低蛋白饮食中添加酮类对2型糖尿病肾病大鼠骨骼肌萎缩和自噬的影响

摘要

介绍

2型糖尿病肾病是终末期肾病（ESRD）最常见的病因。因此，肾衰竭的治疗策略，包括使用蛋白质限制饮食[1]，对糖尿病肾病患者的治疗越来越感兴趣。尽管很少有研究表明蛋白质摄入限制不能改善早期或显性肾病的1型或2型糖尿病患者的肾脏预后[2]并提供肾脏保护[3]，多项研究结果表明，低蛋白饮食可以在动物模型中保持肾脏功能和结构[4]和伴有大蛋白尿的2型糖尿病患者[5]改善疾病预后[6]、轻度炎症和蛋白尿[7]和抑郁症状[8]然而，人们越来越担心这些饮食会导致营养不良的风险。酮酸是一种无氮酮类化合物，在CKD患者中与低蛋白饮食一起使用[9],[10].酮类提供充足的必需氨基酸，减少内源性尿素生成、有毒离子和代谢产物。动物研究表明，脂多糖可减缓生长并降低血清白蛋白水平，补充酮酸可纠正CKD大鼠的这些异常[11]此外，一项临床试验结果表明，补充必需氨基酸和酮类药物的蛋白质限制可以延缓终末期肾衰竭的发生，而不会恶化非糖尿病患者的营养状况[12],[13]或糖尿病肾病[14],[15]然而，这种现象背后的机制仍不清楚。

肌肉萎缩是营养不良和消瘦的表现，发生于患有慢性肾脏疾病、糖尿病和其他疾病的患者，如失神经、败血症和心力衰竭。已经有充分的证据表明，泛素-蛋白酶体系统（UPS）会导致肌肉萎缩[16]此外，自噬溶酶体途径（ALP）也已成为参与肌肉萎缩的重要蛋白质降解途径。诱导后，隔离膜伸长，随后包围部分蛋白质和功能失调的细胞器，从而形成双膜结构，即自噬体。然后，自噬体的外膜与溶酶体融合形成自溶体，其内容物在那里被溶酶体水解酶消化。最近的研究表明，在各种条件和疾病下，如失神经和禁食，骨骼肌中的自噬激活[17]此外，Lecker[18]据报道，自噬相关基因（ATG）LC3、Gabarapl1和Cathepsin L的mRNA表达在链脲佐菌素诱导的糖尿病和肾次全切除术诱导的尿毒症大鼠骨骼肌中上调，表明糖尿病和尿毒症鼠骨骼肌的自噬激活。然而，需要进一步的研究来证实糖尿病肾病大鼠的自噬激活。

Goto-Kakizaki大鼠表现出一种自发的多基因型糖尿病，并已被广泛确定为人类2型糖尿病的基因决定啮齿动物模型[19]此大鼠模型是使用经过重复选择性繁殖的正常Wistar大鼠制作的，它代表了一种自发的非胰岛素依赖性糖尿病动物模型[20]在本研究中，我们研究了LPD+KA对24周龄Goto-Kakizaki自发性2型糖尿病肾病大鼠肌肉萎缩的影响。血尿素氮（BUN）、尿蛋白和血清肌酐（Scr）水平的测量证实了糖尿病肾病的发病。首先，我们测试了补充酮酸的低蛋白饮食对24周龄GK大鼠肌肉萎缩的影响。其次，鉴于自噬在骨骼肌萎缩中的重要性，我们检查了大鼠肌肉的自噬异常情况，并评估了补充酮酸的低蛋白饮食对骨骼肌自噬的影响。综上所述，这些结果支持一种机制，即补充酮酸的低蛋白饮食可以减轻糖尿病肾病患者的肌肉损失。

