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单元格。作者手稿；PMC 2018年1月13日发布。
以最终编辑形式发布为：
单元格。2017年7月27日；170（3）：548–563.e16。
数字对象标识：2016年10月10日/j.cell.2017.07.008
PMCID公司：项目编号：5767127
美国国立卫生研究院：美国国家卫生研究院930192
采购管理信息：28753429

核梭杆菌通过调节自噬促进大肠癌的化疗耐受性

TaChung Yu（TaChung Yu）,1,三 郭芳芳,1,三 余延安（Yanan Yu）,1 天天向上,1 丹·马,1 韩季萱,1 云茜,1 伊洛娜·克里切克,2 孙丹凤,1,2 尼沙·纳加舍特,2 陈颖萱,1,* 陈浩燕,1,* 洁红,1,* 邹卫平,2,4,*和靖远坊1,*
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

总结

肠道微生物群与慢性炎症和致癌作用有关。化疗失败是大肠癌患者复发和预后不良的主要原因。在此，我们研究了肠道微生物群对结直肠癌患者化疗耐药性的影响。我们发现了梭杆菌属(F、。)有核植物在化疗后复发的结直肠癌组织中大量存在，并与患者的临床病理特征有关。此外，我们的生物信息学和功能研究表明有核F提高了结直肠癌对化疗的耐药性。在机械方面，有核F靶向TLR4和MYD88天然免疫信号和特异性microRNA激活自噬途径并改变结直肠癌化疗反应。因此，有核F协调Toll样受体、micro-RNA和自噬的分子网络，以临床、生物学和机械控制结直肠癌化疗耐药性。测量和瞄准有核F其相关途径将为临床管理提供有价值的见解，并可能改善结直肠癌患者的预后。

简言之

减少结直肠癌患者的特定肠道微生物可能会提高他们对化疗的反应并减少癌症复发。

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简介

结直肠癌（CRC）是全球第三大常见癌症，也是导致癌症相关死亡的第二大原因(卡特赖特，2012年;Siegel等人，2013年). 对于晚期CRC患者，化疗的目的是缩小肿瘤大小，减少肿瘤生长，并抑制肿瘤转移。一般来说，活性细胞毒性药物，包括5-氟尿嘧啶（5-FU）和卡培他滨，在DNA复制过程中抑制胸苷酸合成酶的酶活性(Walko和Lindley，2005年). 另一种化疗药物奥沙利铂通过共价结合DNA并形成铂-DNA加合物抑制肿瘤细胞生长并导致细胞G2期阻滞(Kelland，2007年). 这些化疗药物的组合广泛应用于慢性肾衰的治疗(卡特赖特，2012年). 大多数晚期CRC患者最初对联合化疗有反应。然而，患者最终由于耐药性而经历肿瘤复发，晚期CRC患者的5年生存率低于10%(Dahan等人，2009年). 不幸的是，结肠癌患者通常对新型免疫检查点治疗没有反应(Zou等人，2016). 因此，阐明CRC患者化疗耐药的机制至关重要。

癌症化疗耐药性是基因调控与环境之间复杂相互作用的结果。微生物群通过影响肠道炎症与CRC的发生和发展相关(Arthur等人，2012年;Garrett，2015年;Man等人，2015年;Zitvogel等人，2015年)和肿瘤相关信号通路(施瓦布和乔宾，2013年). 最近的小鼠研究表明，肠道微生物群可能调节局部免疫反应，进而影响化疗(Iida等人，2013年;Viaud等人，2013年)和免疫治疗(Sivan等人，2015年;Vétizou等人，2015年). 人类肠道微生物群与炎症细胞因子的产生有关(Schirmer等人，2016年). 最近有两组研究表明有核F在结直肠癌发生过程中从正常组织逐渐增加到腺瘤组织和腺癌组织(Castellarin等人，2012年;Kostic等人，2012年). 此外有核F在CRC组织中，生存期较短(Mima等人，2016年).有核F粘附素FadA可能与E-钙粘蛋白结合并促进结直肠癌的发生(Rubinstein等人，2013年). 此外，有核F凝集素Fap2可能识别宿主Gal-GalNAc并帮助这种细菌在结肠癌上皮细胞中大量定位(Abed等人，2016年). 然而有核F人类文献中没有对化疗进行研究。在这里，我们测试了是否以及如何有核FCRC患者受影响的化疗。我们发现有核F与化疗后无复发的CRC患者相比，化疗后复发CRC患者的发病率增加。我们已经证明了这一点有核F通过miR-18a*和miR-4802的选择性靶点缺失和自噬途径的激活，在介导CRC对小药物化疗的化学耐药性中发挥关键作用。

