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。2017年7月27日；170（3）：548-563.e16。
doi:10.1016/j.cell.2017.07.008。

核梭杆菌通过调节自噬促进大肠癌化疗耐受

TaChung Yu公司 1, 郭芳芳 1, 余延安（Yanan Yu） 1, 天天向上 1, 马丹 1, 韩季萱 1, 云倩 1, 伊洛娜·克里切克 2, 孙丹凤 三, 尼沙·纳加舍特 2, 陈颖萱 4, 陈浩燕 5, 杰红 6, 邹卫平 7, 靖远坊 8
附属公司

核梭杆菌通过调节自噬促进大肠癌化疗耐受

TaChung Yu公司等。 单元格。 。

摘要

肠道微生物群与慢性炎症和致癌有关。化疗失败是结直肠癌患者复发和预后不良的主要原因。在此，我们研究了肠道微生物群对结直肠癌患者化疗耐药性的影响。我们发现，化疗后复发患者的结直肠癌组织中富含核梭杆菌，并且与患者的临床病理特征相关。此外，我们的生物信息学和功能研究表明，有核F.nucleatum促进了结直肠癌对化疗的耐药性。从机制上讲，核F.nucleatum靶向TLR4和MYD88天然免疫信号和特异性microRNA，以激活自噬途径并改变结直肠癌化疗反应。因此，核F.nucleatum调控Toll样受体、microRNAs和自噬的分子网络，从而在临床、生物学和机械上控制结直肠癌化疗耐药性。测量和靶向核纤颤菌及其相关途径将为临床管理提供有价值的见解，并可能改善结直肠癌患者的预后。

