响RNA加工，导致复杂生物生成减少，耗氧量减少，OXPHOS解偶联。随着年龄的增长，PTCD1的减少导致短形式OPA1的积累和膜电位的降低，从而影响线粒体和嵴的形成。PTCD1水平随年龄降低而导致的分子和功能变化的特征表明，该蛋白通过通过磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMPK）逆行组织特异性哺乳动物雷帕霉素（mTOR）信号转导靶点，在代谢功能障碍和老年性肥胖中发挥了新的作用。杂合子(第1部分+/−)随着年龄的增长，小鼠的能量容量降低，代谢激素、生长因子和促炎细胞因子发生改变，导致组织特异性分子和病理改变，导致心脏迟发性肥大、肝脂肪变性和肥胖。

结果

平衡mt-RNA代谢需要PTCD1

PTCD1有一个N端线粒体靶向信号，将其定位于基质，并且至少有八个PPR在其与RNA的关联中发挥作用(16，18). 为了了解PTCD1在体内的作用，我们在小鼠体内产生了一个敲除等位基因第1部分胚胎干（ES）细胞中的基因（图S1A）和随后通过生殖系传播以获得杂合子第1部分+/−动物。互通式立交第1部分+/−产生的小鼠第1部分+/负极和第1部分+/+孟德尔比例的小鼠（基因型幼鼠，n个= 629;第1部分+/−，n个=402；和第1部分+/+，n个= 227); 然而，纯合敲除小鼠(第1部分−/−)不可行。线粒体基因表达相关基本蛋白的分析表明，胚胎第8.5天（E8.5）胚胎死亡(13，19–23); 因此，我们分析了这一阶段的胚胎以确定第1部分−/−与观察到的胚胎相比，胚胎发育不正常第1部分+/+和第1部分+/−因此，PTCD1的丢失是胚胎致死性的（图S1B）。因此，我们得出结论，PTCD1对胚胎发育和生存至关重要，就像迄今为止在小鼠体内敲除的其他三种哺乳动物PPR蛋白：POLRMT(11)，MRPP3(12)和LRPPRC(13).

这个第1部分+/−小鼠发育正常；雄性和雌性小鼠都能生育，它们的存活率与野生型同窝小鼠相似。然而，我们观察到，到30周大时第1部分+/−小鼠出现肥胖(图1A)与他们的体重相比要重得多第1部分+/+室友(图1B). 因此，我们分析了杂合子小鼠线粒体的分子和功能变化，并与对照同窝小鼠进行了比较。我们使用northern印迹来研究小鼠肝脏和心脏中mt RNA的稳态水平第1部分+/+和第1部分+/−老鼠。12的稳态水平S公司肝脏和心脏中的rRNA显著增加Ptcd1型+/−以及特定未加工和成熟mRNA的水平，如RNA19，mt-Nd5/Cytb，mt-Co1型，二氧化硫（mt-Co2），mt-Nd4升/4，mt-Nd5、和mt-Atp8/6(图1C). 成熟RNA的其余水平要么显示出增加的趋势，要么在第1部分+/−小鼠与对照组比较。例外情况是mt-Nd6和16S公司rRNA在第1部分+/−这表明PTCD1的减少对mt-RNA代谢产生了不同的影响。此外，我们发现mt-tRNA，特别是tRNA的总体增加亮氨酸（UUR），tRNA格林，tRNATrp公司和tRNA谷氨酸(图1C).

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单倍体不足第1部分影响mt-RNA代谢。

(A类)对照组之间尺寸和重量差异的照片表示(Ptcd1型+/+)和杂合子(第1部分+/−)10周龄和30周龄的小鼠。(B类)对照品重量（克）(Ptcd1型+/+，n个=6）和杂合子(第1部分+/−，n个=6）5、10、15和30周龄的小鼠。误差条表示SEM*对< 0.05, **对< 0.01, ***对<0.001，学生t吨测试。肝脏中未加工和成熟线粒体mRNAs、tRNAs和rRNAs的丰度(C类)和心脏(D类)30周第1部分+/+和第1部分+/−northern印迹法分析小鼠；18S公司rRNA被用作负荷对照。这些数据代表了从每个基因型的至少八只小鼠和三个独立的生物学实验中获得的结果。(E类)平均RNA-Seq覆盖率的基因组浏览器视图（log2折叠变化意思是/Ctrl键意思是])三个人的肝脏和心脏第1部分+/+和三个第1部分+/−30周龄小鼠（平均标准化计数）显示mt-tRNA区域Trp公司以及PTCD1降低时对3′端加工的下游影响。(F类)平均RNA序列覆盖率的基因组浏览器视图（log2折叠变化意思是/Ctrl键意思是])三个人的肝脏和心脏第1部分+/+和三个第1部分+/−30周龄小鼠（平均标准化计数）显示mt-tRNA区域亮氨酸（UUR）以及PTCD1降低时对3′端加工的下游影响。(G公司)mt-RNA连接在来自第1部分+/+和第1部分+/−通过qRT-PCR检测30周龄小鼠，并将其归一化为18S公司rRNA。误差条表示SEM*对<0.05，学生的t吨测试。

PTCD1减少对心肌线粒体的影响第1部分+/−小鼠表现出与肝线粒体相似的趋势，但变化幅度较小(图1D). 在心里，12S公司rRNA，RNA19，二氧化硫（mt-Co2），mt-Nd1号，mt-Nd2（百万奈米）、和mt-Nd4升/4也显著增加，并且大多数其他tRNA和mt-mRNA在第1部分+/−小鼠与对照组的比较(图1D)在杂合小鼠的肝脏中观察到。这些数据表明，PTCD1的单倍体不足导致mt-RNA转录增加和mt-RNA代谢失衡。

在我们之前的工作中，我们发现PTCD1影响在高糖环境下生长的细胞中的mt-RNA处理，导致细胞内RNA19包括16个S公司rRNA、tRNA亮氨酸（UUR）、和mt-Nd1号区域(17). 因此，为了研究体内PTCD1减少对整个线粒体转录组的整体影响，我们使用了一种已建立的RNA测序（RNA-Seq）方法(12)其中，较罕见的转录物（如前体和部分处理的转录物）的变化可以更深入地进行可靠识别。在这里，我们应用了同样的方法，用三个人的心脏和肝脏制作了文库第1部分+/+和三个第1部分+/−在小鼠中，我们捕获了整个线粒体转录组的较长读码，并排除了短RNA，如tRNA，以分析受PTCD1减少影响最大的位点（图S2和S3）。我们证实了我们的northern印迹的结果，即成熟的信使核糖核酸以及前体，如RNA19区域，在第1部分+/−老鼠。与心脏相比，这些小鼠的肝脏中的作用更为显著，尽管心脏中的mt-RNA含量较高，约占总RNA的30%(24). 此外，我们观察到跨越特定tRNA编码区的前体转录物积累增加（图S2和S3）。经过仔细检查，我们发现心脏和肝脏线粒体转录体中的积累特别偏向3′端，这表明PTCD1优先影响这些加工位点。这在跨越tRNA的区域中尤为明显Trp公司和tRNA亮氨酸（UUR）(图1、E和F）。我们使用定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）来验证这些连接处的处理事件，并确认它们在第1部分杂合小鼠与对照组的比较(图1G)进一步表明，PTCD1减少导致RNA转录和前体转录物积累增加。

