《维罗尔杂志》。2011年12月；85(24): 13038–13048.
淋巴细胞性脉络膜脑膜炎病毒核蛋白的C末端区域含有独特和可分离的功能域，参与NP-Z相互作用和I型干扰素反应的对抗▿
，1 ，1 ，2,*和1,*
埃米利奥·奥尔蒂兹·里亚尼奥
1罗切斯特大学微生物学和免疫学系，纽约州罗切斯特市埃尔姆伍德大道601号，14642
本森·叶欣成
1罗切斯特大学微生物与免疫学系，地址：601 Elmwood Avenue，Rochester，New York 14642
胡安·卡洛斯·德拉托雷
2加利福尼亚州拉霍亚斯克里普斯研究所免疫学和微生物科学系，邮编：92037
路易斯·马丁内斯·索布里多
1罗切斯特大学微生物与免疫学系，地址：601 Elmwood Avenue，Rochester，New York 14642
1罗切斯特大学微生物与免疫学系，地址：601 Elmwood Avenue，Rochester，New York 14642
2加利福尼亚州拉霍亚斯克里普斯研究所免疫学和微生物科学系，邮编：92037
*通讯作者。路易斯·马丁内斯·索布里多的通讯地址：罗切斯特大学医学和牙科学院微生物和免疫学系，地址：601 Elmwood Avenue，Rochester，NY 14642。电话：（585）276-4733。传真：（585）473-9573。电子邮件：ude.reteshcor.cmru@zenitram_siul.Juan C.de la Torre的通讯地址：加利福尼亚州拉霍亚斯克里普斯研究所免疫学和微生物科学系，邮编92037。电话：（858）784-9462。传真：（858）784-9981。电子邮件：ude.sppircs@tcnauj. 收到日期：2011年7月28日；2011年9月21日接受。
摘要
几种沙粒病毒可导致人类出血热（HF）疾病，该疾病具有较高的发病率和显著的死亡率。沙粒病毒核蛋白（NP）是感染细胞和病毒粒子中最丰富的病毒蛋白，它包裹病毒基因组RNA，这种NP-RNA复合物与病毒L聚合酶一起形成病毒核糖核蛋白（vRNP），指导病毒RNA复制和基因转录。感染性沙粒病毒后代的形成需要将vRNP包装成萌芽颗粒，这一过程中沙粒病毒基质样蛋白（Z）起着核心作用。在本研究中，我们对原型沙粒病毒淋巴细胞脉络膜脑膜炎病毒（LCMV）的NP-Z相互作用进行了表征。与Z相互作用的LCMV NP结构域与之前记录的抵消宿主I型干扰素（IFN）反应的C末端结构域重叠。然而，我们发现影响LCMV NP抗IFN功能的单一氨基酸突变并未破坏NP-Z相互作用，这表明NP的C末端区域内不同氨基酸残基对这两种不同的可分离NP功能起着关键作用。HF沙粒病毒拉沙病毒（LASV）也证实了类似的NP-Z相互作用。值得注意的是，LCMV NP与LCMV Z和LASV Z的相互作用类似，而LASV NP仅与LASV Z.相互作用。我们的结果还表明，NP中存在一个保守的蛋白质结构域，但特定的氨基酸残基在确定NP-Z相互作用的特异性方面起着关键作用，这可能会影响重配型砂型病毒的生存能力。此外，这种NP-Z相互作用是抗病毒药物开发的潜在靶点，以对抗人类致病性沙型病毒。
简介
沙粒病毒引起啮齿动物的慢性感染，分布于世界各地(8). 人类通过粘膜接触气溶胶或皮肤擦伤与感染性物质直接接触而感染。几种竞技场病毒会导致人类出血热，并在其流行地区造成严重的公共卫生问题(8，41，52). 此外，由于往返流行地区的旅行增加，导致HF病例流入非流行地区的大都市地区(28). 根据其抗原特征和系统发育关系，砂状病毒可分为旧大陆砂状病毒（OWAs）和新大陆砂状毒（NWAs）(8). OWA拉沙病毒（LASV）是拉沙热（LF）的病原体，由于其广泛的地方性和高危人群的规模，是对公共卫生影响最大的HF沙粒病毒(21，26). 然而，一些NWA，尤其是阿根廷HF（AHF）病原体朱宁病毒（JUNV）(64)也是与临床相关的人类病原体(23). 此外，证据表明，全球分布的原始型沙粒病毒淋巴细胞脉络膜脑膜炎病毒（LCMV）可能是一种被忽视的人类病原体(30)在先天性感染中具有临床意义(1，44). 此外，免疫缺陷个体的LCMV感染可导致严重疾病和死亡(17，48). 新出现的高致病性沙粒病毒的潜力也值得注意，最近从南非HF患者中分离出的Lujo病毒就说明了这一点(7). 此外，一些沙粒病毒被列为A类毒剂，因为它们可能被用作生物恐怖主义的毒剂(4，10). 由于缺乏美国食品和药物管理局（FDA）许可的疫苗，以及目前的抗肾病毒治疗仅限于核苷类似物利巴韦林的非标签使用，人类致病性禽流感病毒引起的公众健康担忧加剧，而利巴韦林仅部分有效(31，42，43). 此外，有效的利巴韦林治疗需要早期静脉给药，并且通常伴随着显著的副作用(56，60). 所有这些原因都强调了开发新的抗病毒策略以对抗沙粒病毒感染的重要性，更好地了解沙粒病毒的分子和细胞生物学将有助于完成这项任务。