方法

结果

尿蛋白和生化参数

从24周到48周，GK大鼠的尿蛋白水平显著高于Wistar大鼠(图1A). 32周时，饮食干预没有或几乎没有效果；然而，在40周龄时，与NPD组相比，补充酮酸的低蛋白饮食降低了尿蛋白水平。此外，在48周时，LPD+KA组和LPD组之间观察到显著差异。尽管饮食干预没有影响，但GK大鼠的血糖值也增加了(图1B). 在GK大鼠中，BUN和Scr水平较高，但通过蛋白质限制显著降低(图1C和1D). 然而，与前面提到的参数不同，GK和Wistar大鼠在24周龄和48周龄时的血清白蛋白水平没有差异，尽管GK大鼠的血清白蛋白有降低的趋势(图1E)。

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图1

实验组尿蛋白和生化参数。

喂食NPD、LPD和LPD+KA的Wistar和GK大鼠的尿蛋白（A）、血糖（B）、BUN（C）、Scr（D）和血清白蛋白水平（E）。数据表示为平均值±SD，^**与NPD、LPD和LPD+KA相比，p<0.01；^#与LPD+KA相比p<0.05；^&&与LPD和LPD+KA相比，p<0.01。BUN，血尿素氮；血清肌酐；NPD，正常蛋白质饮食；低蛋白饮食；LPD+KA，补充酮酸的低蛋白饮食。

体重和比目鱼肌质量

在Wistar大鼠中，体重从24周龄到48周龄逐渐增加。相反，喂食NPD和LPD的GK大鼠体重下降。喂食NPD和LPD的大鼠之间没有差异。然而，由于LPD+KA组的体重逐渐增加，补充KA可以部分纠正体重下降。虽然LPD+KA组在48周时的体重低于对照组，但在32周和40周时没有观察到显著差异(图2A). 此外，喂食NPD和LPD并于48周处死的GK大鼠比目鱼肌质量低于Wistar大鼠。此外，在LPD和NPD组中，GK大鼠的体重变化模式几乎相同。此外，与NPD和LPD组相比，添加酮酸的低蛋白饮食部分减少了比目鱼肌质量损失(图2B)。

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图2

实验组的体重减轻和比目鱼肌质量减轻。

喂食NPD、LPD和LPD+KA的Wistar大鼠和GK大鼠的体重（A）和比目鱼肌质量（B）的平均值±SEM。数据表示为平均值±SD，^**与对照组相比p<0.01；^#与LPD+KA相比p<0.05；^##与LPD+KA相比，p<0.01。NPD，正常蛋白质饮食；低蛋白饮食；LPD+KA，补充酮酸的低蛋白饮食；NPD，正常蛋白质饮食。

组织学分析

与对照组相比，NPD组和LPD组比目鱼肌纤维的平均CSA分别减少21.7%和20.3%。然而，补充酮酸增加比目鱼肌纤维的平均CSA(图3和图4)。

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图3

实验组比目鱼肌HE染色。

代表性HE染色图像为对照组（A）、NPD组（B）、LPD组（C）和LPD+KA组（D）。NPD，正常蛋白质饮食；低蛋白饮食；LPD+KA，补充酮酸的低蛋白饮食。

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图4

实验组比目鱼肌纤维的平均横截面积。

数据表示为平均值±SD，扫描条：50µm**与对照组相比p<0.01；^#与LPD+KA相比，p<0.05。NPD，正常蛋白质饮食；低蛋白饮食；LPD+KA，补充酮酸的低蛋白饮食。