减少PTCD1降低线粒体编码蛋白的从头合成蛋白和大核糖体蛋白的稳定性

老年人肝脏和心脏线粒体蛋白的免疫印迹第1部分+/+和第1部分+/−小鼠表明，与对照组相比，杂合小鼠的PTCD1蛋白水平低约50%，这表明在这些小鼠中观察到的分子缺陷的基础是单倍体不足，这与肝脏和心脏线粒体的情况一致(图2、A和B）。因此，我们通过免疫印迹法研究了PTCD1单倍体不足对线粒体和核编码OXPHOS多肽的影响(图2C)和心脏线粒体(图2D)并发现它们的稳态水平在第1部分+/+和Ptcd1型+/−除细胞色素c氧化酶亚基I（COXI）外，杂合小鼠的肝脏中COXI减少。接下来，我们分析了PTCD1减少对调节基因表达和RNA加工的线粒体蛋白质的影响(图2、E和F）。尽管TFAM和RNase P蛋白MRPP1和MRPP2的水平没有差异，但我们发现线粒体RNase Z酶（ELAC2）的水平显著降低，该酶负责从第1部分+/−小鼠与对照组的比较(图2、E和F）。这进一步表明PTCD1参与线粒体内RNA成熟。

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PTCD1减少导致线粒体蛋白质合成减少。

30周龄婴儿肝脏和心脏线粒体线粒体蛋白质（25μg）第1部分+/+和三个第1部分+/−用4到20%的SDS-PAGE凝胶溶解小鼠，并对抗体进行免疫印迹，以研究核和线粒体编码蛋白的稳态水平。琥珀酸脱氢酶复合物亚基A（SDHA）用作负荷对照。肝脏PTCD1水平降低约50%(A类)和心脏(B类)线粒体，表明其单倍体不足。肝线粒体和核编码OXPHOS蛋白的免疫印迹(C类)和心脏(D类)线粒体。肝脏中核编码线粒体DNA和RNA结合蛋白的免疫印迹(E类)和心脏(F类)线粒体。显示肝脏线粒体核糖体蛋白水平的免疫印迹(G公司)和心脏(H（H）)线粒体。使用ImageJ软件测量蛋白质的相对丰度，并将其归一化为负荷控制。误差条表示SEM*对< 0.05, **对< 0.01,***对<0.001，学生t吨测试。这些数据代表了从每个基因型的至少六只小鼠和三个独立的生物学实验中获得的结果。肝脏从头合成蛋白质(我)和心脏(J型)来自第1部分+/+和三个Ptcd1型+/−通过脉冲掺入法测量小鼠35S标记的蛋氨酸和半胱氨酸。用SDS-PAGE分离等量的线粒体蛋白（50μg），并用放射自显影术观察。显示了来自三个独立生物实验的代表性凝胶。此图中的所有研究均在30周龄小鼠中进行。

我们之前已经证明mt-RNA处理受损会影响线粒体核糖体蛋白的稳定性(12，17); 因此，我们研究了PTCD1的减少是否影响其稳定性。免疫印迹显示，只有大核糖体亚单位蛋白MRPL37和MRPL44在肝线粒体中的水平从第1部分+/负极小鼠，但不在分析的小核糖体亚基蛋白MRPS16、MRPS34和MRPS35中(图2G). 心脏线粒体中大小亚基的线粒体核糖体蛋白水平与第1部分+/+和第1部分+/−老鼠(图2H)表明与心脏相比，肝脏线粒体核糖体蛋白受PTCD1减少的影响更大。

接下来，我们通过从头标记研究线粒体蛋白质合成，以确定PTCD1的减少是否影响新生成多肽的翻译速率。我们发现肝线粒体中大多数多肽的翻译减少第1部分+/−老鼠(图2I). 对心脏线粒体蛋白质合成的影响第1部分+/−小鼠很细微，尽管与免疫印迹法和northern印迹法观察到的心脏线粒体中较轻微的变化相一致(图2J). 在40周龄的老年小鼠中，我们观察到肝脏和心脏线粒体中的蛋白质合成减少第1部分+/−小鼠（图S4、A和B），表明心脏中的分子变化随着年龄的增长更加明显，反映了心脏中mt-RNA的含量更高(24). 这些变化在稳态蛋白水平上是一致的，其中OXPHOS复合物和线粒体编码的COXII和COXIII亚基的免疫印迹显示，从40周龄开始，肝和心脏线粒体中的线粒体显著减少第1部分+/−小鼠（图S4、C和D），尽管其在肝脏中的作用更为明显，表明与心脏相比，肝脏受PTCD1减少的影响更大。我们的结论是，尽管成熟mt-RNA水平增加，但PTCD1等位基因丢失导致从头翻译减少，这表明转录增加可能是对蛋白质合成减少的一种补偿反应。

PTCD1对线粒体呼吸复合体的生物发生和功能至关重要

我们测量了肝脏和心脏线粒体的耗氧量，以确定PTCD1水平降低时线粒体呼吸功能是否受到影响。以谷氨酸/苹果酸或琥珀酸为底物的线粒体状态3和状态4呼吸在肝脏中显著降低(图3A)但不是心(图3B)30周龄的线粒体第1部分+/负极老鼠。类似地，在存在解偶联剂羰基氰化物的情况下测量的呼吸链的最大容量第页-三氟甲氧基苯腙（FCCP）在肝线粒体中也显著减少第1部分+/−小鼠与对照组的比较(图3A). 我们还研究了PTCD1减少对40周龄小鼠线粒体呼吸的影响，并表明在这些老年小鼠中第1部分+/−小鼠与对照组进行比较（图S4、E和F）。随着年龄的增长，PTCD1减少对OXPHOS容量的影响更加明显，因为10周龄的小鼠具有正常的OXPHOS功能（图S5、A和B）。这些发现表明，肝脏中的线粒体功能在心脏之前受到影响，进一步表明，当线粒体基因表达受损时，心脏中过量的mt-RNA可能会补偿和保护其功能。

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PTCD1减少影响呼吸链的生物发生，导致轻度解偶联和线粒体形态改变。

在高达3μM FCCP的情况下，在肝脏中测量磷酸化（状态3）和非耦合呼吸(A类)和心脏(B类)4名30周龄儿童的线粒体第1部分+/+和四个第1部分+/−使用OROBOROS氧电极的小鼠，使用丙酮酸、谷氨酸、苹果酸或琥珀酸作为底物，并加入抑制剂。离体肝脏(C类)和心脏(D类)30周龄小鼠的线粒体（75μg）用1%处理n个-十二烷基-β-d日-麦芽糖苷，在4~16%BN-PAGE凝胶上溶解。使用蓝色天然OXPHOS鸡尾酒抗体进行免疫印迹，以可视化呼吸复合物。误差条表示SEM*对< 0.05, **对<0.01，学生的t吨测试。In-gel活性染色用于肝脏中的复合V(E类)和心脏(F类)线粒体。肝脏中OPA1和OMA-1的稳定水平(G公司)和心脏(H（H）)至少8个细胞的线粒体第1部分+/+和八个第1部分+/负极用SDHA作为负荷对照，通过免疫印迹法测定小鼠。误差条表示SEM**对< 0.01, ***对<0.001，学生t吨测试。线粒体形态和嵴结构第1部分+/+和四个第1部分+/负极肝脏(我)和心脏(J型)使用TEM测定。这些数据代表了从每个基因型至少三只小鼠获得的结果。比例尺，0.25μm（底部面板）和1μm（顶部面板）。在肝脏中测量MICOS复合物蛋白的丰度(K（K）)和心脏(L（左）)至少8个细胞的线粒体第1部分+/+和八个第1部分+/−小鼠使用免疫印迹法。SDHA被用作加载控制。误差条表示SEM***对<0.001，学生t吨测试。