沙粒病毒是一种带有二分负链RNA基因组的包膜病毒。每个基因组片段命名为L（约7.3 kb）和S（约3.5 kb），使用双义编码策略编码两种病毒蛋白(8). L RNA编码病毒RNA依赖性RNA聚合酶（L）和称为Z的小环指蛋白，该蛋白已被证明是许多负链RNA病毒中基质（M）蛋白的沙粒病毒对应物。与许多M蛋白一样，竞技场病毒Z在病毒粒子组装中发挥着关键作用，是竞技场病毒出芽的主要驱动力(15，50，51，61，63). Z也被证明可以调节病毒的转录和复制(12–14，18，35)并与病毒聚合酶L相互作用(29，65)以及多种细胞蛋白，包括真核翻译起始因子4E、早幼粒细胞白血病蛋白（PML）、核糖体P0蛋白(三，9)和细胞内传感器维甲酸诱导基因I（RIG-I）(16). S RNA编码病毒糖蛋白前体（GPC）和核蛋白（NP）。GPC由细胞蛋白酶S1P翻译后处理，产生GP-1和GP-2(6，8)，形成糖蛋白复合物GP，构成装饰病毒结构表面的尖刺，并介导受体识别和细胞进入(8). NP是感染细胞和病毒中最常见的病毒蛋白。NP包裹病毒基因组，这种NP-RNA复合物与L一起形成病毒核糖核蛋白（vRNP）颗粒，它是病毒基因组在感染细胞细胞质中RNA复制和基因转录的功能单位(32，33，53). 除了在复制和转录中的关键作用外，NP通过阻止干扰素调节因子3（IRF-3）的激活和核移位，以及随后诱导干扰素产生和干扰素刺激基因（ISG），对抗病毒感染期间的宿主I型干扰素（IFN）反应(5，40). NP的抗干扰素功能为被检测家族的所有成员所共有，Tacaribe病毒（TCRV）NP除外(39). 突变功能研究将这种抗干扰素功能映射到NP的C末端区域，该区域包含一个功能性3′-5′核酸外切酶结构域(25，54)其活性与NP的抗干扰素活性有关(38).
对于许多包膜病毒，vRNP与病毒基质蛋白的相互作用被证明是形成成熟感染后代所必需的(24，57，58)和NP-Z相互作用被认为可以介导vRNP并入成熟感染病毒(20). 因此，最近的研究表明，沙粒病毒NP的C末端区域与其各自的Z（基质）蛋白相互作用(34，59). 然而，Z将沙粒病毒vRNP招募到成熟包膜感染后代中的机制尚不清楚。同样，负责NP-Z相互作用的NP结构域是否也参与其他NP功能尚不清楚。此外，异型NP-Z相互作用在产生新的活性重配型砂型病毒中的作用尚未被研究。
在这项工作中，我们提供了实验证据，证明LCMV NP与LCMV Z相互作用，并且这种相互作用是由NP的C末端区域介导的，该区域与先前描述的用于对抗宿主IFN反应的NP域重叠(38). 然而，损害NP抗IFN功能的特定单个氨基酸突变并没有影响NP与Z相互作用的能力，这表明NP C末端区域内的不同残基对这两种不同的NP活性有重要贡献。值得注意的是，我们观察到，LCMV-NP也与LASV Z有效相互作用，而LASV-NP与LASV-Z相互作用，但与LCMV-Z没有相互作用。这一发现表明，限制NP-Z交互作用的方向性可能会影响重配型砂型病毒的生存能力。此外，观察到缺乏N末端区域的NP参与NP自结合(47)仍能与Z相互作用表明单体NP既能与Z交互作用，又能抑制细胞I型IFN反应。对参与NP-Z相互作用的NP功能域的鉴定将有助于进一步研究，以详细了解沙型病毒的组装和感染后代的产生。同样，这种NP-Z相互作用是开发抗病毒药物的新靶点，能够干扰NP-Z的相互作用，从而抑制感染后代的产生。
材料和方法
细胞和病毒。
将仓鼠幼肾（BHK-21）细胞（ATCC CCL-110）、人胚胎肾（293T）细胞（ATCC CRL-11268）、Madin-Darby犬肾（MDCK）细胞（ATCC CCL-34）和非洲绿猴肾上皮（Vero）细胞（ATCC CCL-81）维持在补充有10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中，我-谷氨酰胺（2 mM）、青霉素（100单位/ml）和链霉素（100μg/ml）。细胞在37°C和5%CO中生长2大气。对于病毒感染，细胞保存在Opti-MEM还原血清培养基和每种细胞类型的正常培养基的混合物（1:1）中。LCMV（Armstrong株ARM53b）是通过感染BHK-21细胞（感染多重性[MOI]=0.1）并在感染后第3天或第4天采集上清液而产生的(55). 如前所述，LCMV滴度由Vero细胞免疫聚焦中心测定(2).
质粒。
通过将相应的开放阅读框（ORF）克隆到pCAGs多克隆位点（MCS）质粒的修改版本中，获得了LCMV和LASV的血凝素（HA）和FLAG标记的NP和Z版本(46). 为此，通过克隆HA（YPYDVPDYA）和FLAG（DYKDDDDK）表位对pCAGs-MCS质粒进行修饰，从而产生前面描述的N端或C端标记的蛋白质版本(45).