结果

有核F与结直肠癌复发和患者预后相关

为了研究肠道菌群变化与CRC复发之间的潜在关系，我们重新分析了我们之前的数据(Yu等人，2015年)并通过使用Roche 454 GS FLX在来自复发患者的16个CRC组织和未复发的15个CRC组织中比较热测序数据（队列1，图1A,表S1). 我们使用LEfSe算法(Segata等人，2011年)确定队列1中复发性和非复发性CRC患者的潜在差异菌型。我们发现了梭杆菌属,无气孢子杆菌,假单胞菌属,消化链球菌,和普雷沃特拉与非复发性结直肠癌组织相比，复发性结肠癌组织富集(图1B).无气孢子杆菌很少与人类疾病相关(Jeong等人，2007年). 我们进一步研究核梭杆菌,中间普氏菌,微小假单胞菌,厌氧消化链球菌实时PCR显示有核F在复发性CRC患者的四种细菌中，是最富集的细菌(图S1A)与无复发的患者相比。这表明有核F可能在CRC复发中起作用。有核F是CRC中最主要的藻型(Kostic等人，2012年). 我们量化了有核F在来自无复发患者的48个CRC组织（组1）和来自复发患者的44个CRC组织（组2）中（队列2，表S2). 与我们在队列1和以前报告中的数据一致(Castellarin等人，2012年;Kostic等人，2012年)，金额F.有核复发患者的CRC组织中，复发患者高于非复发患者(图1C). 此外，还丰富了有核F复发组和非复发组CRC组织与邻近正常组织的比较(图1C). CRC复发归因于化疗耐药性。因此，有核F与CRC复发相关。大量有核F可能会促进CRC化疗耐药性。

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有核F与癌症复发和患者预后相关

（A） 通过16S rDNA测序对复发（16）与无复发（15）的CRC患者的数据进行枝状图表示。有复发（红色）和无复发（蓝色）的患者中Taxa富集。每个点的亮度与其效果大小成正比。

（B） 线性判别分析（LDA）与效应大小测量相结合，确定了A类中数据的显著丰富性。富含复发（红色）和非复发（蓝色）患者的Taxa分别表示LDA得分为阴性（红色）或阳性（蓝色）。仅显示大于LDA阈值3.5的分类群。

（C） 金额的统计分析有核F在队列2中，非参数Mann-Whitney检验。

（D） 比较低剂量组和高剂量组患者的无复发生存率（RFS）有核F在队列2中，对数秩检验。

（E） 接收器工作特性（ROC）分析基于有核F结直肠癌中的AJCC。

（F） 在队列2中进行了单变量分析。条形图对应95%置信区间。

（G） 在队列2中进行了多变量分析。条形图对应95%置信区间。

（H） 统计分析基于F.有核组3的复发率有核F定义见第2组，齐方检验。

（一） 比较低丰度和高丰度的患者的RFSF.有核173例结直肠癌患者（队列3）中有核F在队列2，对数秩检验中定义。

另请参见图S1.

接下来，我们评估了F.有核以及队列2中不同的临床病理特征。金额有核F与美国癌症联合委员会（AJCC）的分期和肿瘤大小呈正相关(图S1B). 大量有核F与较短的无复发生存期（RFS）密切相关(图1D). 五年复发生存期在有核F-高分组比有核F-低水平组。进行受试者操作特征（ROC）曲线分析，以预测潜在的CRC复发，使用AJCC分期或有核F(图1E,表S3). 我们观察到有核F-基于基础的预测高于基于AJCC阶段的模型（0.776对0.646，p=0.039）。使用Youden指数确定最佳截止点，并根据丰度选择−10.3[−δCT值]有核F在预测CRC复发的敏感性和特异性之间提供了最佳平衡(表S3). 此外，单变量(图1F)和多元(图1G)队列2的回归分析表明有核F是CRC侵袭性的独立预测因子，具有预测临床结果的显著危险比。其预测值与AJCC期相当。因此，队列2中的数据不仅证实了我们在队列1中的观察结果，还定义了有核F在预测CRC复发方面。

进一步验证是否有核F我们分析了另外一组173名患者（队列3，表S4). 根据以下临界值（−10.3[−δCT值]），将队列3中的样本分为高风险和低风险子集F.有核丰度来源于队列2(表S3). 我们发现高风险组的复发率显著高于低风险组（73.4%对30.9%，p=2.436e-8）(图1H). 同样F.有核队列3中复发患者高于非复发患者(图S1C). 我们确认有核F与较短的RFS相关(图1I). 单变量(图S1D)和多元(图S1E)队列3中的Cox回归分析表明有核F是CRC攻击性的独立预测因子。我们的数据表明有核F在病理和临床上与癌症复发和患者预后相关。

