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.2006年3月30日；25(14):2094-104.
doi:10.1038/sj.onc.1209244。

RNA干扰对宫颈癌细胞HPV16癌基因沉默的短期诱导和长期抑制

S唐 1, M Tao先生, J P McCoy Jr公司, Z M Zheng先生
附属公司

RNA干扰对宫颈癌细胞HPV16癌基因沉默的短期诱导和长期抑制

S唐等。 癌基因. .

摘要

RNA干扰介导的基因沉默有可能阻断基因表达。基于人类乳头瘤病毒16型（HPV16）E6E7双顺反子RNA 21个核苷酸序列基序的合成双链小干扰RNA（siRNA）被发现是一种有效的siRNA，可抑制HPV16+CaSki和SiHa细胞中E6和E7癌基因的表达。然而，当siRNA在这些细胞中稳定表达为短发夹RNA时，E6和E7表达的siRNA沉默仅在细胞传代早期有效，但随着细胞传代的增加而变得无效，尽管siRNA继续在相同水平上表达。siRNA功能的丧失在稳定的p53 siRNA细胞中是可复制的，但在稳定的层粘连A/C siRNA细胞则不可复制，这表明它是基因选择性的。对siRNA功能具有抗性的细胞保留了正常的siRNA处理、解链的双链解链和降解以及RNA诱导的沉默复合物的形成，这表明siRNA功能的丧失发生在随后的步骤。令人惊讶的是，发现siRNA抗性细胞显著表达约50kDa的细胞质蛋白，该蛋白与未缠绕的反义链E7 siRNA特异性和特征性地相互作用。总之，我们的数据表明，靶向必需或调节基因的有效siRNA可能诱导细胞产生siRNA抑制功能。