对于哺乳动物双杂交（M2H）系统，通过PCR扩增单纯疱疹病毒VP16反式激活域和GAL4 DNA结合域ORF，并将其克隆到pCAGG-MCS质粒中，分别生成pCAGs VP16和pCAGG GAL4质粒，含有两个侧翼MCS以促进N末端和C末端融合蛋白的产生。用PCR扩增LCMV、LASV NP和Z ORF的HA标记版本，并克隆到pCAGs VP16和pCAGG GAL4质粒中。先前描述的N末端和C末端缺失突变体，以及LCMV NP到丙氨酸的单氨基酸替换(38)，亚克隆到pCAGGs VP16质粒中，生成NP-VP16融合蛋白。参与LCMV NP C末端3′-5′核酸外切酶结构域活性位点的氨基酸(25，54)使用pGEM-T LCMV NP模板，通过定点突变（Stratagene）将丙氨酸（D382A、E384A、D459A、H519A和D522A）替换，并亚克隆到pCAGs VP16质粒中。通过将绿色荧光蛋白（GFP）ORF融合到萤火虫荧光素酶（FFL）编码序列的N末端区域，对pG5Luc报告质粒（Promega）进行修饰，生成pG5-GFP/Luc。
对于双分子荧光互补（BiFC）系统，通过PCR从pCAGs EYN-NS1和pCAGS EYC-NS1扩增黄色荧光蛋白（YFP）ORF的N端（EYN）和C端（EYC）序列，并克隆到pCAGs-MCS载体中，分别生成pCAGS-EYN和pCAGGs-EYC，包含两个侧翼MCS以促进N端和C端融合蛋白的生成。将LCMV NP和Z亚克隆到EYN和EYC pCAGs中，生成N端和C端融合蛋白。
如有要求，可提供产生所述质粒的引物。所生成结构的编码区通过DNA测序验证，蛋白表达通过Western blotting验证。
M2H分析。
293T电池（6.5×105每次转染）与2μg指示的pCAGs VP16和GAL4表达质粒、1μg报告的pG5 GFP/Luc质粒和0.1μg猴病毒40（SV40）悬浮液共转染-雷尼利亚荧光素酶表达载体pRL SV40（Promega），以使转染效率正常化，每μg质粒DNA使用1μg Lipofectamine 2000。将转染细胞接种到12孔组织培养板上。转染后48小时，使用蔡司荧光显微镜通过GFP表达评估蛋白质相互作用。成像后，制备细胞裂解物以测定荧光素酶活性和蛋白质表达。荧光素酶活性是使用双荧光素报告酶分析法（Promega）和发光计数光度计（Packard）测定的。报告基因的激活表现为阴性对照（pCAGGs NP-VP16-和pCAGGs GAL4转染的细胞）的倍数诱导。根据野生型NP-Z相互作用计算LCMV NP突变体的相互作用百分比。所有M2H实验均一式三份。使用Microsoft Excel软件计算平均值和标准偏差。使用所示抗体通过Western blotting测定蛋白质表达。
BiFC分析。
MDCK细胞（105)用1μg指定的pCAGGs-EYN和EYC质粒在悬浮液中转染，每μg质粒DNA使用1μg Lipofectamine 2000，并接种到放置在24孔组织培养板上的盖玻片上。转染后24小时，细胞在30°C和5%CO中培养3小时2允许YFP成熟的大气(27). 然后用100%甲醇固定细胞5 min，用0.1%Triton X-100渗透10 min，并在室温下用2.5%牛血清白蛋白（BSA）在1×磷酸盐缓冲盐水（1×PBS）中封闭1 h。样品在37°C温度下孵育1小时，并在2.5%BSA中稀释1:500的抗GFP单克隆抗体（AB1218；AbCAM），该单克隆抗体仅识别荧光蛋白的重组形式。随后，用1×PBS清洗细胞，并在37°C下用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI；Research Organics）和1:1000稀释的次级山羊抗鼠免疫球蛋白G（IgG）-Alexa Fluor 647（Invitrogen）孵育30分钟。用1×PBS清洗细胞，用Mowiol溶液将盖玻片安装在玻片上，并使用63×油浸物镜和蔡司荧光显微镜进行分析。图像使用Adobe Photoshop CS4（11.0版）软件着色。显示了至少三个独立转染的代表性图像。
免疫荧光。
Vero细胞（105将1.5μg的LCMV、LASV NP和Z表达质粒与每μg DNA使用1μg Lipofectamine 2000进行共转染。包括空的pCAGs-MCS质粒，以保持恒定数量的转染质粒DNA。转染后48小时，细胞在室温下用4%甲醛固定15分钟，在室温下使用0.1%Triton X-100渗透10分钟，然后在1×PBS中使用2.5%BSA隔夜封闭。封闭后，细胞在37°C下与指定的主要抗体孵育1小时：抗HA小鼠单克隆抗体（1:500；H9658；Sigma）和抗FLAG兔多克隆血清（1:500，F7425；Sigma-）。培养后，用1×PBS清洗细胞，并用DAPI（研究有机物）、1:500稀释的山羊抗鼠IgG-Alexa Fluor 488（用于单克隆抗体）和1:300稀释的山羊抗兔IgG-罗丹明红二级抗体在37°C下培养30分钟。然后用1×PBS清洗细胞，用Mowiol溶液将盖玻片安装在玻片上，并使用63×油浸物镜通过荧光显微镜进行分析。对于LCMV感染期间的NP-Z共定位，玻璃盖玻片上Vero细胞的亚融合单层被LCMV（MOI=0.1）感染，并且在48 hpi时，细胞被固定、渗透和阻断，如上所述。阻断后，用抗LCMV NP单克隆抗体（1.1.3）和抗LCMVZ多克隆兔血清在37°C下培养细胞1小时。培养后，用1×PBS洗涤细胞3次，并用DAPI、山羊抗鼠IgG-Alexa Fluor 488（NP单抗）培养细胞，山羊抗兔IgG-罗丹明红（用于Z多克隆抗体）。使用Mowiol溶液安装盖玻片，并按照上述方法进行分析。对照组包括模拟感染细胞。显示了三个独立转染或感染的代表性图像。