有核F促进癌症自噬激活

我们假设有核F在生物学上参与了结肠癌化疗耐药性的发展。为了验证这个假设，我们将结肠癌细胞与有核F进行了RNA-seq分析，并比较了联合培养或不联合培养的结肠癌细胞的基因表达谱有核F.与有核FHT29细胞中下调992个基因表达，上调1466个基因表达（调整后的p值<0.05，通过GEO获取的原始数据：GSE90944标准)(表S5). 单样本基因集富集分析（ssGSEA）显示，在与有核F(图2A). 鉴于自噬途径在细胞生存中的作用(Song等人，2009年)，我们的数据表明F.有核可能导致自噬途径激活，并可能支持癌症的化疗耐药性。与此一致，western blot分析显示有核F增加HCT116细胞和HT29细胞中多种自噬信号元件的表达，包括pAMPK、pULK1、ULK1和ATG7。这些细胞在基础条件下表现出低LC3蛋白切割水平(图S2A和S2B). 实时PCR证实有核F影响了ULK1型和自动液位计7mRNA水平(图2B和2C). 这些数据表明有核F可能驱动CRC细胞中的自噬激活。为了检验这种可能性，我们对与细胞共培养的CRC细胞进行了自噬功能测定有核F。在有核F-共培养HCT116细胞(图2D)和HT29电池(图S2C)以集中相关的方式(图S2D). 这些作用在与联合培养的CRC细胞中没有发现中间P.intermedia,P.米卡拉,厌氧P,大肠杆菌,粪肠球菌，或脆弱拟杆菌(图2D,图S2C、S2E和S2F). 此外，我们处理HCT116细胞(图2E)和HT29电池(图S2G)氯喹（CQ），一种自噬溶酶体抑制剂。添加CQ可阻断细胞自噬通量F.有核-培养细胞(图2E). 我们建立了稳定表达串联mRFP-EGFP-LC3结构的HCT116细胞和HT29细胞。我们发现了有核F在HCT116细胞中诱导自噬流量(图2F)和HT29电池(图2G). 此外，在HCT116细胞和HT29细胞联合培养或不联合培养中评估自噬体有核F(图2H). 透射电子显微镜显示自噬囊泡的形成增加有核F-共培养HCT116细胞(图2I)和HT29电池(图2J). 总体而言，我们的数据表明有核F激活CRC细胞的自噬途径。

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有核F促进癌症自噬激活

（A） ssGSEA分析表明有核FCRC组织中的自噬相关通路。

在HCT116细胞（B）和HT29细胞（C）中进行实时PCR有核F非参数Mann–Whitney检验。

（D） Western blot检测HCT116细胞与有核F,大肠杆菌、粪大肠杆菌或脆弱拟杆菌.

（E） 在HCT116细胞与有核F在CQ在场的情况下。

稳定表达mRFP-EGFP-LC3融合蛋白的（F和G）HCT116细胞（F）和HT29细胞（G）与有核F显示了共聚焦显微镜分析（2000倍放大）。标尺，5μm。

（H） 用透射电镜（17500倍放大）观察培养的HCT116细胞（左）和HT29细胞（右）中的自噬体有核F.标尺，1μm。

（I和J）进行统计分析，以计算透射电子显微镜、非参数Mann-Whitney检验显示的HCT116细胞（I）和HT29细胞（J）中自噬体的数量。

另请参见图S2.

有核F通过自噬途径诱导肿瘤化疗耐受

接下来我们假设有核F通过自噬途径诱导癌症化疗耐药性。初步确定是否有核F诱导癌症化疗耐药性，不同的感染多重性（MOI）有核F用于与CRC细胞的共培养。我们观察到有核F（MOI=100）对HCT116细胞和HT29细胞增殖无影响(图S3A和S3B). 我们研究了这种剂量的有核FCRC化疗耐药。如预期，奥沙利铂(图3A)和5-FU(图3B)诱导HCT116细胞凋亡。与合作有核F，但不包括中间P.intermedia,P.米卡拉,厌氧P、和介质控制(图S3C–S3F)，减少这些化疗药物诱导的HCT116细胞凋亡。此外，有核F阿霉素对HCT116细胞和HT29细胞无保护作用(图S3G和S3H). 数据表明有核Finu降低CRC对奥沙利铂和5-FU的耐药性。

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有核F通过激活自噬途径诱导结直肠癌细胞的化疗耐药性

流式细胞术检测HCT116细胞（A，B）和HT29细胞（C，D）的凋亡。这些细胞与有核F或用CQ、不同浓度的奥沙利铂（A和C）和5-FU（B、D）治疗。非参数Mann-Whitney检验。

（E和F）裂解半胱天冬酶和第页-小时2western blot检测AX在HCT116细胞（E）和HT29细胞（F）中的表达。这些细胞与有核F或用CQ、不同浓度的奥沙利铂和5-FU治疗。

流式细胞术检测HCT116细胞（G）和HT29细胞（H）的（G和H）凋亡。用ULK1和ATG7 siRNA转染细胞，然后与有核F以及不同浓度的奥沙利铂，非参数Mann-Whitney检验。

另请参见图S3.