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数字

图1
图1
通过瞬时转染HPV16 E7 siRNA抑制HPV16 E6和E7表达(一)HPV16 E6和E7基因结构图（彩色方框）及其双顺反子转录本（长粗线），带虚线所示的可选剪接位点。转录本下方的一个小而粗的破折号表示本研究中E7 siRNA 198双链的靶区。(b条)通过联合转染GFP-E6或GFP-E7表达载体（1μg/皿），不含siRNA（黑色）、20 nM非特异性（NS）siRNA（红色）、10（绿色）、20（黄色）、40（蓝色）或80 nM（洋红）E7 siRNA或20 nM GFP siRNA（天蓝色。(c（c）)宫颈癌衍生HPV16的生长抑制+存在40 nM E7 siRNA（开环）或NS siRNA（闭环）的CaSki和SiHa细胞。(d日)通过RPA分析，HPV16 E7 siRNA介导宫颈癌衍生CaSki和SiHa细胞中HPV16 E6E7 RNA的降解。用20 nM E7 siRNA或NS siRNA转染24小时后制备总细胞RNA。如前所述，使用细胞亲环素RNA对采样进行归一化（Tang和Zheng，2002）。(e（电子）)用HPV16 E7 siRNA或NS siRNA转染48小时后，抑制CaSki细胞中HPV16 E7的表达和p53和p21蛋白的积累。
图2
图2
通过瞬时转染HPV16 E7 siRNA对宫颈癌细胞细胞周期相关基因表达的影响。将40 nM的HPV16 E7 siRNA或NS siRNA转染到HPV16中+转染24小时后，从每个细胞系制备宫颈癌细胞系、CaSki或SiHa和总细胞RNA。约30μg总细胞RNA与hCC-2多探针杂交（约4 X 106CPM），然后进行RNase A/T1消化。受保护的RNA片段在8%变性PAGE凝胶中溶解。未消化的多肽作为对照平行运行，其对应的细胞总RNA保护产物用线表示。
图3
图3
HPV16 E7 siRNA在HPV16中的稳定表达+宫颈癌细胞。(一)HPV16 E7 siRNA表达载体、pSUPER衍生pST66和表达的shRNA 198序列的示意图。BSD是一种用作哺乳动物选择标记的速溶素S脱氨酶基因。HPV16型+将转染质粒pST66或pSUPER载体控制的宫颈癌细胞CaSki和SiHa在含有急变粒细胞素S的培养基中生长，并选择耐急变粒菌素S的细胞生长为融合单层以进行进一步分析。通过Northern blot检测从那些稳定转染质粒pST66（用于C-1至C-3的CaSki和用于S-2至S-3的SiHa）或仅转染pSUPER载体（用于C-V的CaSki和用于S-V的SiHa）的细胞中提取的总细胞RNA是否存在HPV16 E7 siRNA(b条). 用Western blot检测从稳定siRNA细胞中提取的蛋白样品的HPV16 E7表达(c（c）). 使用U6 snRNA标准化Northern blot的样品装载量(b条)和β-微管蛋白用于Western blot(c（c）).
图4
图4
在稳定表达E7 siRNA的CaSki衍生细胞中抑制siRNA功能的发展(一)在稳定表达HPV16 E7 siRNA的CaSki衍生的C-2细胞中重新出现16E7，这表明随着额外的细胞传代，E7 siRNA功能丧失。通过蛋白质印迹比较在第4代和第6代制备的蛋白质样品中E7的表达。(b条)在随后的细胞传代中，C-2细胞中E7 siRNA功能的丧失并不是由于E7 siRNA的表达减少。通过Northern blot和32P-标记的As或S寡核苷酸或U6-特异寡核苷酸作为采样的标准化。(c（c）)E7 siRNA在单细胞亚克隆中的表达。从每个单细胞亚克隆或其亲本C-2细胞（第9通道）或载体控制C-V细胞（第8通道）中提取的总细胞RNA通过Northern blot检测反义（As）链siRNA的表达32用于采样控制的P-标记的感测寡核苷酸或U6-特异寡核苷酸。从CaSki细胞（C，10–11区）中分离的总细胞RNA以10 nM瞬时转染NS（10区）或E7 siRNA（11区），分别作为细胞对照和siRNA大小对照。(d日)用抗HPV16 E7、p53或p21抗体通过Western blot分析每个单细胞亚克隆中E7、p53和p21的表达。(e（电子）)细胞传代影响单细胞亚克隆D4SC细胞中E7 siRNA的功能。用抗HPV16 E7或细胞周期蛋白A抗体对从细胞传代4、6和8制备的蛋白质样品进行Western blot检测，并与CaSki-derived载体控制的C-V细胞中的蛋白质水平进行比较。面板中的膜一,d日、和e（电子）作为样品装载控制，还对β-微管蛋白进行了印迹。
图5
图5