蛋白质凝胶电泳和蛋白质印迹分析。
蛋白质通过12%SDS-PAGE分离，并在4°C下转移到硝化纤维素膜（Bio-Rad）上过夜。在室温下用1×PBS中的10%干牛奶封闭1 h后，用抗HA小鼠单克隆抗体（1:1000；H9658；Sigma）、抗FLAG多克隆抗体（1:1000；F7425；Sigma1）、抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（抗GAPDH）单克隆抗体，抗VP16多克隆抗体（1:5000；V4388；Sigma）和抗GFP多克隆抗体。在4°C下用抗体孵育过夜。过夜培养后，用含有0.1%吐温20的1×PBS清洗膜三次，并在室温下用1:2000稀释度的相应次级辣根过氧化物酶结合抗鼠和/或抗兔Ig抗体（GE Healthcare United Kingdom）培养1小时。用含0.1%吐温20的1×PBS洗涤3次后，使用化学发光试剂盒和Denville Scientific公司的放射自显影胶片检测蛋白质。使用ImageJ软件（NIH）量化蛋白质带强度，并以野生型NP表达水平的百分比表示。
VLP的生成和隔离。
为了产生病毒样颗粒（VLP），在悬浮液中共转染293T细胞（6孔板型，106细胞/孔），每个指示质粒2.5μg，每μg DNA使用1μg脂质体2000。使用空的pCAGs-MCS质粒保持恒定数量的转染质粒DNA。在转染后72小时，收集细胞和组织培养上清液。上清液以10000 rpm澄清30 min，然后分层在20%蔗糖垫上，并在SW-41转子上以35000 rpm离心2.5 h。将含有VLP的颗粒重新悬浮在100μl的1×PBS中，并通过Western blotting分析20μl。用400μl裂解缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 7.4，5 mM EDTA，100 mM NaCl，1%NP-40，完整的蛋白酶抑制剂混合物；罗氏）在冰上裂解细胞颗粒30分钟。通过在4°C下以14000 rpm离心30分钟来澄清细胞裂解物。通过蛋白质印迹分析（输入）每个样品的20微升（占总细胞裂解物的5%）。
结果
LCMV NP-Z相互作用评估。
Z是沙粒病毒出芽的驱动力，在缺乏其他病毒蛋白的情况下，介导VLP的形成(50，51，61，63). 此外，LASV的Z蛋白(15)、莫佩亚病毒（MOPV）(59)和TCRV(34)已经证明可以调节NP并入VLP。为了表征原型砂型病毒LCMV的NP-Z相互作用，我们使用了两种互补的方法：M2H系统和BiFC分析。对于M2H系统()，我们用表达NP-VP16和GAL4-Z的pCAGG质粒共同转染293T细胞(A） ，与报告质粒pG5-GFP/Luc和pRL-SV40一起使转染效率正常化。在这个系统中，LCMV NP-Z相互作用将允许GAL4与报告质粒结合，而VP16反式激活域将招募报告基因表达所需的机制（GFP融合到FFL）。我们使用pCAGs VP16和GAL4质粒作为阴性对照，单独或与LCMV NP和Z标记表达质粒结合，以证明LCMV与NP-Z相互作用的特异性。我们使用GFP检测到LCMV NP-Z相互作用(B） 和FFL(C） 报告基因表达。当GAL4或VP16单独使用或与LCMV NP或Z蛋白联合使用时，未检测到报告基因表达，证明了相互作用的特异性。
LCMV NP-Z相互作用。（A） LCMV NP和Z WT蛋白分别融合到VP16和GAL4的示意图，用于M2H分析系统检测NP-Z相互作用。LCMV NP和Z分别融合到VP16（NP-VP16）和GAL4（GAL4-Z）的N端和C端结构域。M2H分析中的（B和C）LCMV NP-Z相互作用。用2μg NP-VP16和GAL4-Z pCAGG表达质粒、1μg双报告质粒pG5-GFP/Luc（检测蛋白质相互作用）和0.1μg SV40共同转染293T细胞（12孔格式）-雷尼利亚荧光素酶表达载体pRL SV40（以使转染效率正常化）。将GAL4和VP16表达质粒作为对照，以证明LCMV-NP-Z相互作用的特异性。转染48小时后，使用荧光显微镜（B）和制备的细胞提取物评估GFP的表达，并使用双荧光素酶报告分析测定相互作用的强度。雷尼利亚每个图像中都显示了荧光素酶值（平均值±标准偏差）。显示阴性对照物（NP-VP16加GAL4）上的折叠感应（C）。使用双荧光素酶报告基因测定法测定荧光素酶活性。报告基因激活表现为阴性对照（pCAGGs NP-VP16-和pCAGG GAL4-转染细胞）的折叠诱导。
