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.2003年10月28日；100(22):12978-83.
doi:10.1073/pnas.2133782100。 Epub 2003年10月16日。

小环指蛋白Z驱动沙粒病毒萌芽：对抗病毒策略的影响

马·佩雷斯 1, 丽贝卡·C·克雷文, 胡安·德拉托雷
附属公司

小环指蛋白Z驱动沙粒病毒萌芽：对抗病毒策略的影响

马·佩雷斯等。 美国国家科学院程序. .

摘要

通过使用基于原型竞技场病毒淋巴细胞性脉络膜脑膜炎病毒（LCMV）的反向遗传学系统，我们已经确定竞技场病毒小环指Z蛋白是病毒出芽的主要驱动力。LCMV和拉沙热病毒（LFV）Z蛋白都表现出自萌芽活性，并且都有效地替代了Rous肉瘤病毒Gag蛋白中的晚期结构域。LCMV和LFV Z蛋白包含具有晚期结构域特征的富含脯氨酸的基序。LCMV Z的PPPY基序突变严重损害了类病毒颗粒的形成。LFV Z包含两个不同的富含脯氨酸的基序，即PPPY和PTAP，它们由八个氨基酸分开。突变分析表明，这两个基序都是LFV Z介导的有效芽接所必需的。LCMV和LFV Z蛋白都被招募到质膜Tsg101，这是E类空泡蛋白分选机制的组成部分，与HIV和埃博拉病毒的萌芽有关。通过RNA干扰靶向Tsg101导致Z介导的出芽显著减少。这些结果表明，Z是在其他负链包膜RNA病毒中发现的基质蛋白的砂状病毒功能对应物。此外，液泡蛋白分选途径的成员似乎在砂状病毒出芽中起着重要作用。这些发现为抗病毒策略对抗LFV和其他出血热病毒提供了可能性。

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数字

图1。
图1。
VLP的生产严格要求使用LCMV Z。(一个)在LCMV蛋白的不同组合存在下，LCMV MG表达CAT。非乙酰化（NAc）和单乙酰化（MAc）氯霉素。(B类)释放含有Z蛋白的囊泡。转染细胞SP中存在的VLP通过20%蔗糖缓冲液超速离心获得，并通过Western blotting进行分析。(C类)通过RT-PCR检测转染细胞SP中存在的与VLP相关的MG RNA。
图2。
图2。
Z具有真正的出芽蛋白的特征。(一个)Z有自我萌芽的活动。Z从转染细胞的SP中免疫沉淀，并用代谢标记[35S] 已见面/[35S] 赛斯。作为对照，用编码LCMV-NP的质粒转染细胞。(B类)Z可以替代RSV L域。用所示结构转染细胞的裂解物和SP中存在的蛋白质，并用[35S] 大都会/[35S] 免疫沉淀Cys以检测Gag裂解产物。(C类)砂状病毒Z和不同病毒Gag和M蛋白中富含脯氨酸基序的比较。
图3。
图3。
PPPY基序负责LCMV Z的出芽活性(一个)显示了带有突变PPPY基序的Z蛋白的序列和表达。标识由虚线表示。蛋白质用α-HA抗体进行Western blot检测。(B类)突变蛋白对MG衍生CAT活性没有影响。(C类)PPPY基序的突变导致VLP的产生急剧减少。通过RT-PCR扩增与VLP相关的MG RNA。(D类)PPPY中含有Z的突变未能恢复缺乏L结构域的RSV-Gag蛋白的出芽特性。用IPP分析转染细胞裂解液和SP中的蛋白质。CA，衣壳蛋白；PR，蛋白酶。
图4。
图4。
PTAP和PPPY基序都是LFV Z介导的有效芽接所必需的(一个)LFV Z有自我萌芽的活动。转染细胞SP标记的LFV Z的IPP[35S] 已见面/[35S] 赛斯。(B类)LFV Z可以在功能上替代RSV Gag的L域。转染细胞裂解物和SP中存在的蛋白质的IPP显示存在Gag裂解产物。(C类)LFV Z可有效替代LCMV Z形成传染性VLP。(D类)富含脯氨酸基序突变的LFV Z的序列和表达。突变残基为灰色。完整的图案由方框表示。蛋白质用α-HA抗体进行Western blot检测。(E类)PTAP和PPPY基序的突变都会损害VLP的产生。通过RT-PCR扩增与VLP相关的MG RNA。
图5。
图5。
野生型和突变型LCMV和LFV Z蛋白在BHK-21细胞中表达时具有相同的细胞内分布模式。PPPY结构域突变为AAPA的AAPA、Z蛋白；LTAL，PTAP基序突变为LTAL的Z蛋白。
图6。
图6。
(一个)BHK-21细胞中LCMV Z-HA（红色）和Tsg101-myc（绿色）的Z共表达导致这两种蛋白的共定位。(B类)通过Western blot或直接荧光检测到，转染一个指导EGFP特异性siRNA合成的质粒（pS-EGFP）导致EGFP蛋白水平降低。(C类)用质粒Tsg101-myc和pS-Tsg101共同转染细胞会导致Tsg102-myc蛋白的表达水平严重降低。(D类)Tsg101特异性siRNA的细胞内表达导致VLP形成受损。
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