自噬

与Wistar大鼠相比，喂食NPD的GK大鼠在自噬相关基因LC3B中的mRNA表达显著诱导(图5A)，贝克林-1(图5B)和Bnip3(图5C). LC3B是LC3家族的成员，是酵母Atg8的哺乳动物同源物，在自噬体的形成中起着关键作用[22]此外，III类PI3K–Beclin1复合物在自噬的启动中起决定性作用[23]有报道称，Bnip3是自噬信号的核心参与者，受Foxo3上调，导致自噬上调[17]此外，p62的mRNA水平直接与atg8/LC3结合，通过自噬降解泛素化蛋白聚集体[24]，在喂食NPD的大鼠比目鱼肌中较高(图5D). 总之，这些发现表明自噬上调，同时溶酶体组织蛋白酶L mRNA水平增加(图5E). 组织蛋白酶L是一种广泛表达的溶酶体蛋白酶，可介导细胞器和非肌原纤维胞浆蛋白聚集体的去除，其上调表明自噬-溶酶体途径上调。此外，低蛋白饮食也导致这些参数表达的增加略有减少，尽管与NPD治疗相比，这些变化都没有达到统计学意义。正如预期的那样，补充酮酸显著降低了这些基因的上调。LPD+KA组LC3B、Beclin-1和Bnip3的mRNA表达水平略高于对照组，尽管这些变化没有显著差异。

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图5

实验组自噬标记物的mRNA表达。

实验组比目鱼肌中LC3B（A）、Beclin-1（B）、Bnip3（C）、p62（D）和组织蛋白酶L（E）mRNA水平。数据表示为平均值±SD，*p<0.05与对照组相比**与对照组相比p<0.01；^#与LPD+KA相比p<0.05；^##与LPD+KA相比，p<0.01。NPD，正常蛋白质饮食；低蛋白饮食；LPD+KA，补充酮酸的低蛋白饮食。

同样，喂食NPD的GK大鼠的Beclin-1蛋白表达水平显著升高(图6A和6B)、Bnip3(图6C和6D)，第62页(图6E和6F)和组织蛋白酶L(图6G和6H)与Wistar大鼠相比。此外，低蛋白饮食也导致这些蛋白质的表达略有下降，尽管这些变化在统计学上并不显著。在LPD中添加KA可防止这些自噬蛋白的过度表达。

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图6

实验组自噬标记物的蛋白表达。

实验组比目鱼肌中Beclin-1（A）、Bnip3（B）、p62（C）和组织蛋白酶L（D）丰度的代表性蛋白质印迹分析和组数据。数据表示为平均值±SD，*p<0.05与对照组相比；^**与对照组相比p<0.01；^#与LPD+KA相比p<0.05；^##与LPD+KA相比，p<0.01。LPD、NPD、正常蛋白质饮食；低蛋白饮食；LPD+KA，补充酮酸的低蛋白饮食。

使用LC3B免疫印迹法确认NPD和LPD组的自噬激活。在自噬过程中，可溶性LC3-I通过向其不溶性形式LC3-II中添加磷脂酰乙醇胺进行脂化。LC3-II是自噬的标志物，与自噬体的内外膜结合。LC3-II水平与自噬体形成程度相关[22]在NPD和LPD组中，观察到膜结合LC3-II水平增加，表明与对照组相比，LC3与磷脂酰乙醇胺的结合增加。此外，NPD和LPD组也表现出LC3-I的增加，这可能反映了金属暴露的特征，其特征是与自噬相关的LC3基因表达的增加。在LPD中添加KA还可以防止LC3-II的过度表达(图7)。

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图7

实验组中LC3B的蛋白表达。

实验组比目鱼肌中LC3B-I（B）和LC3B-II（C）丰度的代表性蛋白质印迹分析（A）和组数据。数据表示为平均值±SD，*p<0.05与对照组相比；^**与对照组相比p<0.01；^#与LPD+KA相比，p<0.05。NPD，正常蛋白质饮食；低蛋白饮食；LPD+KA，补充酮酸的低蛋白饮食。

为了进一步证实NPD和LPD组动物的肌肉中诱导了自噬，使用TEM分析了肌肉纤维的超微结构。与对照组相比(图8A)，新产品开发(图8B)和LPD(图8C)各组显示自噬体和自溶体的形成。与正常和低蛋白饮食喂养的动物相比，补充酮酸可以消除自噬激活，而LPD+KA组动物的肌肉中观察到很少或没有自噬小泡(图8D). 这些自噬小泡的定量显示，与对照小鼠相比，NPD和LPD组小鼠肌肉中的自噬增加；与NPD和LPD组的小鼠相比，LPD+KA组的小鼠表现出自噬减少(图8E)。