为了确认并进一步表征这种LCMV-NP-Z相互作用，我们使用了BiFC分析(). 为此，我们将YFP的N末端（残基1至155；EYN）和C末端（残基156至239；EYC）融合到LCMV的NP或Z蛋白(A） ●●●●。NP-Z相互作用应恢复YFP三元结构和相关的荧光特性。我们确认，所有融合构建物均已表达，如使用检测GFP和YFP N端和C端结构域的抗GFP多克隆抗体进行的Western blotting所确定的(B） ●●●●。LCMV Z的表观分子质量的差异取决于EYN或EYC是否融合到N或C末端，这可能是由于N或C端EYN和EYC表达质粒之间的链接差异所致。在构造Z-EYC的情况下，我们观察到具有更快迁移率的额外带，这可能反映了降解产物。然后我们将MDCK细胞与指定的质粒组合共转染(C） ●●●●。在联合转染NP-EYN和EYC-Z以及NP-EYC和EYN-Z的细胞中，我们观察到YFP的表达表明LCMV-NP-Z相互作用(C、 YFP）。为了证实YFP的重组，我们使用了一种单克隆抗体，它只识别YFP重组的三元荧光结构(C、 α-GFP）。与我们之前使用M2H分析的数据一致()当LCMV NP融合到EYN或EYC的N端，LCMV Z融合到EY或EYC的C端时，检测到LCMV与NP-Z的相互作用。相反，我们在其他组合中没有检测到LCMV NP-Z相互作用，这进一步支持了这种NP-Z交互作用的特异性。
使用BiFC测定法检测LCMV NP-Z相互作用。（A） 融合到N末端（EYN）和C末端（EYC）YFP的LCMV NP和Z蛋白的示意图。（B） 蛋白质表达水平。用检测YFP N端和C端区域的抗GFP多克隆抗体（α-GFP）制备转染所示质粒的293T细胞的细胞裂解液，并通过Western blotting进行分析。GAPDH被用作负荷控制。左侧显示了蛋白质分子质量标记（kDa）。（C） YFP荧光的重建。MDCK细胞与1μg所示质粒组合共转染（24孔板格式）。转染后24小时，细胞在30°C下培养3小时，以使YFP成熟。用荧光显微镜（YFP）和仅识别重组GFP或YFP（α-GFP）的抗GFP单克隆抗体检测YFP的重组，并显示细胞核的DAPI染色和合并图像。显示了具有代表性的图像。放大倍数，×63。棒材，10μm。
LCMV NP和LCMV Z的亚细胞共定位。
BiFC的结果表明，NP-Z相互作用介导的重组YFP荧光仅限于细胞质(C） ●●●●。为了证实NP-Z相互作用如预测的那样发生在细胞浆中，我们将LCMV NP-HA和基于LCMV Z-FLAG pCAGGs的表达质粒单独或联合转染Vero细胞(). 在单次转染中加入空的pCAGs质粒，以使总转染DNA量正常化。LCMV NP和Z蛋白的C末端表位标记先前已证明不会影响这些蛋白的功能(40，50). 当单独表达时，LCMV NP和Z均在细胞质中扩散分布，但Z也表现出明显的质膜定位(A） ●●●●。有趣的是，在同时表达NP和Z的细胞中，我们观察到细胞质聚集体的形成，其中NP和Z共存。接下来我们研究了这些含NP和Z包涵体的形成是否也发生在LCMV感染的细胞中。为此，我们用LCMV感染Vero细胞（MOI=0.1 PFU/cell），在48 hpi时，我们使用抗NP小鼠单克隆抗体和抗Z兔多克隆血清通过双重免疫荧光染色检查细胞(B） ●●●●。我们观察到NP和Z在细胞质包涵体内的共定位。
LCMV NP和Z蛋白的亚细胞共定位。（A） NP-Z在转染细胞中的共定位。Vero细胞与1μg所示质粒共转染。使用空的pCAGG质粒使单个质粒转染正常化。转染后48小时，用抗HA（α-HA）单克隆抗体（NP染色）和抗FLAG（α-FLAG）多克隆抗体（Z染色）进行免疫荧光染色。细胞核用DAPI染色。合并和放大的正方形如图所示。（B） LCMV感染细胞中的NP-Z共定位。Vero细胞被模拟或LCMV感染（MOI=0.1）。在48 hpi时，使用抗NP（α-NP）单克隆抗体（1.1.3）和抗Z（α-Z）多克隆抗体评估NP和Z的亚细胞定位。图中还显示了NP（绿色）、Z（红色）和DAPI（蓝色）染色的合并图像以及所示正方形的放大图像。显示了具有代表性的图像。放大倍数，×63。棒材，5μm。
LCMV NP与LCMV Z相互作用所需的映射区域。
为了确定参与NP-Z相互作用的LCMV NP结构域，我们使用了一系列先前描述的N末端()和C端子()LCMV NP缺失突变体(38). 我们将这些突变体与VP16融合，并将其用于M2H分析，以评估其与Z的相互作用能力。
NP-Z相互作用不需要LCMV NP的N端300氨基酸。（A） M2H分析系统中使用的LCMV NP野生型和N末端缺失突变体的示意图。野生型和NP缺失突变体的总氨基酸长度如右图所示。（B） LCMV NP-Z与N末端缺失突变体的相互作用。共转染细胞（293T），并在细胞裂解液中量化NP-Z相互作用的存在，如图例所述根据野生型NP-Z相互作用计算N-末端缺失突变体的相互作用百分比。（C） LCMV NP N末端缺失突变体的蛋白表达水平。使用抗VP16（α-VP16）多克隆抗体通过Western blotting分析转染293T细胞的细胞裂解液的蛋白表达水平。GAPDH被用作负荷控制。左侧显示了蛋白质分子质量标记（kDa）。
LCMV NP的C末端结构域参与NP-Z相互作用。（A） M2H分析系统中使用的LCMV NP C末端缺失突变体的示意图。野生型和NP C末端缺失突变体的总氨基酸长度如右图所示。（B） NP C末端在LCMV NP-Z相互作用中的作用。293T细胞与所示质粒共转染，NP-Z相互作用在细胞裂解液中定量，如图例所述根据野生型NP-Z相互作用计算C-末端缺失突变体的相互作用百分比。（C） LCMV NP C末端缺失突变体的蛋白表达水平。用于实验的相同细胞提取物（其结果显示在图B中）用于通过使用多克隆抗VP16（α-VP16）抗体的Western印迹检测LCMV NP野生型和C末端缺失突变体的表达。GAPDH表达水平用作负荷控制。左侧显示了蛋白质分子质量标记（kDa）。