SW480细胞对奥沙利铂治疗相对敏感(Moutinho等人，2014年). 定量评估有核F在奥沙利铂诱导的SW480细胞化疗耐药中，我们通过持续暴露于逐渐增加的奥沙利汀浓度，从亲代SW480的细胞中生成了奥沙利丁耐药的细胞SW480。我们比较了亲代SW480细胞、Oxaliptin耐药SW480和有核F-不同浓度奥沙利铂对亲代SW480细胞共培养的影响(图S3I和S3J). 我们发现109.9μM奥沙利铂导致亲代SW480细胞、奥沙利汀耐药的SW480电池和有核F-共同培养的亲代SW480细胞(图S3I). 考虑到奥沙利铂耐药的SW480细胞和核粒梭菌-培养的亲代SW480细胞对奥沙利铂治疗同样具有耐药性，数据表明有核F有效地对亲本SW480细胞产生化学耐药性。为了进一步支持这种可能性，欧盟委员会50对于亲代SW480细胞、对奥沙利铂耐药的SW480电池和有核F.nucleatum-分别培养亲代SW480细胞(图S3J). 此外，我们将亲代SW480细胞接种到裸鼠中，并用不同剂量的奥沙利铂（含或不含）处理小鼠有核植物F.nucleatum。有核F单独使用对肿瘤生长没有影响(图S3K和S3L). 正如预期的那样，低剂量和高剂量的奥沙利铂都能显著抑制肿瘤生长，这些作用通过有核F(图S3M和S3N). 数据表明有核F赋予几个CRC细胞强大的化学耐药性。

要解决以下问题：有核F通过自噬途径调节CRC化疗耐药性，我们将HCT116细胞和HT29细胞与有核F并在CQ存在下用奥沙利铂和5-FU处理这些细胞。我们发现有核F-CQ对HCT116细胞的诱导耐药作用被消除(图3A和3B)和HT29电池(图3C和3D). 此外，western blotting显示，奥沙利铂和5-FU诱导caspase 9、caspase 3、caspase6、caspase-7、PARP和p-H2AX的裂解，这些作用被阻断有核FHCT116细胞的共培养(图3E)和HT29电池(图3F). 因此，有核F可能通过自噬途径阻止化疗诱导的CRC细胞凋亡。

检查ULK1和ATG7等自噬元件是否参与有核F-我们分析了ULK1和ATG7 siRNA-转染的CRC细胞中LC3的切割状态有核F如预期，ULK1和ATG7 siRNA降低了CRC细胞中这两个基因的表达(图S3O和S3P).有核F共同培养增加了野生型ULK1和ATG7表达的CRC细胞中LC3、ULK1及ATG7的表达。ULK1和ATG7 siRNA被阻断有核F-诱导的LC3裂解(图S3Q和S3R). 数据表明有核F可能通过增加ULK1和ATG7的表达诱导自噬激活。接下来，我们用化疗药物治疗CRC细胞。我们发现了有核F奥沙利铂降低CRC细胞凋亡(图3G和3H)和5-FU治疗(图S3S和S3T). 在ULK1或ATG7-siRNA转染的细胞中，这种作用被消除(图3G和3H;图S3S和S3T). 因此，数据强烈表明有核F可能通过激活自噬途径促进CRC化疗耐药性，自噬元件ULK1和ATG7参与有核F-CRC细胞中介导的化疗耐药性。

有核F通过选择性丢失miR-18a*和miR-4802激活癌症自噬

探索其机制有核F诱导pULK1、ULK1和ATG7在mRNA和蛋白质水平上调，我们构建了重组荧光素酶报告质粒pGL3-ULK1p和pGL3-ATG7p，其中包含启动子区ULK1型或自动液位计7荧光素酶分析显示有核F共培养对CRC细胞中pGL3-ULK1p和pGL3-ATG7p的转录活性没有影响(图S4A和S4B). 这表明有核F-增加ULK1型或自动液位计7mRNA不依赖于ULK1型或自动液位计7发起人。