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图8

实验组比目鱼肌的超微结构。

从对照组获得的比目鱼肌断面的典型电子显微照片显示，超微结构正常，并且没有自噬体（a）。从NPD组（B）和LPD组（C）获得的比目鱼肌部分的代表性电子显微照片显示了自噬体（黑色箭头）或自溶体（白色箭头）。从LPD+KA组获得的比目鱼肌断面的代表性电子显微照片，显示无自噬体或自溶体（D）。电子显微镜下比目鱼肌自噬小泡的定量（E）。^**与对照组相比，p<0.01；^#与LPD+KA相比p<0.05；^##与LPD+KA相比，p<0.01。NPD，正常蛋白质饮食；低蛋白饮食；LPD+KA，补充酮酸的低蛋白饮食。比例尺：500 nm。

讨论

慢性肾脏病与身体蛋白质质量和燃料储备的减少有关，这也称为蛋白质能量消耗（PEW）。血清白蛋白是一种可用于诊断PEW的生化指标，是维持性血液透析患者死亡率的有力预测因子[25]此外，低BMI与不良结局和高死亡风险相关[26]PEW还与炎症和心血管疾病相关，并显著增加慢性透析患者的死亡率[27],[28]肌肉萎缩被认为是CKD中PEW最有效的标志之一，与炎症和死亡率增加有关[29]肌肉萎缩在糖尿病（DM）患者中也很常见[30]，之前的研究表明，与非糖尿病ESRD患者相比，患有糖尿病的ESRD患者更容易出现肌肉萎缩[31],[32]慢性肾脏疾病和糖尿病共存会协同增加ESRD伴糖尿病患者的肌肉质量损失。胰岛素抵抗/缺乏的影响与尿毒症相关因素的影响相加，导致糖尿病肾病患者的肌肉萎缩。此外，尿毒症本身可能进一步证实肌肉蛋白分解增加的速度，主要是通过恶化胰岛素抵抗水平。除了胰岛素抵抗外，还有其他一些潜在因素可能会导致DM ESRD患者肌肉蛋白加速分解。例如，糖尿病患者患有糖尿病性胃轻瘫，这可能导致营养不良。因此，确定糖尿病肾病导致肌肉萎缩的机制对于了解改善营养状况的干预措施至关重要。在本研究中，我们试图确定补充酮酸的低蛋白饮食对2型糖尿病肾病大鼠肌肉萎缩和自噬的影响。在这项研究中，我们提供了一些新的发现。首先，我们的数据表明，糖尿病肾病大鼠骨骼肌中的自噬上调。其次，补充酮酸的低蛋白饮食可以减少肌肉损失。第三，与正常和低蛋白饮食的动物相比，补充酮酸的低蛋白饮食减少了自噬的增加。