稳定表达p53 siRNA的CaSki-derived细胞对siRNA功能的抑制，但在稳定表达层粘连蛋白A/C siRNA的细胞中没有(一)用改良的pSUPER-p53 siRNA表达载体转染CaSki细胞，并在BSD存在的情况下进行筛选。在每次传代时从筛选出的稳定的p53 siRNA细胞中制备蛋白质样品（3–6道），并通过Western blot分析p53和β-微管蛋白。使用具有或不具有p53 siRNA双链（5 nM）瞬时转染的CaSki细胞作为p53 siRNA瞬时对照（1区和2区）。(b条)用Northern blot检测从载体控制的C-V细胞（第1通道）或稳定的p53 siRNA细胞第5代（第2通道）和第15代（第3通道）制备的总细胞RNA的反义（As）或正义（S）链p53 siRNA和U6 snRNA的表达如图4b所示，使用E7 siRNA特异性探针通过Northern blot检测作为对照。(c（c）)用改良的pSUPER-lamin A/C siRNA表达载体（pST83）稳定转染CaSki细胞，并在BSD存在下进行筛选。在每个细胞传代处制备蛋白样品，并使用抗层粘连A/C抗体进行Western blot检测。用抗β-微管蛋白重制相同的膜。仅用空载体稳定转染CaSki细胞的C-V蛋白样品。
图6
图6
低剂量siRNA双链慢性治疗CaSki细胞脱敏。在慢性治疗的最后一天，将每三天用10 nM E7 siRNA（3–4道）或NS siRNA（5–6道）处理45天的CaSki细胞与未经慢性治疗的CaSkicells（1–2道）进行比较，以了解其对5 nM E7siRNA的反应。在siRNA转染24小时后收集蛋白质样品，并通过Western blot分析16E7、p53和β-微管蛋白的表达，如(一). 将每个样本中16E7和p53的相对水平归一化为β-微管蛋白，并与未经急性siRNA治疗的相应对照组进行比较(b条).
图7
图7
通过瞬时（2-4道）或稳定（5-7道）E7 siRNA转染比较CaSki细胞中的siRNA水平。用PBS冲洗瞬时转染的细胞3次，在瞬时siRNA转染24小时后制备总细胞RNA，或从稳定表达E7 siRNA的单个CaSki-derived细胞（D4SC和C-2）制备，或从仅转染pSUPER载体的细胞制备（C-V，第8和9通道）。用Northern blot分析RNA。通道5–9括号中的数字表示分析所用时间的细胞通道数。用于反义和正义siRNA链检测的相同膜也被印迹用于U6 snRNA，以控制样品装载。
图8
图8
对内源性siRNA不敏感的细胞对外源性siRNA双链体敏感。瞬时转染用于比较E7 siRNA敏感性细胞、C-2和D4SC亚克隆细胞与E7 siRNA-敏感性C-V细胞对E7 siDNA198的敏感性(一)在1、2和4 nM时，p53 siRNA在5 nM时(b条). 转染24小时后制备蛋白样品，并通过Western blot分析E7、p21或p53。用Western blot检测同一膜的β-微管蛋白，作为样品装载的对照。
图9
图9
稳定表达E7 siRNA的细胞中siRNA功能的丧失不是由于siRNA序列的改变，而是在RISC形成后发生的。(一)通过克隆C-2细胞的小RNA分子，验证了E7 siRNA序列。色谱图显示了用这种方法克隆和测序的反义链E7 siRNA。(b条)比较从稳定的E7 siRNA抑制C-2细胞和敏感的对照C-V细胞制备的细胞质S100提取物在存在32P-标记的E7 siRNA。无，E7 siRNA无S100。C-V和C-2 S100提取物均与E7 siRNA形成三种RISC样复合物（R1、R2和R3）。
图10
图10
鉴定E7 siRNA耐药细胞中与HPV16 E7 siRNA198相互作用的细胞蛋白。从E7 siRNA耐药的C-2细胞和载体控制的C-V（siRNA敏感）细胞中制备总细胞提取物和细胞质S100提取物，并比较它们在存在siRNA的情况下结合siRNA的能力32P标记的siRNA双链。箭头和箭头分别表示特异性和非特异性蛋白质结合。(一)E7 siRNA-resistant C-2细胞胞质S100提取物中的A~50kDa蛋白与E7 siRNA特异性结合。使用32P-标记的E7 siRNA或NS siRNA（顶部面板）。在每次结合试验中，用考马斯蓝对同一凝胶进行染色，以进行蛋白质取样（底部面板）。(b条)C-2 S100提取物中~50 kDa蛋白与E7 siRNA的结合依赖于ATP。C-2 S100中的ATP在RT（Nykanen等。, 2001). 无论是否消耗ATP，C-2 S100均用于RNA-蛋白质相互作用和UV交联32P标记的E7或NS siRNA(c（c）)C-2 S100中~50 kDa蛋白与32P-E7 siRNA可以与冷的HPV16 E7 siRNA竞争，但不能与tRNA或100倍过量的NS siRNA竞争（左图）。交叉链接受到高浓度NaCl的影响（右侧面板）。(d日)C-2 S100中小于50 kDa的蛋白质与NS siRNA的交叉链接是非特异性的，可以与tRNA或100倍的NS siRNA竞争，但不能与100倍的E7 siRNA竞争（左图）。这种非特异性蛋白与siRNA的相互作用不受高浓度NaCl的影响（右图）。
图11
图11
C-2 S100中的~50 kDa蛋白优先与反义链E7 siRNA相互作用(一)C-2 S100蛋白与单链或双链siRNA的相互作用。全部32在C-2 S100中，使用UV交联测定法，以等量比较P标记的合成单链E7 siRNA（有义[s]和反义[as]链）及其退火（an）产物（s+as）以及合成双链（ds）E7 siRNA 198与蛋白质相互作用的能力。箭头表示约50kDa蛋白质的特异性siRNA结合。(b条)的电泳图谱32P-标记的相应siRNA用于(一)在12%天然PAGE凝胶上。
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