MiRNAs通常通过与RISC复合体结合并指导靶mRNA的序列特异性切割或抑制靶mRNA翻译来调节基因表达(巴特尔，2009年;Krek等人，2005年). 我们假设失调的miRNAs可能有助于有核F-ULK1和ATG7表达增加。为了验证这一假设，我们对CRC组织进行了全球miRNA表达谱分析有核F来自6名复发患者，以及CRC组织中有核F来自6名非复发患者（队列1，图S4C，左）。CRC组织中有68个miRNAs显著下调有核F相比之下有核F(图S4C，右；表S6). 接下来，我们使用FindTar3(网址：http://bio.sz.tsinghua.edu.cn/)和miRDB数据库(http://mirdb.org/mirdb/)确定可能调节ULK1和ATG7的潜在miRNAs。在将这些潜在的ULK1和ATG7调节性miRNA与已鉴定的68个下调的miRNA重叠后，我们发现了4个和3个miRNA，它们可能分别调节ULK1与ATG7(图S4C，右侧）。我们用实时PCR验证了这七个miRNAs。我们发现miR-4802和miR-18a*是对有核FHCT116细胞的干预(图S4D)和HT29电池(图S4E). 靶点预测程序和排序算法建议了miR-18a*和miR-4802在3′UTR区域内的种子区域的潜在特异靶点ULK1和ATG7基因，分别(图4A). 荧光素酶报告物分析表明miR-18a*和miR-4802抑制HCT116细胞中的荧光素酶活性(图4B-4C)和HT29电池(图S4F和S4G)转染野生型ULK1型和自动液位计7报告质粒，但与突变报告质粒无关。实时PCR显示miR-18a*和miR-4802减少ULK1型和自动液位计7mRNA水平和ULK1型和自动液位计7被HCT116细胞中的miR-18a*和miR-4802抑制剂拯救(图4D和4E)和HT29电池(图S4H和S4I). 此外，western blotting显示miR-18a*或miR-4802的过度表达抑制了有核F-诱导LC3-I转化为LC3-II，同时增加HCT116细胞中p62蛋白的表达(图4F和4G)和HT29电池(图S4J和S4K). 在miR-18a*和miR-4802过度表达的HCT116细胞中，自噬体的积累减少(图4H和4I)和HT29电池(图S4L和S4M)与…共同培养有核F与控件相比。因此，数据表明有核F通过选择性丢失miR-18a*和miR-4802激活癌症自噬。

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有核F通过下调miR-18a*和miR-4802激活癌症自噬

（A） 人类体内miR-18a*（左）和miR-4802（右）的预测结合序列ULK1型和自动液位计7分别为3′UTR。种子序列将高亮显示。

（B） 检测转染miR-18a*模拟物或对照miRNA的HCT116细胞的荧光素酶活性ULK1型采用3′UTR。荧光素酶活性根据对照miRNA转染进行标准化。不另作说明，不重要。

（C） 在转染miR-4802模拟物或对照miRNA的HCT116细胞中检测荧光素酶活性自动液位计7采用3′UTR。

（D） 在HCT116细胞中进行实时PCR以检测ULK1型基因转染miR-18a*模拟物或抑制剂后，进行非参数Mann-Whitney试验。

（E） 在HCT116细胞中进行实时PCR以检测自动液位计7用miR-4802模拟物或抑制剂转染后的基因，非参数Mann-Whitney检验。

分别用miR-18a*（F）和miR-4802（G）的模拟物或抑制剂转染（F和G）HCT116细胞。与培养后有核Fwestern blot检测HCT116细胞自噬和靶蛋白。

（H） 用miR-18a*和miR-4802模拟物转染稳定表达mRFP-EGFP-LC3融合蛋白的HCT116细胞。与培养后有核F共聚焦显微镜（2000倍放大）下观察HCT116细胞的自噬体。标尺，5μm。

（I） 通过透射电子显微镜（17500倍放大）在用miR-18a*（左）和miR-4802（右）模拟物转染的HCT116细胞中观察自噬体，然后与有核植物F.nucleatum。标尺，1μm。

另请参见图S4.

MiR-18a*和MiR-4802调节有核F-介导的耐化学性

miR-18a*和miR-4802表达的选择性缺失有核F-培养细胞系使我们假设miR-18a*和miR-4802可能调节有核F-介导的化疗耐药性。为了验证这一假设，将miR-18a*和miR-4802模拟物或抑制剂转染到与有核F这些microRNA模拟物和抑制剂对CRC增殖没有影响(图S5A). 然而，miR-18a*和miR-4802模拟增加了奥沙利铂和5-FU诱导的HCT116细胞凋亡(图5A和5B)和HT29电池(图S5B和S5C)培养有有核F与对照组相比。与这些数据一致，一项功能丧失研究表明，抗miR-18a*和抗miR-4802增加了HCT116细胞的化疗耐药性(图5C和5D)和HT29电池(图S5D和S5E)培养有有核F蛋白质印迹显示有核FmiR-18a*和miR-4802模拟物转染HCT116细胞后，化疗诱导的caspase和PARP裂解以及p-H2AX被阻断(图5E)和HT29电池(图S5F).

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miR-18a*和miR-4802调节有核F-介导的耐化学性

流式细胞术检测HCT116细胞凋亡。用miR-18a*和miR-4802的模拟物（A，B）或抑制剂（C，D）转染HCT116细胞，与有核F，并用不同浓度的奥沙利铂（A，C）和5-FU（B，D）治疗。非参数Mann-Whitney检验。

（E） 对HCT116细胞进行Western blot。HCT116细胞转染miR-18a*和miR-4802的模拟物或抑制剂，与有核F，并用不同浓度的奥沙利铂（左）和5-FU（右）治疗。

（F） 不同条件下小鼠肿瘤的代表性数据。图5（F）和图S5G共享实验控制。

（G和H）不同组肿瘤重量（G）和体积（H）的统计分析，n=8/组非参数Mann-Whitney检验。

（一） TUNEL分析检测异种移植瘤组织中的肿瘤细胞凋亡。这些小鼠接受了不同的治疗。

（J） 透射电镜显示异种移植瘤组织中的自噬体。小鼠接受不同的处理（17500倍放大）。标尺，1μm。

（K） 自噬体的统计分析。采用非参数Mann-Whitney试验，通过透射电镜在异种移植瘤组织中检测到自噬体。

另请参见图S5-6.