因为线粒体呼吸在第1部分+/−用蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（BN-PAGE）分析小鼠线粒体呼吸复合物水平。我们观察到第1部分+/−小鼠与对照组相比，复合物I和III略有减少，但在第1部分+/−心脏线粒体(图3、C和D）。我们进一步量化了每种复合物的BN-PAGE和免疫印迹后的变化，以证实从第1部分+/−小鼠与对照组相比，复合物III略有减少(图3C); 然而，杂合子和野生型小鼠心脏线粒体的呼吸复合物水平没有显著变化(图3D). 为了研究复合物V（三磷酸腺苷合酶）的组装和活性，我们使用BN-PAGE，然后进行凝胶内活性染色(图3、E和F）。腺苷三磷酸酶活性显著降低，ATP合成酶单体形式减少，肝线粒体ATP合成成酶二聚体和F1亚复合物显著减少第1部分+/−小鼠与对照组的比较(图3E). 相反，心脏线粒体中ATP合酶的活性或水平与第1部分+/+和第1部分+/−老鼠(图3F). 这些发现与我们测量的年轻人和成年人的ATP/ADP（二磷酸腺苷）比率一致第1部分+/+和第1部分+/−小鼠（图S4、E和H），其中我们观察到老年人肝脏中ATP水平显著降低约50%第1部分+/−小鼠（图S4G），与OXPHOS功能降低、线粒体解偶联和复合V活性和水平降低一致。我们的研究结果表明，PTCD1的单倍体不足和线粒体中蛋白质合成的减少可能会对OXPHOS系统的稳定性和功能产生组织特异性的下游后果。

杂合子第1部分小鼠重塑了嵴并改变了线粒体形态

动力素样鸟苷三磷酸酶OPA1介导线粒体融合和分裂并调节线粒体嵴形态(25). OMA-1和YME1L肽酶对OPA1的加工通过平衡OPA1（L-OPA1）长亚型和OPA1（S-OPA1）短亚型的分布，对正常线粒体形态至关重要，这两种亚型对维持融合和裂变分别很重要[由MacVicar和Langer评论(26)]. 最近，OPA1和嵴重塑被认为与呼吸复合物的组装和稳定性及其功能有关(27，28). 因为我们发现第1部分+/−小鼠轻度解偶联，这种解偶联影响呼吸复合体，我们研究OPA1及其加工肽酶OMA-1的加工是否也受到影响。肝脏线粒体中第1部分+/−小鼠，我们发现L-OPA1水平降低，S-OPA1丰度显著增加(图3G)，而OPA1的短亚型和长亚型的水平在来自第1部分+/+和第1部分+/−老鼠(图3H). 此外，金属蛋白酶OMA-1在肝线粒体中增加Ptcd1型+/−与各自的对照组相比，这些小鼠的线粒体中没有(图3、G和H）。肝线粒体线粒体膜电位降低第1部分+/−30周龄小鼠与对照组和小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）的比较第1部分+/−小鼠与对照组相比（图S6、A和B），与呼吸测量结果一致。此外，我们观察到第1部分+/−MEF与对照组相比，尤其是在低葡萄糖或半乳糖中生长时（图S6C）。

利用透射电子显微镜（TEM）研究了与心脏相比，膜电位降低和S-OPA1水平升高对肝脏线粒体形态的影响第1部分+/−小鼠及其各自的对照第1部分+/+老鼠(图3、I和J）。在…的肝脏里第1部分+/−与对照组小鼠相比，我们观察到线粒体嵴较少(图3I). 在第1部分+/−小鼠，线粒体的形态比肝脏受到的影响小，尽管周围较小的线粒体数量较多，肌纤维的z线密度较小(图3J). 大多数心脏线粒体的中空部分缺乏嵴，尽管这不像在肝脏中那样明显第1部分+/−老鼠(图3、I和J，下部面板）。

由于我们观察到线粒体及其嵴的形态学变化，我们接下来分析线粒体接触位点和嵴组织系统（MICOS）成分的丰度是否在线粒体的线粒体接触位点中受到影响Ptcd1型+/−小鼠与对照组的比较(图3、K和L）。我们用免疫印迹法检测与内膜相关的MICOS成分，如APOO和APOOL，因为我们发现PTCD1定位于基质和线粒体内膜(16). 肝脏或心脏线粒体中这些蛋白质的水平在第1部分+/+和第1部分+/−老鼠。然而，先前确定与OPA1相互作用的MICOS蛋白CHCHD3的水平(29)，在肝线粒体中显著增加Ptcd1型+/−小鼠与对照组的比较(图3K)或两种基因型的心脏线粒体(图3L). 总之，这些数据表明线粒体的轻度解偶联影响其形态和嵴以及与OPA1密切相关的MICOS成分，并改变了OPA1短亚型和长亚型的平衡。随着时间的推移，PTCD1的单倍体不足不能通过CHCHD3的增加来补偿，以克服S-OPA1解偶联和积累引起的形态变化。

杂合子型成人心脏肥大和肝脂肪变性第1部分+/−老鼠

此前，我们发现负责5′端tRNA加工的线粒体RNase P复合体的内切酶组分MRPP3在心脏中完全敲除导致严重心肌病，随后在11周时过早死亡(12). 虽然第1部分+/−小鼠不会在这么早的时候死亡，PTCD1的单倍体不足会导致RNA代谢/蛋白质合成缺陷，随着年龄的增长，这些缺陷足以导致线粒体功能障碍和体重显著增加(图1A). 因此，我们分析了第1部分+/−小鼠与第1部分+/+研究蛋白质合成减少、OXPHOS解偶联和线粒体形态改变如何加剧功能障碍并导致病理改变。肝切片的油红O染色显示小脂滴在肝组织中广泛堆积第1部分+/−小鼠，随着年龄增长而导致明显的纤维化(图4、A和B）。成年人的肝脏第1部分+/负极小鼠受到慢性损伤，观察到大量卵形肝祖细胞(图4A). 肝脏的苏木精和伊红（H&E）染色进一步证实，双核肝细胞是再生肝的主要分裂细胞类型第1部分+/−小鼠与对照组的比较(图4B). 我们还观察到肝血管数量增加，这可能是一种补偿性效应，以增加流向受损肝脏的血液流量。总之，这些结果表明第1部分+/−小鼠出现肝脏脂肪变性。