LCMV NP N端前300个氨基酸的缺失(A） 未显著影响LCMV NP与LCMV Z相互作用的能力(B） ●●●●。然而，进一步的N末端缺失（例如ΔN350）破坏了LCMV NP与LCMV Z相互作用的能力(B） ●●●●。我们观察到NP N末端缺失突变体之间的表达水平存在差异，但所有突变体都是使用VP16多克隆抗体通过Western blotting检测到的(C） ●●●●。应该注意的是，突变体ΔN350与Z相互作用的能力受损，但ΔN350的表达水平与NP野生型相似。同样，我们还检测了LCMV NP C末端缺失突变体与LCMV Z相互作用的能力(A） ●●●●。最后5个氨基酸的缺失并不影响LCMV NP与LCMV Z相互作用的能力(B） ●●●●。然而，LCMV NP C末端（例如ΔC10）5个以上氨基酸的缺失显著影响了其与LCMV Z的相互作用(B） ●●●●。这种相互作用的缺乏并不是由于蛋白质表达的显著差异，因为所有LCMV NP C末端缺失突变体的表达与野生型LCMV NP相似(C） ，这一发现与之前发布的数据一致(47). 这些结果表明，LCMV NP的C末端区域（氨基酸300到553）是必需的，足以与LCMV Z相互作用。
研究LCMV NP的抗干扰素活性与其与LCMV Z相互作用的能力之间的关系。
我们之前已经证明，LCMV NP的C末端区域（氨基酸370至553）是其抗干扰素活性所必需的(38). 由于NP的C末端结构域也参与了其与LMCV Z的相互作用，我们研究了是否可以在LCMV NP的一级结构中分离这两种NP活性。与其他沙粒病毒NP相比，TCRV NP缺乏分离这两个NP活性的能力，这一观察为分离这两类NP活性提供了支持，以抵消IFN反应(39)以及拯救一株在NP中携带D382A突变的活的重组LCMV（rLCMVD382A），该病毒缺乏抵抗干扰素反应的能力(38)但TCRV NP-Z和LCMV NP-Z相互作用分别需要用于产生感染性TCRV和LCMV。为了实验验证这一假设，我们在M2H分析中评估了DIEGR基序（D382A、G385A和R386A）突变的LCMV NP的能力(38)以及最近描述的3′-5′核酸外切酶基序（D382A、E384A、D459A、H517A和D552A）(25，54)，所有这些都在NP的IFN抵消活性中起着关键作用，与Z相互作用(). 作为对照，我们使用了LCMV NP I383A突变体，我们之前显示该突变体保留了其抗干扰素功能(38). 所有NP突变体与LCMV Z的相互作用水平与LCMV-NP野生型相当(A） 表达水平与LCMV NP野生型相当(B） ●●●●。这些结果表明，在NP抗干扰素活性中起关键作用的残基对NP-Z相互作用并不重要。
M2H分析中NP-Z相互作用不需要LCMV NP抗IFN功能所需的关键氨基酸残基。如图例所述，将293T细胞共转染至但使用指示的LCMV NP IFN突变体。在转染后48小时，通过双核糖核酸酶报告分析定量NP-Z相互作用。（A） 根据野生型NP-Z相互作用计算单个氨基酸突变体的相互作用百分比。（B） LCMV NP突变体的蛋白质表达水平。使用来自实验的相同细胞裂解液（结果如面板A所示），使用抗VP16（α-VP16）多克隆抗体通过Western blotting检测LCMV NP野生型和单氨基酸突变体的表达。GAPDH表达水平作为负荷对照。左侧显示了蛋白质分子质量标记（kDa）。
评估LCMV和LASV之间的同型和异型NP-Z相互作用。
用两种表型不同的竞技场病毒株（或变体）共同感染同一细胞会产生含有S和L基因组片段交换的重配病毒的病毒子代。这种遗传学方法已被广泛用于确定病毒基因产物在砂状病毒发病机制中的功能。然而，为了产生可存活的重配沙粒病毒，两种病毒株同时感染同一细胞的L和S基因组片段编码的蛋白质应允许产生和繁殖感染性病毒后代所需的病毒-蛋白质相互作用。沙粒病毒NP和Z蛋白分别由S和L基因组片段编码，需要相互作用才能将vRNP并入Z介导的出芽病毒中。之前已经描述过OWA之间重组病毒的生成(36). 为了评估LASV和LCMV之间的异型NP-Z相互作用，我们首先使用M2H分析系统确认了LASV中NP-Z的相互作用(). LCMV NP与LASV Z相互作用，但LASV NP不与LCMV Z相互影响，表明LASV和LCMV的NP和Z蛋白之间存在单向相互作用。
通过M2H分析方法评估LCMV和LASV之间的同型和异型NP-Z相互作用。如图例所述，共转染293T细胞，带有指示的LCMV和LASV NP和Z哺乳动物双杂交表达质粒。转染后48小时，利用荧光显微镜（A）通过GFP表达检测同源和异源NP-Z蛋白相互作用。GAL4和VP16表达质粒作为阴性对照。雷尼利亚每个图像中都显示了荧光素酶值（平均值±标准偏差）。为了量化相互作用，制备细胞裂解物以检测荧光素酶的表达，如图例所述（B）异源NP-Z相互作用的相互作用百分比根据同源相互作用（B）进行归一化。