几十年来，蛋白质限制被用于缓解尿毒症症状，保护残肾功能，以及改善慢性肾脏病患者的并发症，如糖代谢异常和高血压[1],[10],[33]此外，这些代谢效应导致较少使用磷酸盐粘合剂、别嘌呤醇和碳酸氢盐补充剂[34]和促红细胞生成素[35]在关于糖尿病肾病的研究中，有几份报告表明，低蛋白饮食可以预防糖尿病肾病患者和动物肾脏损伤的进展[36]与这些发现一致，我们发现LPD降低了Scr、BUN和尿蛋白水平，尽管血糖水平没有改变。我们还发现，蛋白质限制可以防止高滤过、功能性肾小球进行性硬化、氮浪费和氧化应激的减少等方面的血液动力学变化[37]然而，一些报告表明，脂多糖可能会略微减缓肾衰竭的进展，尽管这一发现在统计学上并不显著[38],[39]LPD对糖尿病肾病的影响一直存在争议。有必要对大量具有代表性的1型或2型糖尿病肾病患者进行长期研究，以确定蛋白质限制对糖尿病肾病的影响。然而，饮食对营养状况的潜在有害影响引起了一些关注[40].Brodsky及其同事[37]观察到患有早期肾病的1型糖尿病患者在食用LPD时会出现蛋白质营养不良，这可能与胰岛素缺乏引起的蛋白质分解增强有关。然而，佐丹奴（Giordano）也表明，低蛋白饮食可以有效地减少全身蛋白质分解，并与2型糖尿病患者蛋白质氧化减少和血清白蛋白水平升高有关[7]在这项研究中，我们发现与NPD相比，LPD并没有导致体重下降。此外，与喂食NPD的GK大鼠相比，喂食LPD的GK大鼠比目鱼肌质量和比目鱼CSA略高。然而，这种差异在统计学上并不显著，这表明LPD在没有恶化的肌肉萎缩的情况下对肾功能具有有益的影响。通过充足的能量摄入和对饮食依从性的仔细监测，低蛋白饮食对早期2型糖尿病肾病患者来说是营养安全的。首先，低蛋白饮食可以改善食欲和身体状况，从而获得充足的能量摄入。其次，由于代谢性酸中毒得到控制，尿毒症毒素减少，高分解代谢状态可能受到抑制。

然而，人们对使用酮酸等口服营养补充剂的热情有所增加。酮类捕获多余的氮残留物，并利用这些残留物生产必需氨基酸。因此，氮的摄入可能会受到限制，内源性尿素的形成也会减少。此外，如果有足够的必需氨基酸，就可以避免富含蛋白质的食物分解产生非分泌的、潜在有毒的离子和代谢产物的积累[41]最近的一项动物研究发现，在LPD中添加酮酸可以防止体重增加，并使血清白蛋白水平完全恢复正常，表明添加酮酸的LPD可以保持营养状态[11]。我们发现，补充酮酸的低蛋白饮食可以保持肌肉质量并减少体重下降，这表明补充了酮酸的LPD可能是一种潜在的干预措施，可用于改善2型糖尿病肾病引起的肌肉萎缩。然而，其他潜在机制仍有待阐明。

自噬是一种高度保守的稳态过程，其主要作用是在饥饿等应激条件下保护细胞，并维持对生存至关重要的氨基酸库。然而，如果过度诱导自噬，也可能导致细胞死亡和凋亡等病理变化。最近，自噬的激活已在多种情况下的骨骼肌和从禁食到疾病状态中得到证实[17],[18]，氧化应激[42]，失神经[43],[44]和药物效应[45],[46]一些系统性疾病，如脓毒症[47]，MDC1A[48]和癌症[18]我们已经报道了使用多种分析方法，包括RT-PCR，分析ATG mRNA表达，在糖尿病肾病大鼠的肌肉中激活自噬；western blotting分析，测量这些ATG的蛋白质水平；TEM，用于确认自噬小泡的外观并对其进行量化。我们的结果与之前的一项研究一致，该研究报道了肾次全切除术诱导的糖尿病大鼠和尿毒症大鼠骨骼肌中LC3、Gabarapl1和Cathepsin L的mRNA表达上调[18]这些发现表明，糖尿病与尿毒症相关因素联合作用，可增强糖尿病肾病大鼠肌肉的自噬。然而，虽然对非糖尿病肾病模型或无肾病的糖尿病动物的肌肉质量和自噬进行比较分析可以为每个因素所占比例的问题提供适当的答案，这样的实验并不是这项特定研究的主要目标，应该随着进一步的研究进行探索。这种额外的研究将使我们更好地了解自噬激活的机制。

重要的是，Carmignac[48]据报道，全身注射3-甲基腺嘌呤（3-MA），一种自噬抑制剂，可以减少MDC1A在动物模型中引起的肌肉萎缩。此外，3-MA完全消除了脂多糖诱导的肌肉蛋白水解[49]表明碱性磷酸酶的激活通过去除部分蛋白质和细胞器而导致骨骼肌萎缩[17],[43],[50].