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第1部分+/−小鼠出现肝脂肪变性和心肌肥大。

(A类)从30周龄开始，分别用H&E或油红O和苏木精对切割至5或10μm厚的肝脏切片进行染色第1部分+/+(n个=6）和第1部分+/−(n个=6）小鼠。(B类)使用ImageJ定量测量油红O染色。数值为平均值±SEM*对<0.05，学生的t吨测试。(C类)ECG参数第1部分+/+(n个=5）和第1部分+/−(n个=5）40周龄小鼠。左室舒张末期内径；LVESD，左室收缩末期内径；FS，分数缩短；LVDPW，舒张期左室后壁；LVSPW，收缩期左室后壁；IVDS，舒张期室间隔；IVSS，收缩期室间隔；心率。数值为平均值±SEM*对与相比<0.05第1部分+/+, **对<0.01，学生的t吨测试。(D类)切割至5μm厚的心脏切片用来自老年人的H&E染色第1部分+/+(n个=6）和第1部分+/−(n个=6）小鼠。比例尺，100μm。增大的心脏被确定为相对于胫骨长度的心脏重量的量度*对与相比<0.05第1部分+/+，学生的t吨测试。尺寸差异的图片表示Ptcd1型+/+和第1部分+/−成年小鼠的心脏。

在ELAC2基因突变的患者中，3′端tRNA处理受损会导致心肌病(30); 因此，对老年人进行了超声心动图（ECG）检查第1部分+/−和第1部分+/+老鼠。第1部分+/−小鼠心脏功能的改变与心肌肥厚的发展相一致，包括收缩时左心室后壁和舒张时室间隔显著增加（壁厚），左心室收缩末期直径显著减小（收缩室变窄），缩短分数增加，心脏收缩过度(图4C). 老年心脏的H&E染色第1部分+/−小鼠的细胞核变大，在心脏组织中分布更稀疏，与心脏增大的大小一致，表明心脏肥大(图4D). 这些结果表明，PTCD1的减少对肝脏和心脏都有随着年龄增长而产生的病理后果，尽管在杂合小鼠的肝脏中发现了更严重的分子变化。

成人肥胖第1部分+/−小鼠导致葡萄糖不耐受和胰岛素抵抗

为了研究PTCD1单倍体不足的代谢后果，我们监测了Ptcd1型+/+和第1部分+/−5-30周龄的小鼠。在这段时间里，我们通过测量每周食物的输入和输出来记录他们的体重增加和食物摄入。Ptcd1型+/−小鼠的饮食习惯、胃口或食物摄入量与第1部分+/+5至30周龄的小鼠。在5至15周的年龄段Ptcd1型+/−小鼠及其野生型窝鼠(图5A). 从15周开始第1部分+/−与对照组相比，小鼠的体重开始显著增加，到30周大时，第1部分+/−相比于第1部分+/+老鼠(图5A). 成人腹腔附睾垫重量的测量显示内脏脂质沉积更大第1部分+/−小鼠比第1部分+/+小鼠之间的脂质沉积无差异第1部分+/−和第1部分+/+10周龄小鼠(图5B).

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PTCD1减少会导致成年期肥胖和胰岛素抵抗。

(A类)从5周龄到30周龄之间体重增加的百分比第1部分+/+(n个=12）和第1部分+/负极(n个=12）只小鼠*对< 0.05, **对< 0.01, ***对<0.001，学生t吨测试。(B类)年轻人和成年人腹腔附睾脂肪垫的重量（单位：克）第1部分+/+(n个=4）和第1部分+/−(n个=4）小鼠。(C类)10周龄和15周龄儿童的葡萄糖耐量第1部分+/+(n个=12）和第1部分+/−(n个=12）只小鼠（幼鼠）。(D类)30周龄婴儿的葡萄糖耐量第1部分+/+(n个=12）和第1部分+/−(n个=12）小鼠（老年小鼠）。(E类)11周龄和16周龄婴儿的胰岛素敏感性第1部分+/+(n个=12）和第1部分+/−(n个=12）只小鼠（幼鼠）。定量值为曲线下面积（AUC）±SEM*对<0.05，学生的t吨测试。(F类)30周龄婴儿的胰岛素敏感性第1部分+/+(n个=12）和第1部分+/−(n个=12）只小鼠。定量值为AUC±SEM**对<0.01，学生的t吨测试。

葡萄糖耐量试验（GTT）Ptcd1型+/+和第1部分+/−喂食正常饮食（NCD）的小鼠表明第1部分+/负极小鼠在15周龄和30周龄时具有葡萄糖不耐受性(图5、C和D）。胰岛素耐受性测试（ITT）显示，在生命早期，即11周时第1部分+/−小鼠轻度胰岛素敏感性；然而，到16周龄时第1部分+/+和第1部分+/−老鼠(图5E). 随后，在30周龄时第1部分+/−与野生型小鼠相比，小鼠出现了胰岛素抵抗(图5（E和F），这与他们在这个年龄段的体重增加和葡萄糖不耐症相一致。这表明，随着年龄的增长，第1部分+/−与对照鼠相比，小鼠的葡萄糖耐量降低，胰岛素抵抗增加，表明随着年龄增长，蛋白质合成减少会损害线粒体功能和膜形态，从而导致代谢转换，导致体重增加，继而对胰岛素的代谢脱敏。

PTCD1减少导致早期激素变化，从而导致线粒体功能障碍引起疾病的发展

胆固醇和甘油三酯、胰岛素、瘦素、白细胞介素-6（IL-6）和成纤维细胞生长因子21（FGF-21）水平的改变都与肥胖和代谢综合征的发生有关(31). 因此，我们通过酶联免疫吸附试验（ELISA）研究了10至30周龄婴儿血清中参与糖脂代谢的激素和生长因子水平，以及对食物摄入和能量消耗的调节第1部分+/−和第1部分+/+老鼠喂食非传染性疾病。在10周龄的小鼠中，胰岛素、甘油三酯、胆固醇和IL-6的水平在统计学上没有差异第1部分+/+和第1部分+/−小鼠，而瘦素和FGF-21在第1部分+/−老鼠(图6A). 相反，我们发现30周大的婴儿甘油三酯、IL-6、瘦素和FGF-21水平显著升高第1部分+/−老鼠与第1部分+/+老鼠(图6B). 甘油三酯和瘦素的增加与体重的显著增加一致，FGF-21的升高与心脏功能障碍一致，正如之前在其他心脏病模型中观察到的那样，这导致其被用作线粒体功能障碍的标志(32，33). IL-6水平升高与肝损伤相一致第1部分+/−涉及线粒体功能障碍和代谢综合征的小鼠。在10周龄和30周龄的肝脏中，发现应激激活蛋白激酶（SAPK）/c-Jun N末端激酶（JNK）的磷酸化增加，以应对IL-6的显著升高Ptcd1型+/−小鼠与第1部分+/+老鼠(图6C). 同样，在10周龄和30周龄的心脏中发现SAPK/JNK磷酸化增加第1部分+/−小鼠与对照组的比较(图6D)表明炎症信号通路在肝脂肪变性和心肌肥大的发展中激活。

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代谢激素、生长因子和促炎细胞因子随着年龄的增长而增加第1部分+/−老鼠。

