感觉启动子相关RNA在双向转录长控制区调控人乳头瘤病毒18的基因沉默和激活

dsRNA和ODN转染

dsRNA(S1表)针对pRNA的三个不同区域生成，针对每个区域设计三到四个dsRNA，每组中每个dsRNA的位置由两个核苷酸移动。第一组包括S1、S2和S3 dsRNAs（-7448至-7470），第二组包括S4、S5、S6和S7 dsRNA（-7567至-7591），第三组包括S8、S9和S10 dsRNA（-7598至-7620），还设计了一个对照dsRNA。

对于转染，细胞的初始板密度为10⁵6孔板中每孔的细胞数，3×10⁵每25厘米细胞数²烧瓶和10⁶每75厘米的细胞数²瓶。24小时后，根据制造商的协议，使用寡病毒胺转染试剂（生命技术），在100nM浓度下用dsRNAs（Eurofins，MWG Germany）或ODNs（IDT，USA）进行转染。除非另有说明，否则将转染细胞保存72小时。

ODN处理加dsRNA转染是通过在相应ODN处理（100 nM，S1表). 2小时后72小时从细胞中分离出RNA^第转染。

RNA分析

根据制造商指南，使用TRI试剂（Sigma-Aldrich）和DNA酶处理（美国赛默飞世尔科学公司）从细胞中分离出RNA。使用MMLV逆转录酶（Thermo Fisher Scientific，USA）使用随机十倍体逆转录（RT）RNA（250 ng-1.5μg），但使用基因特异性引物（100 pM）的定向RT（正或反义pRNA）除外。

实时RT-PCR（qRT-PCR）在Rotor-Gene 6000实时PCR机器（澳大利亚科贝特研究所）上使用指定的基因特异性引物进行(S2表). 多个参考基因，即18S、POLR2A、PPIA和β-actin，用于使用Relative expression Software Tool（相对表达软件工具）准确量化基因表达，该工具可在线获取，网址为http://www.genequantitation.de/rest.html该软件应用了一个数学模型，该模型考虑了目标基因和参考基因的可变PCR效率。因此，与传统的单参考基因标准化方法相比，使用多参考基因可以提高检测的可靠性[28].

pRNA分析

为了检测pRNAs，根据制造商指南，使用TRI试剂（Sigma-Aldrich）和DNA酶处理（DNase I，Thermo Fisher Scientific，USA）从HeLa、C-4 I和C-4 II细胞中分离出总RNA。然后用P1、P2、P3和P4引物对cDNA进行PCR扩增。获得的PCR产物在1 X TAE缓冲液中的1%琼脂糖（西班牙Pronadisa）凝胶上以4°C的恒定电压5–10 V/cm电泳。凝胶用溴化乙锭染色，并在UV下使用透光仪（AlphaImagerHP，Fisher Scientific）显示解析的DNA条带。PCR产物通过Wizard SV gel和PCR Clean Up System（Promega，USA）严格按照制造商的方案进行凝胶纯化，并从Xcelris Genomics（印度）进行商业测序。

为了确定pRNAs的方向、相邻性和表达，使用指定的RNA特异性（100 pM）正向（反义特异）或反向（义特异）引物对总RNA进行逆转录（Thermo Fisher Scientific）。用正向和反向引物同时扩增cDNA。在定向qRT-PCR过程中，数据首先归一化为内部18S水平，然后表示为对照值的分数。

亚硫酸氢盐转化

使用Gentra Puregene Blood试剂盒（美国Qiagen公司）从dsRNA转染细胞中分离出DNA，并根据制造商指南使用EpiTect亚硫酸氢盐试剂盒（Qiangen公司）对200 ng DNA进行亚硫酸氢修饰。该软件位于http://bisearch.enzim.hu/用于设计外引物和嵌套引物(S3表)获得的PCR产物从Xcelris Genomics（印度）进行商业测序。

染色质免疫沉淀（ChIP）分析

根据制造商的说明，使用EZ-ChIP试剂盒（Millipore USA）对H3K9me2（Abcam#mAbcam1220）、H3K27me3（Abcam#mAbcam6002）和H3K4me2（Abcam#ab32356）尾部进行ChIP检测。免疫沉淀DNA通过PCR进行25–30个周期的分析。用于ChIP分析的PCR引物见S2表.