Z已被证明是竞技场病毒萌芽的驱动力(50，51，61，62). 因此，NP-Z相互作用预计在将vRNP包装成Z介导的出芽病毒颗粒中发挥关键作用。因此，我们预测LASV NP不会被纳入LCMV Z诱导的VLP中。为了检测NP并入Z介导的VLP生成，我们使用了先前描述的VLP分析(33) (). 为此，我们生成了带有HA标记的LCMV和LASV NP版本，以及带有FLAG标记的LCDV和LASV Z版本，并单独或联合转染到293T细胞中。转染72小时后，收集组织培养上清液和细胞裂解液。上清液通过20%蔗糖垫制成颗粒，含VLP的颗粒通过Western blotting进行分析。我们观察到，LCMV和LASV NPs都合并到LASV Z诱导的VLP中。相反，LCMV NP而非LASV NP被纳入LCMV Z介导的VLP。正如预期的那样，在组织培养上清液中没有检测到LCMV或LASV NPs的单独表达，这表明在Z诱导的VLP中存在特定的NP掺入。根据细胞裂解物的Western blotting测定，所有标记蛋白的表达水平相似(，输入，α-HA和α-FLAG）。
同源和异源NP并入LCMV和LASV Z诱导的VLP。293T细胞（6孔板格式）与2μg指示的LCMV或LASV NP（HA标记）和Z（FLAG标记）pCAGs表达质粒共同转染。在所有情况下，都包括空的pCAGs-MCS质粒，以使转染DNA的数量正常化。在转染后72小时，制备细胞提取物并分析蛋白质表达水平（输入）。来自相同转染的上清液用于分离VLP。使用抗HA（α-HA）单克隆抗体（NPs）或抗FLAG（α-FLAG）多克隆抗体（Zs）通过Western blotting检测不同沙型病毒NPs和Zs的表达水平。GAPDH被用作负荷控制。每个Western印迹条带底部的数字表示带强度，以同源NP或Z表达水平的百分比表示。
LCMV和LASV NP-Z的共定位。
由于观察到的单向NP-Z异型相互作用出乎意料，我们试图通过评估LCMV和LASV NP和Z蛋白在质粒转染细胞中的共定位来证实这些结果(). 我们用HA标记的LCMV和LASV NP共同转染Vero细胞，单独或以不同组合转染FLAG标记的LCCV和LASV Z。LCMV核电厂(A） 和LASV NP(B） 在转染细胞的细胞质中呈弥散分布，而LCMV Z(C） 和LASV Z(D） 分布在整个细胞质中，但也存在于细胞膜中。LCMV中NP和Z的共转染(E） 或来自LASV(H） 导致包含NP和Z蛋白的包涵体的细胞质形成。当我们在LCMV NP存在的情况下用LASV Z替换LCMV Z时，我们观察到类似的包涵体(F） ●●●●。另一方面，LASV NP和LCMV Z的共表达导致两种病毒蛋白的最小共定位以及大包涵体的缺失(G） ，通过M2H和VLP分析证实了我们的结果。
评估同型和异型NP-Z共定位。如图例所述，Vero细胞被联合转染，具有指示的蛋白质表达质粒（左）。在转染后48小时，细胞被固定并渗透，然后用抗HA（α-HA）单克隆抗体（NPs）和抗FLAG（α-FLAG）多克隆抗体（Zs）进行免疫荧光。图中显示了NP（绿色）、Z（红色）和DAPI（蓝色）染色的合并图像以及合并的放大图像。显示了具有代表性的图像。放大倍数，×63。棒材，5μm。
讨论
在这项工作中，我们记录并初步表征了原型砂状病毒LCMV和HF砂状病毒LASV的NP和Z蛋白之间的相互作用。LCMV-NP-Z相互作用的稳健性通过三种不同方法的检测得到反映：M2H分析()、BiFC()和使用双重免疫荧光的共定位研究(). 此外，我们提供了证据表明，LCMV NP与LASV Z相互作用，但LASV NP和LCMV Z没有相互作用。这一发现表明，NP和Z之间的异型相互作用具有单向成分，这可能会影响活的重配型砂型病毒的产生。使用N端子集合()和C端子()我们发现LCMV NP的C末端区域（氨基酸300到553）与LCMV Z相互作用。由于LCMV NP的相同C末端区域也参与NP的抗IFN活性(38)，我们检查了NP的抗干扰素和Z结合活性相互关联且无法分离的可能性。为此，我们评估了一组在保守DIEGR基序（D382A、G385A、R386）中发生突变的NP突变体的Z结合活性(38)以及根据LASV NP的研究结果预测的LCMV NP 3′-5′核酸外切酶结构域的活性位点（D382A、E384A、D459A、H517A和D522A）内(25，54). 我们之所以选择这些突变体，是因为发现DIEGR基序内有突变的病毒以及那些影响NP外切核酸酶活性的病毒的抗干扰素活性受损。我们的结果表明，受其抗干扰素功能影响的NP突变体仍然能够与LCMV Z相互作用，其水平与LCMV-NP野生型的水平相当(). 这些结果表明，不同的氨基酸残基控制着这两种NP活性。这一结论的进一步支持源于TCRV NP缺乏抵抗干扰素反应的能力(39)以及拯救携带NP中D382A突变的重组LCMV（rLCMVD382A），该突变导致病毒失去抵抗IFN反应的能力(38)，而TCRV NP-Z和LCMV NP-Z相互作用分别是产生TCRV和LCMV感染所必需的。还描述了TCRV的NP-Z相互作用(34)，但TCRV NP不会抵消IFN反应(38)因此，这些先前的研究并没有评估NP的抗干扰素活性与其与Z相互作用的能力之间可能存在的重叠。对NP突变体的鉴定有助于验证这一结论，突变体会影响其与Z的相互作用能力，但不会影响其抗干扰物功能。
我们观察到NP和Z在细胞质包涵体内共定位，类似于病毒复制的典型工厂。微基因组（MG）报告基因检测的结果表明，Z对沙粒病毒RNA复制和基因转录并不是严格要求的，但基于MG的检测可能不会完全重新创造沙粒病毒自然感染过程中病毒RNA合成的所有调控方面。另一方面，Z被证明可以抑制病毒的转录和复制(12–14，35)，我们的研究结果表明，NP-Z相互作用可能会将vRNP从病毒RNA合成位点螯合到出芽颗粒中，尽管Z与L的相互作用可能同样是Z介导的对病毒RNA合成的抑制作用的原因(29).