(A类)测定10周龄婴儿血清中的胰岛素、甘油三酯、胆固醇、IL-6、瘦素和FGF-21水平第1部分+/+(n个=6）和第1部分+/−(n个=6）小鼠。(B类)测定30周龄婴儿血清中的胰岛素、甘油三酯、胆固醇、IL-6、瘦素和FGF-21水平第1部分+/+(n个=6）和第1部分+/−(n个=6）小鼠。SAPK/JNK及其磷酸化形式（Thr183/Tyr公司185)通过免疫印迹法对10周龄的全肝和心脏裂解物进行测定(C类)或30周龄(D类)第1部分+/+和第1部分+/−老鼠。GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）被用作负载对照。误差条表示SEM*对< 0.05, **对< 0.01, ***对<0.001，学生t吨测试。

线粒体功能障碍严重程度对mTOR通路的组织特异性调节

严重的线粒体功能障碍已被证明通过mTOR复合物1（mTORC1）刺激mTOR通路的上调，以增加胞浆蛋白合成，作为克服OXPHOS缺陷的一种补偿措施(34–36). 因此，我们研究了这些通路，以确定线粒体功能障碍如何导致这些细胞信号通路的逆行变化。免疫印迹显示Akt磷酸化在小鼠肝脏中显著增加第1部分+/−小鼠与Ptcd1型+/+老鼠(图7A)相对于Akt的稳态水平。接下来，我们研究了小鼠肝脏中的mTOR信号通路第1部分+/−与对照组相比，mTOR的稳态和磷酸化水平均显著降低(图7A). 因为mTORC1和mTORC2的形成因mTOR与猛禽或Rictor的关联而不同，[约翰逊评论等. (36)]，我们分析了对这两种蛋白质的影响。我们在第1部分+/−与对照组小鼠相比，Rictor（但不是Raptor）的水平显著降低(图7A). 对肝脏中mTORC1通路下游底物、核糖体蛋白S6和翻译起始物4E-BP1的分析表明，它们的稳态水平或磷酸化状态没有显著变化(图7A). 线粒体ATP/ADP水平的变化通过AMPKα的磷酸化来检测，AMPKβ磷酸化的增加抑制了mTORC1信号(36). 在…的肝脏里第1部分+/−小鼠，我们发现AMPKα的磷酸化增加(图7B)与ATP水平降低（图S4G）和mTOR磷酸化降低一致(图7A)与对照组相比。总之，这些数据表明第1部分+/−小鼠通过mTORC2途径发挥作用。

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mTOR信号通路受线粒体功能障碍的差异调节第1部分+/负极老鼠。

使用肝脏中mTOR上游和下游的特异性抗体通过免疫印迹法评估mTOR途径(A类)和心脏(C类)裂解物来自第1部分+/+和第1部分+/负极使用GAPDH作为负荷控制的30周龄小鼠。免疫印迹法用于测量磷酸化（Thr）的丰度172)和肝脏中AMPKα的非磷酸化形式(B类)和心脏(D类)30周龄的裂解物第1部分+/+和第1部分+/−使用GAPDH作为负荷控制的小鼠。使用ImageJ软件测量蛋白质的相对丰度，并将其归一化为负荷控制。误差条表示SEM*对< 0.05, **对< 0.01, ***对<0.001，学生t吨测试。这些数据代表了从每个基因型的至少六只小鼠和三个独立的生物学实验中获得的结果。

虽然我们发现Akt在心脏和肝脏组织中的磷酸化增加第1部分+/−小鼠与第1部分+/+对照组，我们发现mTOR及其底物S6和4E-BP1仅在心脏组织中磷酸化增加第1部分+/−老鼠(图7C). 在这里，我们还发现杂合子心脏中猛禽的水平增加，而杂合子小鼠和对照小鼠之间的猛禽水平没有差异(图7C). mTOR信号的增加与心肌AMPKα磷酸化状态的降低相一致第1部分+/负极小鼠与对照组的比较(图7D). 与肝脏相比，心脏中的这些相反作用表明，mTORC1信号在PTCD1杂合子小鼠的心脏中被激活，证实了mTOR对高增殖组织（如肝脏）和有丝分裂后组织（如心脏）之间线粒体功能障碍的不同调节。

讨论

mt-RBP是哺乳动物线粒体基因表达和生物发生的关键，通过调节转录、RNA加工、RNA成熟、稳定性和翻译(1，2). 这一点从编码不同mt-RBP的核基因突变中可以明显看出，包括LRPPRC、ELAC2、MRPP1和TACO1，这些突变会导致人类线粒体功能障碍、疾病和频繁死亡(30，37–39). 此外，mt-RBP被敲除的小鼠模型表明，它们对胚胎发育和生存至关重要(10，12，13，21，23). 在这里，我们表明PTCD1对生命是必不可少的，即使这种蛋白的单倍不足也会导致线粒体功能障碍、代谢缺陷和疾病，这在mt-RBP之前是没有观察到的。PTCD1减少对体内mt-RNA代谢有显著影响，尤其是因为PTCD1的减少也会影响线粒体RNase Z的水平，但不会影响RNase P的水平，这验证了我们之前确定的PTCD1与ELAC2的相关性(17). 尽管存在加工缺陷，但我们观察到大多数成熟的mt-RNA增加，这可能是转录增加的结果，之前在RNA加工和稳定性受到影响的模型中观察到的结果(12，22). 正是转录的增加可能弥补了生命早期未处理转录物的积累，因为我们没有看到OXPHOS功能的明显变化，也没有看到几个核和线粒体编码的OXPHOS多肽稳态水平的稳定，尽管在从头线粒体蛋白质合成方面存在缺陷。然而，随着年龄的增长，我们发现OXPHOS在第1部分由于mt-RNA处理的持续不平衡和蛋白质合成的减少，杂合小鼠的线粒体降低，线粒体解偶联。我们发现，与心脏线粒体相比，肝线粒体的分子缺陷更严重第1部分杂合子小鼠即使随着年龄增长，也可能反映出线粒体转录物丰度的差异，这是这些组织能量需求的结果。心脏是有丝分裂后的组织，有过多的mt-RNA(24)这可能使其能够在短时间内应对能源需求的突然变化。相反，肝脏是一个高度增殖的组织，mt-RNA约占肝脏总RNA的12%，这可能使该组织在发育或能量需求变化期间几乎没有能力处理线粒体翻译和蛋白质水平的扰动。