关键词：大肠癌；核盘菌；Toll样受体；自噬；耐药；miRNA；重复发生。

PubMed免责声明

数字

图1
图1。有核F与癌症复发和患者预后相关
（A） 通过16S rDNA测序对复发（16）与无复发（15）的CRC患者的数据进行枝状图表示。有复发（红色）和无复发（蓝色）的患者中Taxa富集。每个点的亮度与其效果大小成正比。（B） 线性判别分析（LDA）与效应大小测量相结合，确定了A类中数据的显著丰富性。富含复发（红色）和非复发（蓝色）患者的Taxa分别表示LDA得分为阴性（红色）或阳性（蓝色）。仅显示大于LDA阈值3.5的分类群。（C） 金额的统计分析有核F在队列2中，非参数Mann-Whitney检验。（D） 比较低剂量组和高剂量组患者的无复发生存率（RFS）有核F在队列2中，对数秩检验。（E） 接收器工作特性（ROC）分析基于有核F结直肠癌中的AJCC。（F） 在队列2中进行了单变量分析。条形图对应95%置信区间。（G） 在队列2中进行了多变量分析。条形图对应95%置信区间。（H） 统计分析基于有核F以及队列3中的复发率有核F定义见第2组，齐方检验。（一） 比较低丰度和高丰度的患者的RFS有核F173例结直肠癌患者（队列3）中有核F在队列2，对数秩检验中定义。另请参见图S1。
图2
图2。有核F促进癌症自噬激活
（A） ssGSEA分析表明有核FCRC组织中的自噬相关通路。在HCT116细胞（B）和HT29细胞（C）中进行实时PCR有核F非参数Mann–Whitney检验。（D） Western blot检测HCT116细胞与有核F,大肠杆菌、粪大肠杆菌或脆弱拟杆菌在HCT116细胞与有核F在CQ存在下，稳定表达mRFP-EGFP-LC3融合蛋白的HCT116细胞（F）和HT29细胞（G）与有核F共聚焦显微镜分析显示（2000倍放大）。标尺，5μm。（H） 用透射电镜（17500倍放大）观察培养的HCT116细胞（左）和HT29细胞（右）中的自噬体有核F.标尺，1μm。（I和J）进行统计分析，计算透射电镜、非参数Mann-Whitney检验显示的HCT116细胞（I）和HT29细胞（J）中的自噬体数量。另请参见图S2。
图3
图3。有核F通过激活自噬途径诱导大肠癌细胞化疗耐受
流式细胞术检测HCT116细胞（A，B）和HT29细胞（C，D）的凋亡。细胞与有核F或用CQ、不同浓度的奥沙利铂（A和C）和5-FU（B、D）治疗。非参数Mann-Whitney检验。（E和F）裂解半胱天冬酶和对-H（H）2western blot检测AX在HCT116细胞（E）和HT29细胞（F）中的表达。这些细胞与有核F或用CQ、不同浓度的奥沙利铂和5-FU治疗。流式细胞术检测HCT116细胞（G）和HT29细胞（H）的（G和H）凋亡。用ULK1和ATG7 siRNA转染细胞，然后与有核F以及不同浓度的奥沙利铂，非参数Mann-Whitney检验。另请参见图S3。
图4
图4。有核F通过下调miR-18a*和miR-4802激活癌症自噬
（A） 人类体内miR-18a*（左）和miR-4802（右）的预测结合序列ULK1系列和自动液位计7分别为3′UTR。种子序列将高亮显示。（B） 检测转染miR-18a*模拟物或对照miRNA的HCT116细胞的荧光素酶活性ULK1系列采用3′UTR。荧光素酶活性根据对照miRNA转染进行标准化。不另作说明，不重要。（C） 在转染miR-4802模拟物或对照miRNA的HCT116细胞中检测荧光素酶活性自动液位计7采用3′UTR。（D） 在HCT116细胞中进行实时PCR以检测ULK1系列基因转染miR-18a*模拟物或抑制剂后，进行非参数Mann-Whitney试验。（E） 在HCT116细胞中进行实时PCR以检测自动液位计7基因转染miR-4802模拟物或抑制剂后，进行非参数Mann-Whitney试验。分别用miR-18a*（F）和miR-4802（G）的模拟物或抑制剂转染（F和G）HCT116细胞。与培养后有核Fwestern blot检测HCT116细胞自噬和靶蛋白。（H） 用miR-18a*和miR-4802模拟物转染稳定表达mRFP-EGFP-LC3融合蛋白的HCT116细胞。与培养后有核F共聚焦显微镜（2000倍放大）下观察HCT116细胞的自噬体。标尺，5μm。（一） 通过透射电镜（17500倍放大）观察转染miR-18a*（左）和miR-4802（右）模拟物的HCT116细胞中的自噬体，然后与有核植物F.nucleatum。比例尺，1μm。另请参见图S4。
图5
图5。miR-18a*和miR-4802调节有核F-介导的耐化学性
流式细胞术检测HCT116细胞凋亡。用miR-18a*和miR-4802的模拟物（A，B）或抑制剂（C，D）转染HCT116细胞，与有核F，并用不同浓度的奥沙利铂（A，C）和5-FU（B，D）治疗。非参数Mann-Whitney检验。（E） 对HCT116细胞进行Western blot。HCT116细胞转染miR-18a*和miR-4802的模拟物或抑制剂，与有核F，并用不同浓度的奥沙利铂（左）和5-FU（右）治疗。（F） 不同条件下小鼠肿瘤的代表性数据。图5（F）和图S5G共享实验对照。（G和H）不同组肿瘤重量（G）和体积（H）的统计分析，n=8/组非参数Mann-Whitney检验。（一） TUNEL分析检测异种移植瘤组织中的肿瘤细胞凋亡。这些小鼠接受了不同的治疗。（J） 透射电镜显示异种移植瘤组织中的自噬体。小鼠接受不同的处理（17500倍放大）。标尺，1μm。（K） 自噬体的统计分析。采用非参数Mann-Whitney试验，通过透射电镜在异种移植瘤组织中检测到自噬体。另请参见图S5-6。
图6
图6。TLR4和MYD88途径涉及有核F-介导的耐化学性
（A–D）实时PCR检测自动液位计7（A） ，ULK1系列（B） HCT116细胞中miR-18a*（C）和miR-4802（D）的表达。HCT116细胞与有核F并分别转染TLR4和MYD88 siRNA。（E和F）通过流式细胞术检测HCT116细胞的凋亡。这些细胞与有核FTLR4和MYD88 siRNA转染后，随后用不同浓度的奥沙利铂（E）或5-FU（F）处理，非参数Mann-Whitney检验。（G–J）实时PCR检测自动液位计7（G） ，ULK1系列（H） HT29细胞中miR-18a*（I）和miR-4802（J）的表达。HT29细胞与有核F并分别转染TLR4和MYD88 siRNA。流式细胞术检测HT29细胞（K和L）凋亡。细胞与有核FTLR4和MYD88 siRNA转染后，随后用不同浓度的奥沙利铂（K）或5-FU（L）处理，非参数Mann-Whitney检验。（M） 不同组HCT116细胞裸鼠肿瘤代表性数据。图6M和图S6A共享实验控制。（N和O）不同组小鼠肿瘤重量（N）和体积（O）的统计分析，N=8/组，非参数Mann-Whitney检验。另请参见图S7。
图7
图7。的级别核粒梭菌、miR-18a*、miR-4802和自噬成分与CRC患者相关
（A） 代表性免疫组织化学对-无复发和复发患者CRC组织中的ULK1（上部）、ULK1和ATG7（下部）蛋白（队列2）。NR，非复发；R、 重复发生。（B） 队列2中pULK1（上部）、ULK1和ATG7（下部）蛋白的Remmele和Stegner（IRS）免疫组化免疫反应评分的统计分析。NR，非复发；R、 重复发生。（C） 通过实时PCR对队列2中miR-18a*（左）和miR-4802（右）表达进行统计分析。NR，非复发；R、 重复发生。（D） 之间的相关性有核F人类结直肠癌组织中miR-18a*、miR-4802、ULK1和ATG7水平（队列2）。（E） 三者关系示意图核F，自噬和化学抗性。
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