鉴于自噬在肌肉萎缩中的重要作用，我们研究了LPD和LPD+KA对2型糖尿病肾病大鼠骨骼肌自噬的影响。有趣的是，我们发现LPD倾向于减少自噬的增加，尽管这一发现没有达到统计学意义。然而，LPD+KA消除了自噬的激活，表明LPD+KA通过消除自噬的激活改善了糖尿病肾病大鼠的肌肉萎缩。

众所周知，必需氨基酸或支链氨基酸（BCAA），特别是亮氨酸，刺激骨骼肌中的蛋白质合成。此外，BCAA可以激活蛋白激酶mTOR，其磷酸化4E结合蛋白1（4E-BP1）和70-kDa核糖体蛋白S6激酶（S6K1），随后刺激骨骼肌蛋白质合成[51],[52]此外，亮氨酸和BCAA可减少骨骼肌蛋白质降解[53],[54]然而，一些研究表明，BCAA降低了泛素连接酶atogin-1的表达，这表明BCAA通过抑制泛素-蛋白酶体系统降低了肌肉蛋白质降解[55]然而，一项动物研究报告，蛋白酶体mRNA的表达或E3蛋白-1和肌肉MuRF1的表达没有减少；然而，当大鼠接受亮氨酸治疗时，骨骼肌中自噬标记物LC3-II的表达显著降低[56]与这些发现一致，一项临床试验表明亮氨酸减少了骨骼肌的自噬[54].

此外，由于氨基酸对骨骼肌自噬的影响，LPD也被认为比正常蛋白质饮食增加自噬。出乎意料的是，与NPD相比，LPD并没有增加自噬。在正常受试者中，有人认为代谢适应主要是由于进食引起的氨基酸氧化和蛋白质降解减少所致[57]这些反应提高了氨基酸利用效率。在慢性肾功能衰竭患者中也显示了蛋白质切割机制。慢性肾功能衰竭患者的氨基酸氧化值较低，这表明蛋白质保留有潜在的“功能储备”[58],[59]这种代谢适应可能解释我们的发现。此外，我们发现与NPD相比，LPD有减少诱导自噬的趋势。因为限制蛋白质摄入有很多好处，例如减缓CKD的进展速度，减少代谢废物的积累，以及改善胰岛素敏感性[60]，我们推测这些益处促成了LPD对骨骼肌自噬的影响。然而，需要进一步研究来证实这一发现。

在新陈代谢过程中，氨基酸通过氨基酸基团的释放脱氨基或转氨基形成酮酸。这些反应是可逆的，使用酮类化合物可能会产生氨基酸。酮类化合物可以完全替代其各自的必需氨基酸来维持营养状态，因为这些化合物保持中性氮平衡。在这项研究中，我们观察到，与LPD相比，补充酮酸的LPD可消除骨骼肌中自噬的激活。这一发现与之前关于BCAA或必需氨基酸对骨骼肌自噬影响的几篇报道一致[54],[56]此外，有大量证据支持补充酮酸的LPD与单独使用LPD相比在缓解尿毒症症状方面的有效性[61]保护残肾功能[11],[62],[63]我们假设酮酸在减少骨骼肌自噬中间接保护肾功能。然而，补充酮酸的低蛋白饮食抑制自噬激活的机制仍有待研究。

总之，我们的研究表明糖尿病肾病大鼠骨骼肌中的自噬增加。此外，补充酮酸的低蛋白饮食改善了2型糖尿病肾病大鼠肌肉质量的损失，并阻断了骨骼肌自噬的激活。因此，这些发现可能为2型糖尿病肾病患者使用补充酮酸的低蛋白饮食提供相关的临床前数据。

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