在CRC异种移植小鼠模型中，将HCT116细胞和HT29细胞接种到裸鼠体内，然后用miRNAs、化疗药物、，有核F-共同文化和其他操纵。肿瘤重量没有差异(图S5G和S5H)和肿瘤生长(图S5I)在不同的对照组之间。有趣的是，奥沙利铂显著降低了肿瘤生长(图S5J–S5L)和5-FU治疗(图S5M–S5O)，这些下降被有核F体内治疗。因此，有核F参与对奥沙利铂和5-FU治疗的CRC化疗耐药。此外，F.有核-自噬途径抑制剂CQ挽救了诱导的CRC化疗耐药性(图S5J–S5O). 此外，有核F-在奥沙利铂治疗的荷瘤小鼠模型中，miR-18*和miR-4802腺病毒转导逆转了诱导的CRC化疗耐药性(图5F–5H)或5-FU(图S6A–S6C). ULK1和ATG7的过度表达阻断了miR-18a*和miR-4802介导的有核F-肿瘤组织中的刺激性化疗耐药性(图5F–5H,图S6A–S6C). 此外，western blotting证实miR-18a*和miR-4802可以拯救有核F凋亡基因的表达(图S6D)，肿瘤凋亡(图5I,图S6E)和自噬体形成(图5J和5K,图S6F和S6G)对化疗的反应。这些数据支持miR-18a*和miR-4802调节有核F-阻断介导的耐药性有核F-诱导自噬激活。

TLR4和MYD88途径涉及有核F-介导的耐化学性

TLR4和MYD88天然免疫信号通路被激活，以响应F.有核干预(Abreu和Peek，2014年;Liu等人，2007年). 与此相一致，我们发现TLR4和MYD88转录物的水平(图S7A和S7B)和蛋白质(图S7C和S7D)为响应有核FHCT116细胞和HT29 CRC细胞的治疗。检测TLR4和MYD88通路是否参与有核F-诱导自噬激活，我们用TLR4和MYD88 siRNA转染CRC细胞，并将细胞与有核FWestern blotting显示有核F-TLR4或MYD88 siRNA转染的CRC细胞介导的自噬激活减少(图S7C和S7D). TLR4或MYD88表达的敲除被阻止有核F-诱导ULK1和ATG7上调，有核F-诱导的miRNA-18a*和miRNA-4802丢失，以及有核F-HCT116细胞的诱导化疗耐药性(图6A–6F)和HT29电池(图6G–6L). 此外，有核F-在CRC异种移植小鼠模型中，通过敲低TLR4或MYD88，可以挽救诱导的CRC化疗耐药性，如肿瘤重量减轻所示(图6M和6N,图S7E和S7F)和肿瘤体积(图6O,图S7G). 数据表明有核F-诱导miRNA-18a*和miRNA-4802的丢失，有核F-激活的自噬途径，以及有核F–介导的化疗耐受依赖于TLR4和MYD88信号通路。

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TLR4和MYD88途径涉及F.有核-介导的耐化学性

（A–D）实时PCR检测自动液位计7（A） ，ULK1型（B） HCT116细胞中miR-18a*（C）和miR-4802（D）的表达。HCT116细胞与有核F并分别转染TLR4和MYD88 siRNA。

流式细胞术检测HCT116细胞（E和F）凋亡。这些细胞与有核FTLR4和MYD88 siRNA转染后，随后用不同浓度的奥沙利铂（E）或5-FU（F）处理，非参数Mann-Whitney检验。

（G–J）实时PCR检测自动液位计7（G） ，ULK1型（H） HT29细胞中miR-18a*（I）和miR-4802（J）的表达。HT29细胞与有核F并分别转染TLR4和MYD88 siRNA。

流式细胞术检测HT29细胞（K和L）凋亡。这些细胞与有核FTLR4和MYD88 siRNA转染后，随后用不同浓度的奥沙利铂（K）或5-FU（L）处理，非参数Mann-Whitney检验。

（M） 不同组HCT116细胞裸鼠肿瘤代表性数据。图6M和图S6A共享实验控制。

（N和O）不同组小鼠肿瘤重量（N）和体积（O）的统计分析，N=8/组，非参数Mann-Whitney检验。

另请参见图S7.

