介绍All-in-One™qPCR与经验证的引物混合，提供通用的qPCR反应条件和可靠的定量PCR数据。联合开发和共同优化的All-in-One qPCR混合物和基因特异性引物提供了您所需要的全部优势，而没有您期望的任何高成本：
- 统一的反应条件减少了实验设计时间，从而可以提前提交期刊
- 即使对于低拷贝基因，高扩增效率和灵敏度也意味着每次定量都可靠
- 无非特异性扩增*和无引物二聚体*可确保数据的重现性和可发布性
All-in-One qPCR混合使用高保真热启动聚合酶、优化的反应缓冲液和高质量的dNTP，以实现甚至低拷贝RNA（cDNA）或DNA物种的特异性和敏感性扩增（图1）。
图1。使用全合一qPCR主混合物进行qPCR反应。使用Genecopoire All-in-One cDNA合成试剂盒逆转录MCF-7细胞的1微克总RNA。RT反应稀释至1pg至1ng RNA/µl。使用GeneCopoeia All-in-One qPCR Mix（A）在随后的qPCR中使用1µl稀释RT反应进行35个周期。最终产品在2%琼脂糖凝胶（B）上运行。
图2。2X All-in-One™qPCR混合物的扩增效率和检测灵敏度通过5×10质粒DNA梯度稀释的标准曲线进行评估6到5个分子。扩增和熔化曲线的峰值表明，使用All-in-One™qPCR Mix可以获得很高的灵敏度，它可以检测低至5个分子。同时，各浓度之间的良好线性关系也显示出较高的放大效率。全合一qPCR验证引物完成工作
使用GeneCopoeia的精确qPCR消除无休止的调整和优化。只需添加All-in-One引物并开始。All-in-One qPCR人鼠或鼠特异性引物由专利算法设计并验证†精确性能。引物验证包括熔化曲线，以确保扩增正确的目标DNA（图2）。
与All-in-One SYBR结合使用时®Green qPCR Mix，All-in-One引物在定量PCR分析中提供可靠且可重复的高性能。
图3。实验验证了45对基因特异性All-in-One™qPCR引物，以产生单个解离曲线峰，并为目标基因生成正确大小的单次扩增。cDNA池包含来自10种不同人类组织（肺、肝、睾丸、卵巢、脾、脑、胎盘、胰腺、心脏和乳腺）的总RNA的逆转录产物，用作qPCR验证模板。qPCR使用0.2µM引物和2X All-in-One qPCR Mix进行。反应在95℃下培养10分钟，然后在95℃条件下40次循环10秒。；使用Bio-Read iQ5仪器，60°C，20秒和72°C，15秒。在最后一个循环结束时，温度从72℃升高到95℃，以形成熔化曲线。10个样品的扩增曲线、熔化曲线和琼脂糖凝胶电泳（奇数道阳性和偶数道无模板对照（NTC）的验证结果）。
*当全合一验证的PCR引物和PCR混合物一起使用时，可确保非特异性扩增和缺乏引物二聚体。†针对人类、小鼠和大鼠自动验证引物。询问其他物种的验证。
常见问题解答
常见问题：qPCR阵列和试剂
答案：有了这些阵列，你就不需要花时间设计引物和验证基因和miRNAs。这些阵列允许您在同一个96孔或384孔板中同时对基因或miRNA进行批量qPCR检测。这大大简化和加速了你的实验。
答案：家政基因通常被用作参考基因，但它们的表达并不固定。特定管家基因的表达变化取决于实验条件。最好的方法是选择一系列常见的家政基因，分析它们在不同条件下的表达水平，然后选择一个稳定表达的基因。
答案：您选择使用哪种RT引物在很大程度上取决于实验设计。如果你使用随机引物，逆转录将在RNA中的许多不同位置开始。如果你使用寡核苷酸（dT），逆转录会在poly-A尾部开始。在特定基因的定量RT-PCR检测中，我们建议在一个反应中同时使用随机引物和寡核苷酸（dT），以获得更高的反转录效率。此外，您可以使用自己的序列特异性引物在一步RT-PCR反应中启动逆转录。
答案：这些产品中使用的DNA聚合酶是一种特殊的化学修饰热启动酶。在95℃下培养10分钟可激活酶。
答案：该试剂盒仅检测成熟miRNA的表达。
答案：miRNA qPCR扩增产物约为75bp。产品的熔化温度一般在75℃至83℃之间。
答案：大多数GeneCopoeia All-in-One™miRNA引物设计用于识别模板序列的3'末端。matrue miRNA和pre-miRNA在碱基序列的3'端具有不同的序列。因此，GeneCopoeia All-in-One™miRNA引物不会扩增前miRNA。
答案：实验过程包括两个主要步骤（图1）。第一步，使用polyA聚合酶将polyA尾部添加到miRNA的3'端。同时，MMLV逆转录酶使用独特的寡核苷酸（dT）适配器引物，从polyA末端逆转录miRNA。第二步，使用miRNA特异性正向引物和通用适配器引物作为PCR引物对，以及含有SYBR®Green的qPCR主混合物，特异性检测逆转录的miRNA。
图1。GeneCopoeia All-in-One™miRNA qRT-PCR检测试剂盒使用的实验设计
答案：cDNA池包含10个人类组织总RNA样本的逆转录产物，用作验证模板。使用0.2 uM引物和GeneCopoeia All-in-One™qPCR Mix进行qPCR。经验证，GeneCopoeia All-in-One™qPCR引物（或GeneCocoeia All-in-One™miRNA qPCR引子）可为靶基因和miRNA生成正确大小的单个扩增子，并产生单个解离曲线峰值。
答案：与GeneCopoire All-In-One™miRNA引物相结合，GeneCopoire All-In-One™miRNA-qRT-PCR检测试剂盒可以从低至10pg的小RNA或20pg的总RNA中检测miRNA。
答案：PolyA聚合酶将poly-A尾部添加到所有miRNAs的3'端，可以在同一试管中逆转录到第一链cDNA。所得产物可用于通过qPCR检测任何所需miRNA的表达。相比之下，干环被设计成只检测一个或几个特定的miRNAs，其3'末端碱基与其粘性末端配对。因此，要检测这种miRNAs，必须选择一个匹配的干环。可能需要同时进行多个RT反应。
答案：总RNA比小RNA具有更多类型的RNA，因此在qRT-PCR检测分析中提供了更多的模板来扩增。这有助于提高扩增敏感性，但也可能降低扩增特异性。
答案：“RT”井包含反转录控制中的一个尖峰，可用于监测反转录反应的效率。RT孔中预先加载的引物对专门放大从样本中外源RNA尖峰逆转录的对照cDNA模板。“PCR”井是一个阳性PCR对照，用于通过使用特定的预载引物对扩增预载DNA模板来验证PCR效率。如果RNA样品质量高，循环程序已正确运行，阈值已正确定义，“RT”井的Ct值应为20±3，“PCR”井的所有阵列或样品的Ct应为20。
答案：每个GeneCopoeia ExProfile™基因qPCR阵列中的“GDC”孔是基因组DNA控制。这用于检测每次qPCR反应期间每个样本中是否存在任何基因组DNA污染。基因组DNA控制的Ct值低于35表示存在可检测到的基因组DNA污染。确保从RNA样本中去除尽可能多的基因组DNA和残留污染物。