微球菌核酸酶（MNase）测定

MNase可及性分析如前所述进行[29]. dsRNA和ODN处理的细胞（2×10⁵)从25厘米处刮下²培养瓶，并在4°C下以2000 rpm离心10分钟制成颗粒。细胞沉淀在冰冷的PBS中洗涤两次，并重悬于200mL冰冷的NP40裂解缓冲液（10mM Tris-Cl pH 7.4，10mM NaCl，3mM MgCl2，0.5%NP40，0.5mM亚精胺，0.15mM亚精胺）中，然后在冰上孵育5分钟。细胞核在4°C下以3000 rpm的转速造粒5分钟，然后再悬浮在200 mL MNase消化缓冲液中（100 mM Tris-HCl pH 7.4，3 M NaCl，15 mM精胺，50 mM精脒，0.6 M KCl和100 mM CaCl₂). 将100μl悬浮液与2U MNase在37°C下消化10分钟，剩余100μl保持未消化状态。在65°C下添加EDTA（最终浓度为5 mM）10分钟，MNase反应停止。用Gentra Puregene Blood试剂盒（Qiagen）从消化和未消化细胞核中分离DNA，并进行实时PCR分析。使用Delta Delta Ct方法计算每个样本中未消化（UD）与消化（D）感兴趣基因DNA（GOI）的比率，例如未消化与消化DNA的比率=2^^{[Ct CHR16值（UD）-GOI的Ct值（UD）]}/2^^{[CHR16（D）的Ct值-GOI（D）Ct值]}扩增16号染色体着丝粒区域片段的引物被用作分析的参考基因，因为它在细胞中保持异染色质形式。用于MNase分析的引物在S2表.

曲古菌素A（TSA）和5-偶氮嘧啶（AZA）治疗

约2x10⁵用S1、S5或S9 dsRNA（100 nM）转染细胞，24小时后用TSA（400 nM）、AZA（5μM）或DMSO处理。处理48小时后从细胞中分离出RNA，并进行实时PCR分析。

抗pRNA dsRNA的设计与筛选

尽管不同HPV18细胞株之间pRNA的大小和分布存在差异，但在所有三个细胞株的LCR的P2区都存在pRNA。为了确定pRNA的功能，我们设计了七个（S1-S7）pRNA特异性互补dsRNA(图4A)靶向P2区pRNA的两个不同区域。每个dsRNA在靶区至少包含两个CpG位点。靶向CpG位点的dsRNA与TGS相关[22，30]. 在C-4 II细胞中筛选这些dsRNA，并在转染72小时后使用特异性引物通过实时PCR（qRT-PCR）分析E6和E7基因的表达(图4B). 在使用的七种dsRNA中，只有S1、S3和S5导致E6和E7表达显著下降，与对照dsRNA处理的细胞相比，分别下降约73%、60%和55%。从HeLa的每个区域（S1和S5）转染一个dsRNA(图4C)和C-4 I(图4D)观察到细胞E6和E7表达受到类似的抑制。此外，在所有转染细胞类型中，除了E6和E7 mRNA外，总pRNA（正反义）也显著减少（P<0.01）(图5A，图A-B inS2文件).

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图4

筛选靶向HPV18 pRNAs的dsRNAs。

（A） HPV18 LCR和不同dsRNA靶点位置的示意图。（B） 用7个dsRNA（100nM）转染的C-4 II细胞。C） 用S1和S5 dsRNA转染HeLa细胞（D）C-4I细胞中的S1和S-5 dsRNA。用各自的dsRNA转染细胞，转染72小时后分离RNA，并通过实时RT-PCR进行分析。通过REST软件计算18S rRNA、POLR2A、PPIA和β-actin的表达率，并将其归一化为对照dsRNA。E6:dsRNA转染后E6癌基因的表达。E7：dsRNA转染后E7癌基因的表达。Control-dsRNA：对照dsRNA转染细胞，（*）P<0.05。