的级别有核F、微小RNA和自噬成分在CRC患者中的相关性和临床相关性

探讨有核F在CRC患者中，microRNAs（miR-18a*和miR-4802）和自噬成分（ULK1和ATG7），我们在队列2中研究了CRC组织和癌旁正常大肠组织。我们量化了F.有核实时PCR检测miR-18a*和miR-4802的表达，免疫组化检测pULK1、ULK1和ATG7在CRC组织和正常组织中的蛋白表达。我们发现有核F与无复发患者相比，复发患者更可能检测到p-ULK1、ULK1和ATG7的高表达，以及miR18a*和miR-4802的低表达(图7A–7C). 金额有核F在CRC组织中，与miR-18a*和miR-4802水平呈负相关，与ULK1和ATG7表达呈正相关(图7D). 数据表明有核FmiR-18a*和miR-4802的表达水平分别与自噬途径激活状态呈正相关和负相关。总之，我们认为有核F可能通过TLR4和MYD88作用于结直肠癌，导致miR-18a*和miR-4802表达的选择性缺失，随后导致自噬激活，从而提高结直肠癌患者的化疗耐药性(图7E).

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的级别核粒梭菌、miR-18a*、miR-4802和自噬成分与CRC患者相关

（A） 代表性免疫组织化学第页-无复发和复发患者CRC组织中的ULK1（上部）、ULK1和ATG7（下部）蛋白（队列2）。NR，非复发；R、 重复发生。

（B） 队列2中pULK1（上部）、ULK1和ATG7（下部）蛋白的Remmele和Stegner（IRS）免疫组化免疫反应评分的统计分析。NR，非复发；R、 重复发生。

（C） 通过实时PCR对队列2中miR-18a*（左）和miR-4802（右）表达进行统计分析。NR，非复发；R、 重复发生。

（D） 之间的相关性有核F人类结直肠癌组织中miR-18a*、miR-4802、ULK1和ATG7水平（队列2）。

（E） 三者关系示意图核F，自噬和化学抗性。

讨论

卡培他滨（和5-FU）联合以铂为基础的化疗已被广泛用于治疗不同类型的癌症，包括CRC(Kelland，2007年). 尽管CRC患者对手术减瘤和化疗的最初反应通常是有效的，但耐药癌症的复发通常会发生，患者会死于疾病(Bertotti和Sassi，2015年;Jemal等人，2009年). 不幸的是，CRC患者通常对新型免疫检查点治疗无效(邹等，2016). 常规化疗仍是CRC患者的一线治疗。因此，了解CRC的耐药机制对优化当前的治疗策略至关重要。

CRC化疗反应中的癌症遗传和表观遗传学改变已被广泛报道(巴德利和锡耶纳，2010年;Dallas等人，2009年;埃斯特勒，2008;Linardou等人，2008年;Van Geelen等人，2004年;Weichert等人，2008年). 最近的小鼠研究表明，肠道微生物群可能调节局部免疫反应，进而影响化疗(Iida等人，2013年;Viaud等人，2013年)和免疫治疗(Sivan等人，2015年;Vétizou等人，2015年). 人类研究表明，适应性免疫系统也可以调节人类卵巢癌的化疗敏感性(Wang等人，2016年). 然而，肠道微生物群在大肠癌化疗耐药性中的潜在作用尚不清楚。通过结合基因组、生物信息学、生物学、体内模型和临床研究，我们证明自噬相关通路在具有高水平自噬因子的CRC患者中得到丰富和激活有核F，还有那个有核F促进CRC化疗耐药性。

元基因组和转录组学分析表明，肠道微生物，尤其是有核F，参与CRC开发(Castellarin等人，2012年;Kostic等人，2012年).有核F附着于宿主上皮E-cadherin并通过梭杆菌粘附素FadA促进结直肠癌的发生(Rubinstein等人，2013年). 宿主多糖Gal-GalNAc与梭杆菌凝集素（Fap2）之间的相互作用促进有核FCRC组织中的富集(Abed等人，2016年). 然而，尚不清楚是否以及如何有核F可能介导CRC的化疗耐药性。我们报告有核F诱导CRC细胞中LC3-II表达、自噬通量和自噬体合成。因此，有核F刺激自噬相关蛋白pULK1、ULK1和ATG7在CRC中的表达，生物化学和基因自噬抑制提高了细胞自噬的敏感性F.有核-用5-FU和奥沙利铂处理CRC细胞。因此，我们得出结论，自噬有助于有核F-介导的CRC对奥沙利铂和5-FU方案的耐药性。我们的数据可以解释为什么CRC患者有核F结果不佳(Mima等人，2016年).