正如预测的那样，我们还观察到LASV NP和Z蛋白之间的相互作用。值得注意的是，M2H分析结果()以及VLP分析()和共同定位研究()表明LCMV NP与LCMV和LASV Z蛋白相互作用，而LASV NP则与LASV相互作用，但与LCMVZ蛋白不相互作用。LCMV和LASV的NP和Z之间的这种单向异型相互作用表明，LCMV与LASV两种病毒的NP中都存在一个保守的蛋白结构域，但特定氨基酸残基在决定这种蛋白-蛋白质相互作用的特异性方面起着关键作用。值得注意的是，OWAs MOPV和LASV之间重组病毒的特征很容易识别出含有MOPV L段和LASVS段的病毒，但没有获得含有LASV L段与MOPV S段的重组病毒(36). 根据我们对LCMV、LASV NP和Z蛋白的研究结果，我们认为MOPV Z蛋白可以与LASV NP有效相互作用，但LASV Z不能与MOPV NP有效相互影响。据我们所知，LCMV和LASV之间尚未描述重组体。我们的结果预计，由于LASV NP无法与LCMV Z相互作用，因此只有包含LCMV S段和LASV L段的重组子才可行，而不是相反的组合。
最近描述的LASV NP的晶体结构表明，NP可能通过N-到C-末端的相互作用自缔合(54). 然而，这些结构预测似乎与我们和其他人获得的生化和功能结果不一致，这表明NP-NP相互作用是通过NP的N末端结构域发生的(34，47). LCMV NP N末端的50个氨基酸的缺失影响了NP-NP的相互作用而不影响其抗IFN活性，这表明NP的单体可能会抵消IFN反应并与Z相互作用。这反过来，提出了一种耐人寻味的可能性，即在感染了包括LASV在内的一些沙粒病毒的细胞中报告了与NP相关的较小多肽(11)和NWA皮钦德病毒(22)，可以表示能够与Z相互作用的C末端片段，也有助于病毒抗IFN活性。
基于我们的发现，我们建议NP由两个不同的域组成(). C末端结构域（氨基酸370至553）负责抵消宿主I型干扰素反应(38). 在此域中，DIEGR(38)和3′-5′核酸外切酶(25，54)基序在抗干扰素活性中起关键作用。然而，抗干扰素活性有限的沙粒病毒，如TCRV NP(19，39)可能还有MOPV NP(37，49)，包含3′-5′核酸外切酶基序预测活性位点的所有保守残基(25，38，39，54). 这可能表明，尽管NP的3′-5′核酸外切酶活性可能在对抗IFN应答中发挥重要作用，但NP需要额外的NP成分才能充分发挥其抗IFN活性。除了其抗干扰素活性外，C末端结构域还指导NP与Z的相互作用，但参与该活性的关键残基不同于那些有助于NP抗IFN活性的残基。N末端结构域（氨基酸1至358）参与NP自结合(34，47). 然而，这两个结构域都不能通过病毒L聚合酶自身介导RNA复制或转录，这需要NP的完整性，但最后五个C末端残基除外(38).
LCMV NP功能域。LCMV NP一级结构的示意图表示蛋白质功能相关的结构域（顶部）和相互作用（底部）。根据小基因组报告基因分析的结果，LCMV NP的整个一级序列是复制和转录所必需的，最后5个氨基酸除外(38). N末端结构域（氨基酸1到358）包含参与自结合的区域(47). C末端结构域包含负责抵消干扰素反应的区域（氨基酸370至553），包括DIEGR基序（矩形）(38)和3′-5′核酸外切酶基序的催化位点（红色）(25，54)以及与LCMV Z相互作用的区域（氨基酸350至553）。
砂型病毒在人类健康和生物防御准备方面的重要性，加上现有对抗这些感染的设备有限，突出了开发新型有效抗肾病毒药物的重要性。为此，靶向NP-NP和NP-Z相互作用代表了一种新的抗肾病毒策略。可以在不需要在高致病性竞技场病毒的情况下使用活病毒所需的高度生物安全控制的情况下，开发检测和筛选程序来识别用于实施这一策略的药物，这将极大地促进研究。使用仅限于在GP表达细胞系中复制的单周期感染性沙粒病毒可能是一种更安全的方法，用于识别针对沙粒病毒复制周期多个方面的抗病毒药物(55). 我们的结果还表明，可能有可能鉴定出能够干扰多种沙型病毒的NP-NP和NP-Z相互作用的化合物，从而代表开发具有抗多种人类致病性沙型病毒活性的抗病毒药物的候选药物。
致谢
我们感谢L.M.-S实验室成员的讨论，特别是感谢Shanaka Rodrigo和Snezhana Dimitrova的技术建议和支持。我们还感谢Juan Ayllon和Adolfo García-Sastre（西奈山医学院）提供EYN和EYC表达质粒，以及对BiFC分析的有益建议。我们也对阿尔巴·瓜恩（麦克马斯特大学健康科学中心）的宝贵意见和讨论表示感谢。
E.O.-R是Fulbright-Conicyt奖学金获得者(2008年生物信息). L.M.-S.实验室的研究部分由NIAID拨款资助RO1AI077719；。J.C.D.L.T.的研究得到了资助RO1 AI047140;,RO1 AIO77719;, 和RO1 AI079665来自NIH/NAID。
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