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图5

HeLa细胞中pRNA的表达。

用S1或S5 dsRNA（100nM）转染细胞，并在转染72小时后分析pRNA表达。使用pRNA特异性引物进行实时PCR分析。S1和S5转染显示pRNA表达显著降低（p<0.01）。通过REST软件计算18S、POLR2A、PPIA和β-actin的表达率。pRNA：靶向S1或S5 dsRNA转染细胞的pRNA。Control-dsRNA：控制dsRNA处理的细胞。

dsRNA转染对pRNA双向转录的影响

用定向qRT-PCR分析S1和S5转染细胞的RNA，以了解dsRNA转染对HPV18阳性细胞正、反义pRNA表达的影响。

使用P2R引物对与E6和E7 mRNA方向相同的Sense pRNA进行定向逆转录，并使用P2F和P2R引子结合q-PCR对获得的cDNA进行分析。使用P2F引物逆转录反义pRNA（相对于mRNA），并使用P2F和P2R引物q-PCR分析cDNA。显著下降（p<0.002），并且伴随着pRNA表达的增加（p< 0.01)S1和S5 dsRNA转染HeLa和C-4 II细胞后反义pRNA水平(图6和S1图).

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图6

S1或S5 dsRNA转染后HeLa中双向pRNA转录的变化。

用P2引物定向qRT-PCR检测正、反义pRNAs水平。以18S为内对照，采用delta-delta-Ct方法计算正、反义pRNA表达的折叠变化。对照组：对照dsRNA处理的细胞，S1P2F：转染S1 dsRNA的细胞，然后用P2F引物进行RNA分离和反转录，S1P2R：转染了S1 dsRNA和分离出的RNA的细胞用P2R引物进行反转录，S5P2F：转染了S5 dsRNA和分离出RNA的细胞使用P2F引子进行反转录，S5P2R：用P2R引物逆转录S5 dsRNA转染细胞和分离的RNA。

pRNA介导的E6和E7基因激活

在使用的七种含有CpG的dsRNAs中，S1和S5降低了pRNA、E6和E7的表达，而其他的对这些RNA的表达没有显著影响。最近的文献表明，非CpG靶向dsRNAs与诱导基因表达有关[19]. 因此，我们设计并筛选了另一组靶向pRNA中非CpG位点的三种dsRNA（S8、S9和S10）。S9 dsRNA与转染72小时后pRNA（2倍）、E6（2.5倍）和E7（3.5倍）的诱导相关，而对照细胞未受影响，如HeLa细胞中qRT-PCR所确定的那样(图7A).

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图7

pRNA介导的基因激活。

（A） 在HeLa细胞中筛选针对HPV18的pRNA中非CpG位点的三个dsRNA（100nM）。转染72小时后，通过实时PCR分析转染细胞的RNA。通过REST软件计算18S、POLR2A、PPIA和β-actin的表达率。S8 dsRNA:S8 dsRNA转染的细胞，S9 dsRNA:S9 dsRNA转染的细胞，S10 dsRNA:S10 dsRNA转染的细胞。对照：对照dsRNA转染细胞。（*）P<0.01，（**）P=0.03。（B） S9 dsRNA转染后双向转录的变化。通过用S9 dsRNA转染Hela细胞，然后在转染72小时后分离RNA，检测正、反义pRNA的水平。然后使用P2引物通过实时PCR分析cDNA。P2F：转染S9 dsRNA的细胞，然后进行RNA分离，并用P2F引物逆转录反义pRNA，P2R：转染了S9 dsRNA的细胞，随后进行RNA分离并用P2R引物逆序转录反义mRNA。使用归一化为对照dsRNA处理样品的delta-delta-Ct方法计算18S rRNA的表达率。

通过双向qRT-PCR评估来自S9转染HeLa细胞的RNA，以确定非CpG靶向dsRNA对双向pRNA表达的影响(图7B). S9 dsRNA转染与正义pRNA表达增加两倍以及反义pRNA水平降低相关。

pRNA的激活和抑制与表观遗传修饰的变化有关

我们的研究结果表明，HPV18的TGS和TGA与双向转录LCR中的正义pRNA水平相关，正义pRNA的水平降低和增加分别导致抑制和激活。为了阐明dsRNA介导的pRNA调制是否与染色质状态的改变有关，在S1、S5或S9转染后的HeLa细胞中进行了MNase分析。在S1和S5 dsRNA处理的细胞中，与对照dsRNA处理细胞相比，靶区对MNase的可及性降低（分别为55%和70%）。相反，当用S9 dsRNA转染HeLa细胞时，靶区对MNase消化更敏感，表明可接近性增加，而对照dsRNA转导细胞的可接近性没有变化(图8A).