三磷酸腺苷合成酶和复合物III水平的降低第1部分杂合小鼠是这些小鼠蛋白质合成减少的直接结果，随着年龄的增长这一点更加明显。因为ATP合成酶和呼吸复合物已被证明在线粒体内膜嵴形态的形成和维持中发挥作用(27，40–42)PTCD1的减少以及对OXPHOS系统和ATP水平的下游影响，可能足以诱导OPA1的应激和裂解，从而导致S-OPA1的积累，尽管这种影响很轻微。S-OPA1和L-OPA1水平的平衡对于维持正常嵴形态很重要(43)其中S-OPA1水平升高可导致线粒体嵴重塑(44，45)正如我们在杂合子肝脏中观察到的那样，这会导致疾病第1部分老鼠。此外，OPA1的减少已被证明在线粒体功能障碍和迟发性心肌病中起作用(46)类似于第1部分+/−老鼠。缺乏OMA-1（OPA1的加工肽酶）的小鼠会导致OPA1亚型分布不平衡，代谢功能发生变化，导致能量消耗减少，脂肪质量增加，葡萄糖代谢途径中的生热和转录变化减少，导致肥胖和肝脂肪变性(44，47). 我们还发现，线粒体大核糖体亚基蛋白水平降低，这可能会由于内膜和嵴的变化而影响大核糖体亚基的组装，因为大核糖体亚基锚定在线粒体内膜上。在我们的模型中，据我们所知，我们首次表明线粒体基因表达的改变可以引发影响OPA1处理的缺陷，并产生类似的代谢后果，包括脂肪沉积增加、心肌病和肝脂肪变性。我们的模型表明，线粒体基因表达的平衡调节可以是组织特异性的，而mt RNA缺陷可以根据组织的能量需求产生不同的影响。

MICOS复合体在线粒体生物发生所需的嵴组织和形态中起着重要作用(48，49). 尽管杂合小鼠线粒体内膜相关的大多数MICOS蛋白水平没有改变，但杂合小鼠CHCHD3蛋白增加。CHCHD3与OPA1关联(29)，并且可能增加的水平是对S-OPA1积累的一种补偿反应，以对抗嵴重塑，这表明MICOS可以通过CHCHD3蛋白感知OPA1的变化。

线粒体形态的变化和随之而来的功能障碍会导致代谢变化，包括胰岛素抵抗和肥胖(47)以及mTOR信号的变化(44). 在此，我们表明线粒体基因表达和生物发生受损可导致mTOR信号的组织特异性变化、脂肪酸代谢紊乱，从而导致葡萄糖不耐受和炎症。在肝脏中第1部分杂合小鼠，当ATP水平降低时，能量和营养传感器AMPKα被磷酸化激活，从而抑制mTOR的激活。这种现象以前已经观察到，肝脏mTOR和mTORC1活性的降低导致线粒体网络断裂，与线粒体呼吸能力降低相关的嵴密度下降降低L-OPA1(44). 相反，mTOR信号通过mTORC1在心脏中上调第1部分杂合小鼠，导致S6和4E-BP1磷酸化增加，表明该组织可以通过增加细胞质蛋白合成来应对线粒体功能障碍。这可能是有丝分裂后组织（如心脏和肌肉）线粒体功能障碍的应对机制，因为在其他由OXPHOS生物发生缺陷引起的线粒体疾病模型中也发现了这种机制(35). 心脏中mTOR信号的增加与AMPKα磷酸化降低和ATP水平相对正常一致。mTOR信号传导的组织特异性差异可能反映了它们不同的能量需求，因为mTOR已被证明直接响应ATP水平的变化(50)因此，肝脏抑制mTOR信号传导，以保持不过量的能量消耗，而心脏上调mTOR信息传导，以应对线粒体OXPHOS的潜在下降。

RNA代谢和生物生成受损引起的代谢变化与与肥胖、线粒体功能障碍以及心脏和肝脏损伤相关的激素变化一致。瘦素由脂肪组织分泌，通过与大脑中的食欲和饱腹感中枢相互作用来调节体重、食物摄入和能量消耗(51). 瘦素水平的增加与体重和脂肪沉积的增加有关(52)这些在肥胖患者中是一致的第1部分+/−老鼠。FGF-21增加第1部分+/−小鼠对线粒体功能障碍和心肌病的发展作出反应，因为FGF-21的增加通常被用作线粒体功能障碍和涉及心肌和骨骼肌缺损的疾病的生物标志物(32，33). 这些作用与最近的一份报告一致，该报告显示，肥胖动物体内FGF-21的增加抑制了肝脏中的mTORC1，从而降低了肝脏mTOR调节碳水化合物和脂质代谢的能力(53). 免疫调节细胞因子IL-6在炎症、代谢和AMPKα激活中起作用(54)和缺乏IL-6的小鼠出现成年期肥胖、肝脂肪变性和胰岛素抵抗(55–57). 我们的小鼠中IL-6的增加表明，这种细胞因子具有促炎作用，刺激JNK磷酸化的增加，从而导致慢性肝损伤、脂质积聚、肝脂肪变性和胰岛素抵抗。持续JNK磷酸化引起的炎症增加可负性调节胰岛素受体(56)这可能是我们在成人肥胖患者中观察到的胰岛素抵抗的基础第1部分+/−老鼠。慢性炎症导致的线粒体功能障碍已被证明会导致脂质积聚(58)，而IL-6可提高肝脏甘油三酯和葡萄糖水平，从而在与年龄相关的疾病中发挥致病性(59). 瘦素、FGF-21和IL-6水平在第1部分+/−这表明这些激素在生命早期对不平衡的RNA代谢和生物生成作出反应，并作为年龄诱导肥胖、线粒体功能障碍诱导的心脏病和炎症的生物标志物。

mt-RBP点突变导致的线粒体基因表达变化和随之而来的线粒体功能障碍会导致人类疾病不同组织的病理学，其严重程度各不相同(三，60)和疾病的小鼠模型(61，62). 这个第1部分杂合小鼠有多种病理学，表明PTCD1减少足以导致心脏缩短分数增加、慢性损伤、脂质积聚和肝纤维化。线粒体生物生成受损、OXPHOS解偶联以及随之而来的形态变化，随着时间的推移，可能会导致成人从脂肪酸利用到葡萄糖代谢的代谢转换第1部分杂合小鼠，已被证明在Yme1l公司基因敲除小鼠(45). 脂肪酸的增加和脂肪在肝脏中的积累导致了脂肪变性和炎症的发展第1部分杂合小鼠。这种慢性肝损伤导致肝祖细胞数量增加，以修复肝功能(63).

我们在这里的工作确定PTCD1是线粒体生物发生和体内代谢功能的一种基本蛋白质。尽管细胞中PTCD1水平相对较低，但线粒体功能和结构需要两个等位基因的表达。PTCD1减少导致成年期开始的代谢重编程，这是由于OXPHOS功能降低和线粒体解偶联，对胰岛素和mTOR信号通路以及脂肪酸代谢产生下游影响，并随着年龄的增长而加剧，从而导致疾病。我们的研究结果提供了一个重要的模型，该模型从实验上证明了单倍体不足如何在成年期代谢综合征和肥胖的易感因素中发挥重要作用。更重要的是，我们表明，即使mt-RNA代谢发生轻微扰动，线粒体蛋白质合成减少，也足以导致晚发型疾病，并对能量代谢产生重大影响。未来的工作应侧重于对可能导致人类代谢性疾病、肥胖和糖尿病的突变导致的杂合性功能丧失进行功能分析，以了解在大量队列中发现的哪些单核苷酸变体是这些疾病的功能因素。

材料和方法

动物和住房

第1部分澳大利亚表型网络（APN；澳大利亚墨尔本莫纳什大学）产生了C57BL/6N背景的转基因小鼠。含有起始密码子到终止密码子的ES细胞第1部分基因敲除等位基因(第1部分tm1（KOMP）Vlcg)来自敲除小鼠项目（KOMP）知识库（加利福尼亚大学戴维斯分校）。将囊胚注射ES细胞并转移至假孕受体小鼠。小鼠嵌合第1部分基因敲除等位基因与野生型C57BL/6N小鼠杂交，获得杂合子代(第1部分+/+)和杂合子(第1部分+/−)在22±2°C和50+10%相对湿度的受控环境条件下，小鼠被关在标准笼子（45 cm×29 cm×12 cm）中，以12小时的光照/暗照时间（早上7点至下午7点），喂食非传染性疾病（大鼠和鼠食，特殊饲料），并随意提供水。除非另有规定，所有研究均在5至30周龄的动物中进行。该研究得到了西澳大利亚大学动物伦理委员会的批准，并根据实验室护理原则（National Health and Medical Research Council，澳大利亚科学用动物护理和使用规范2013年第8版）。

组织匀浆制备

使用研钵和研杵将组织块（肝脏和心脏）（3 mm×3 mm）在液体N中研磨成细粉2并在100μl细胞提取缓冲液中均匀化[100 mM tris，2 mM Na三VO（旁白）4，100 mM NaCl，1%Triton X-100，1 mM EDTA，10%甘油，1 mM EGTA，0.1%SDS，1 mM NaF，0.5%脱氧胆酸盐，20 mM Na4对2O（运行）7（pH 7.4）]，含有PhosSTOP磷酸酶抑制剂鸡尾酒（Roche）和不含EDTA-的cOmplete蛋白酶抑制剂鸡尾液（罗氏）。匀浆在10000下离心克在4°C下保持5分钟。重复上述步骤，直到产生透明组织匀浆。以牛血清白蛋白（BSA）为标准物，采用比新新酸（BCA）测定法定量组织匀浆蛋白浓度。

线粒体分离

如前所述，从均质心脏和肝脏中收集线粒体，并通过差速离心分离(12)进行了一些修改。肝脏在含有250 mM蔗糖、5 mM tris和1 mM EGTA（pH 7.4）的缓冲液中用无EDTA-的cOmplete蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Roche）均质，心脏首先在含有210 mM甘露醇、70 mM蔗糖，10 mM tris-和0.1 mM EDTA（pH 7.0）的无EDTA cOmplet蛋白酶抑制剂鸡鸡尾酒中培养均质和差速离心前10分钟。以牛血清白蛋白（BSA）为标准，采用BCA分析法定量线粒体蛋白浓度。

RNA分离和Northern印迹

使用miRNeasy Mini Kit（Qiagen），结合柱上无RNase脱氧核糖核酸酶消化，从总心脏或心脏线粒体中分离出RNA，以去除所有DNA。RNA（5μg）在1.2%琼脂糖-甲醛凝胶上溶解，然后转移到0.45-μm Hybond-N+硝化纤维素膜（GE生命科学），并与小鼠线粒体mRNAs、rRNAs和tRNAs特异的生物素化寡核苷酸探针杂交(16). 在50°C的温度下，在5×SSC，20 mM Na中隔夜进行杂交2高性能操作47%十二烷基硫酸钠和肝素（100μg/ml），然后清洗。使用链霉亲和素连接的红外标记抗体检测信号[在3×SSC、5%SDS和25 mM Na中稀释1:20002高性能操作4使用奥德赛红外成像系统（LI-COR Biosciences）。

RNA-Seq和校准

对三个对照和三个对照的总RNA进行RNA-seq第1部分根据Illumina TruSeq协议，澳大利亚基因组研究机构在Illuminia NextSeq平台上的杂合小鼠。我们使用随机六聚体引物生成cDNA文库，并使用Ribo-Zero rRNA去除试剂盒去除细胞质rRNA。适配器修剪由cutadapt执行(64). 为了分析线粒体转录组，首先使用HISAT2 v2.0.4（NUMT屏蔽）将测序的单端读取与小鼠基因组（mm10）对齐(65). 使用SAMtools v1.3提取所有线粒体初级比对的读取ID(66)并使用Picard v1.23将原始比对过滤成核和线粒体比对文件(http://broadinstitute.github.io/picard网站/). 用Picard将线粒体比对转换回FASTQ格式的原始读取序列，并像以前一样重新排列到线粒体基因组，添加了额外的参数——没有拼接比对。用SAMtools提取并分离初级线粒体序列，根据其起始模板链，并用BEDtools转换为模板链特异性片段BED文件(67)和临时脚本。使用BEDtools，根据整个基因组（核和线粒体）中每百万个正确映射的读取总数，对特定于股的片段BED文件的Per-base深度进行归一化，并将其转换为bedGraph格式，以便使用Integrative Genomics Viewer v2.3.9进行可视化(68，69).

免疫印迹法

使用抗RG9MTD1（HPA036671）、HSD17B70（HPA001432）和MRPS34（HPA042112）的兔单克隆抗体（Sigma Prestige抗体，1:500稀释）检测特异性蛋白质；MRPS35（16457-1-AP）、MRPL44（16394-1-AP）和MRPL37（15190-1-AP），MRPS16（16735-1-AP）；MRPL11（15543-1-AP）以及AFG3L2（14631-1-AP）（Proteintech，稀释比例为1:1000）；磷酸化（Ser2448; 5535）和非磷酸化mTOR（2983），磷酸化（Thr183/Tyr公司185; 4668）和非磷酸化SAPK/JNK（9252），磷酸化（Thr172; 2532）和非磷酸化AMPKα（2532），磷酸化（Ser473; 4051）和非磷酸化的Akt（9272）、磷酸化的（Ser235/236; 4856）和非磷酸化S6（2217），磷酸化（Thr37/36; 2855）和非磷酸化4E-BP-1（9644）、Rictor（2140）、ACC（3662）和GAPDH（2118）（细胞信号技术，稀释1:500）；猛禽（ab40768）、PGC-1（ab54481）和YY1（ab109228）（Abcam，稀释1:1000）；和CHCHD3（OAEB01622）（Aviva系统生物学，稀释1:500）。使用特异性兔多克隆抗体对抗PTCD1（H116；sc-382428）（Santa Cruz Biotechnology，稀释1:250）、TFAM（ab131607）（Abcam，稀释1:200）、ELAC2（10061-1-AP）和OMA-1（17116-1-AP）（Proteintech，稀释1:2000）、APOOL（OAAF03292）和ACACA（pACC-Ser）79; OAAN02936）（Aviva Systems Biology，稀释1:200）和LRP130（sc-166177）（Santa Cruz Biotechnology，稀释1:500）。使用的特异性小鼠单克隆抗体为总OXPHOS鸡尾酒抗体（ab110412）、NDUFA9（ab14714）、SDHA（ab14715）、UQCRC2（ab14745）、COXI（ab14705）、COVIII（ab198286）、COIII（ab110259）、COXIV（ab14744）、ATP5a（ab14748）、ATP抑制因子1（ab110277）、OPA1（ab42364）（Abcam，稀释比例为1:1000）和APOO（OAAB09635）（Aviva Systems Biology，稀释1:200）在奥德赛阻塞缓冲液（LI-COR Biosciences）中。使用IRDye 800CW山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）或IRDye680LT山羊抗小鼠IgG（LI-COR Biosciences）二级抗体，并使用Odyssey红外成像系统（LI-COR Biosciences。