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图8

dsRNA转染后的表观遗传修饰。

（A） S1、S5或S9 dsRNA转染后的染色质重塑。S1和S5转染72小时后MNase消化显著减少，而S9转染HeLa细胞后可获得性增加。在转染72小时后，用相应的dsRNAs转染细胞，然后进行MNase-PCR。S1：S1 dsRNA转染的细胞，S5 dsRNA:S5 dsRNA转染的细胞，S9 dsRNA:S9 dsRNA转染的细胞，对照dsRNA:对照dsRNA转染的细胞（*）P<0.01。Bi-Biv。在dsRNA靶位点富集H3K9me2、H3K27me3和H3K4me2。dsRNA诱导的TGS与H3K9me2和H3K27me3的增加有关，而TGA与H3K4me2的增加有关。用各自的dsRNA转染HeLa细胞，72小时后用所需抗体进行ChIP分析，以提取目标DNA。用区域特异性引物对沉淀的DNA进行PCR分析。在没有抗体（小鼠IgG）的情况下拉下的DNA用于识别背景扩增，而输入的DNA作为负载对照进行扩增。（Bi）凝胶电泳图显示在S1和S5 dsRNA转染细胞中ChIP后获得的PCR产物。（Biii）凝胶电泳图，显示在S9 dsRNA转染细胞中ChIP后获得的PCR产物。（Bii和Biv）用ImageJ软件对A和B中显示的ChIP数据进行密度分析。相对富集度=ChIP/输入DNA。1:H3K9me2免疫沉淀PCR，2 and I:H3K27me3免疫沉淀PCR。第二章。HDAC抑制对TGS和TGA的影响。S1、S5或S9转染后pRNA、E6和E7的表达率。用dsRNA（100nM）转染HeLa细胞，24小时后用DMSO或TSA（400nM）处理，48小时后分离RNA。（Ci）dsRNA转染细胞中的TSA治疗。（Cii）二甲基亚砜（TSA和AZA溶剂）处理dsRNA转染细胞。

现在为了阐明观察到的染色质可及性变化背后的机制，对激活和抑制组蛋白甲基化标记进行了染色质免疫沉淀（ChIP）分析。S1转染HeLa细胞使靶位点的H3K9me2和H3K27me3分别富集6.7和13.5倍，而S5转染使H3K9me2和H3K27me3分别富集5.5和3.7倍（图8Bi（8Bi）和8亿). 相反，转染S9 dsRNA的细胞在H3K27me3的富集方面没有变化，而激活组蛋白标记物H3K4me2在该区域增加了5倍(图8Biii和8Biv公司).

当用HDAC抑制剂TSA处理细胞时，细胞被废除(P>0.05)S1和S5介导的TGS表明HDAC抑制剂TSA逆转了dsRNA介导的异染色质化，而S9介导的TGA没有变化(P<0.01)(图8Ci). dsRNA介导的TGS和TGA未受影响(P<0.01）当细胞用二甲基亚砜（TSA的溶剂）处理时(图8Cii). 这表明通过HDAC介导的脱乙酰化作用对靶区进行异染色质化是TGS涉及的过程之一。

亚硫酸氢盐测序发现靶DNA或邻近区域的甲基化没有变化（图A-ES3文件). 此外，S1和S5介导的pRNA、E6和E7下调未受AZA（DNA甲基转移酶抑制剂）治疗的影响（p<0.01）（图FS3文件)这证实了TGS期间没有DNA甲基化。这与之前关于TGS在缺乏DNA甲基化的情况下发生的各种报道一致。

我们感谢Pulivarthi Rao博士（美国德克萨斯州贝勒医学院）慷慨提供C-4I细胞系，S.Chauhan博士和K.Luthra博士（AIIMS新德里）进行了有益的讨论。