BN-PAGE和凝胶内活性染色

如前所述，使用从心脏和肝脏分离的线粒体进行BN-PAGE(12). BN-PAGE凝胶通过凝胶内活性测定或转移到聚偏二氟乙烯和免疫印迹对呼吸复合物进行分析。在BN-PAGE后对线粒体复合物V进行In-gel酶活性测定。在室温下将凝胶在50 mM甘氨酸/NaOH缓冲液（pH 8.6）中浸泡1小时，然后在50 mC甘氨酸、0.05%醋酸铅、5 mM氯化镁中孵育2和5 mM ATP（pH 8.6），37°C，直到凝胶上出现白色条纹。

翻译分析

如前所述，在分离的心脏和肝脏线粒体中进行细胞器内翻译分析(12). 简单地说，500μg线粒体在750μl翻译缓冲液[100 mM甘露醇、10 mM琥珀酸钠、80 mM KCl、5 mM MgCl中培养2、1 mM KPi、25 mM Hepes（pH 7.4）、5 mM ATP、20μM三磷酸鸟苷、6 mM磷酸肌酸、肌酸激酶（60μg/ml）和60μg/ml[除蛋氨酸外的所有氨基酸]。线粒体补充150μCi[35S] 蛋氨酸（PerkinElmer）在37°C下保持60分钟。标记后，线粒体在翻译缓冲液中洗涤并悬浮在放射免疫沉淀分析裂解缓冲液中。测量蛋白质浓度，并通过SDS-PAGE解析50μg线粒体蛋白质，并通过放射自显影术进行可视化。

呼吸和膜电位测量

线粒体呼吸评估为O2如前所述，在离体心脏和肝脏线粒体中的消耗(12). 用底物10 mM谷氨酸/2 mM苹果酸（Sigma）、10 mM琥珀酸/0.5μM鱼藤酮（Sigma-）或1 mM四甲基补充线粒体-第页-苯二胺/1 mM抗坏血酸（Sigma）。在记录室中加入1mM ADP（Sigma）后，测量状态3呼吸活动。在加入抗霉素A（2mM，Sigma）后监测ADP非依赖性呼吸活性（状态4）。连续添加3μM的FCCP以解除呼吸耦合，达到最大呼吸。如前所述测量分离线粒体和MEF的线粒体膜电位(70).

细胞培养和荧光显微镜

MEF在37°C的湿度95%空气/5%CO下培养2Dulbecco改良的Eagle's培养基（Gibco，Life Technologies）中含有葡萄糖（4.5 g/升或1 g/升）、2 mM谷氨酰胺、青霉素（100 U/ml）、硫酸链霉素（100μg/ml）和10%胎牛血清或半乳糖（1 g/L）。将MEF镀在直径为13mm的玻璃盖玻片上，并使其附着过夜。细胞用100 nM MitoTracker Orange处理15分钟，然后用三缓冲盐水[5 mM三氯化氢（pH 7.4）和20 mM氯化钠]清洗，然后安装在1,4-二氮杂二环-辛烷/聚乙烯醇介质中。使用奥林巴斯IX71倒置显微镜和奥林巴斯60倍物镜采集图像。

超声心动图

ECG是在第1部分+/+和第1部分+/−如前所述，老年小鼠在轻甲氧基氟烷麻醉下使用Vivid 7 Dimension上的i13L探针（GE Healthcare）(61).

组织学

新鲜肝组织和心脏组织切片在最佳切割温度介质中冷冻或固定在10%中性缓冲福尔马林中，然后嵌入石蜡中，切片为5至10μm的切片，并用H&E和油红O和苏木精染色。使用尼康Ti Eclipse倒置显微镜和尼康20倍物镜采集图像，并按照前面所述对染色进行量化(61).

代谢研究

对禁食5小时的小鼠进行腹腔内GTT和ITT。在注射葡萄糖或胰岛素后0、15、30、45、60、90和120分钟从尾尖采集血样。使用血糖仪（Accu-Chek Inform a II，Roche）测量血糖水平。在这些测试中，葡萄糖（1 g/kg）和胰岛素（0.5 U/kg）分别用于GTT和ITT。根据制造商的说明，使用标准ELISA试剂盒采集心脏血液样本，以测量胰岛素、IL-6、瘦素（默克米利浦）和FGF-21（研发系统）。使用在线软件程序分析数据(www.elisaanalysis.com)，并使用梯形规则和Microsoft Excel计算曲线下的面积。血清甘油三酯和胆固醇水平由PathWest医学实验室测量。根据制造商的说明（Abcam），使用商用生物发光试剂盒测定ADP/ATP比率。

透射电子显微镜

组织准备和成像第1部分+/+和第1部分+/−心脏和肝脏组织如前所述进行(71).

致谢

我们感谢H.Vanyai对胚胎分离的建议，以及S.Siira对生物信息分析的建议。这个Ptcd1型用于本研究项目的敲除ES细胞系由反式NIH KOMP产生，并从KOMP Repository获得(网址：www.komp.org). NIH向Regeneron Inc.的VelociGene（U01HG004085）和CSD Consortium（U01HG004080）拨款，资助KOMP计划中8500个基因的基因靶向ES细胞的生成，并由加利福尼亚大学戴维斯分校和奥克兰儿童医院研究所的KOMP知识库（U42RR024244）存档和分发。我们感谢莫纳什大学的APN节点为ES细胞囊胚注射和嵌合体的培育Ptcd1型击倒老鼠。APN由澳大利亚政府教育部通过国家合作研究基础设施战略、超级科学倡议和合作研究基础结构计划提供支持。我们感谢西澳大利亚大学显微镜、表征和分析中心的澳大利亚显微镜和微分析研究设施，该设施由大学、州和联邦政府资助。基金：该项目得到了国家卫生和医学研究委员会（NHMRC）（APP1058442、APP1045677、APP1041582、APP1023460、APP1005030、APP1043978、APP1062740和APP1002207）、澳大利亚研究委员会（A.F.和O.R.）、，和西澳大利亚癌症委员会（致手术室）。K.L.P.和T.R.R.由NHMRC多拉·卢什奖学金资助，N.F.由澳大利亚研究生奖资助。作者贡献：O.R.和A.F.构思了这个项目并设计了实验。所有作者都进行了实验并进行了分析。K.L.P.、O.R.和A.F.撰写了手稿，其他作者批准了手稿。竞争利益：作者声明，他们没有相互竞争的利益。数据和材料可用性：评估论文结论所需的所有数据均在论文和/或补充材料中提供。可能需要作者提供与本文相关的其他数据。

补充材料

本文的补充材料可在以下网址获得：http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/3/8/e1700677/DC1

图S1。PTCD1丢失对胚胎发育的影响。

图S2。通过RNA-Seq对肝线粒体中RNA处理的转录组分析。

图S3。通过RNA-Seq对心脏线粒体中RNA处理的转录组分析。

图S4。PTCD1减少对40周龄小鼠线粒体功能的影响。

图S5。PTCD1减少对10周龄小鼠线粒体功能的影响。

图S6。PTCD1减少影响线粒体膜电位。

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文章来自科学进展由提供美国科学促进会