我们已经分析了其中的机制有核F调节ULK1和ATG7通路的激活。有核F不影响ULK1型和自动液位计7据报道，粘附无创性大肠杆菌（AIEC）可能通过调节miR-30C和miR-130A的表达来调节人类肠上皮细胞的自噬(Nguyen等人，2014年). 我们的生物信息学和功能研究已阐明miR-18a*和miR-4802靶点ULK1型和自动液位计7、和由于以下原因选择性丢失有核F共培养，并能在体内外生物调节CRC化疗耐药性。因此，有核F通过选择性靶向特定miRNAs和自噬元件来治疗化疗耐药性。鉴于TLR4和MYD88先天免疫信号通路对有核F感染(Abreu和Peek，2014年;Liu等人，2007年)，我们已经证明了这一点核粒梭菌-miR-18a*和miR-4802的诱导基因组丢失依赖于TLR4和MYD88信号通路。因此，有核F协调TLR4-MYD88、miR18a*和miR4802以及ULK1/ATG7自噬网络，以生物方式控制CRC化疗耐药性(图7E).

除了其生物学重要性外，我们的工作可能与CRC患者的临床管理有关。作为F.有核与CRC复发风险相关有核F术后可能是预测患者预后的有效方法。此外，我们的数据提出了一个重要的临床问题：包括卡培他滨和奥沙利铂在内的常规化疗方案是否适用于高剂量化疗的CRC患者F.有核? 另外，我们建议CRC患者有核F可以用常规化疗结合抗-有核F治疗和/或自噬抑制剂。因此，检测有核F及其相关途径，并对不同水平的有核F.

STAR公司★方法

关键资源表

试剂或资源来源标识符
抗体
抗-ACTB-HRPSigma-Aldrich公司类别号A1978
抗-LC3BSigma-Aldrich公司类别号L7543
抗P62细胞信号技术类别号8025
抗叶半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9细胞信号技术类别号9505
抗叶半胱氨酸蛋白酶3细胞信号技术分类号9664
抗叶半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶6细胞信号技术类别号9761
抗叶半胱氨酸蛋白酶7细胞信号技术分类号8438
防脱落PARP细胞信号技术分类号5625
反-第页-H2AX（139系列）细胞信号技术类别#9718
反-第页-AMPK（α）（Thr172）细胞信号技术类别号2535
抗Belin1细胞信号技术类别号3495
抗ATG5细胞信号技术类别号12994
抗-ATG12细胞信号技术货号4180
抗-ATG16L1细胞信号技术目录号8089
抗-ATG3细胞信号技术类别号3415
抗-MYD88细胞信号技术分类号3699
反-ULK1阿布卡姆类别号ab65056
反-第页-ULK1（556系列）阿布卡姆类别号ab203207
抗-ATG7阿布卡姆类别号ab52472
抗TLR4阿布卡姆类别号ab13556
生物样品
新鲜结直肠癌组织上海交通大学医学院附属仁济医院不适用
福尔马林固定石蜡包埋结直肠癌组织上海交通大学医学院附属仁济医院不适用
化学品、肽和重组蛋白质
奥沙利铂Selleck Chemicals公司类别号S1224
5-氟尿嘧啶Selleck Chemicals公司类别号S1209
阿霉素Selleck Chemicals公司类别号S1208
氯喹Sigma-Aldrich公司类别号C6628
关键商业分析
FITC Annexin V细胞凋亡检测试剂盒IBD生物科学分类号556547
可固定活力染色510BD生物科学分类号564406
QIAamp DNA FFPE组织试剂盒齐根分类号56404
miRNease FFPE试剂盒齐根类别号217504
原位细胞死亡检测试剂盒罗氏公司电话：11684817910
保存的数据
原始和分析数据这篇论文邮编90944
实验模型：细胞系
金融控股公司美国标准菌库CRL-1831型
HCT116型美国标准菌库CCL-247型
HT29型美国标准菌库HTB-38型
SW480型美国标准菌库CCL-228型
SW1116型美国标准菌库CCL-233型
二氧化二钙美国标准菌库HTB-37型
结肠癌细胞美国标准菌库CCL-229型
RKO公司美国标准菌库CRL-2577型
DLD1（数据链路1）美国标准菌库CCL-221型
实验模型：生物体/菌株
核梭杆菌应变25586美国标准菌库分类号59899827
脆弱拟杆菌应变43860美国标准菌库分类号5038385
粪肠球菌应变47077美国标准菌库分类号5091158
厌氧消化链球菌应变27337美国标准菌库分类号63229810
微小假单胞菌菌株33270美国标准菌库分类号62282361
中间普氏菌菌株49046美国标准菌库分类号63032740
大肠杆菌菌株DH5α天津类别号CB101
BALB/c裸鼠SIBS实验动物中心不适用
miRNA模拟物、miRNA抑制剂和mRNA siRNA的序列，见表S7.基因制药不适用
DNA引物序列，参见表S7桑根生物技术不适用
miRNA和U6引物，参见表S7复能基因包含在表S7
软件和算法
图像J美国国立卫生研究院https://imagej.nih.gov/ij/
查找目标3清华大学生命科学学院网址：http://bio.sz.tsinghua.edu.cn/
miRDB公司华盛顿大学医学院放射肿瘤学系http://mirdb.org/mirdb/
FlowJo公司FlowJo有限责任公司https://www.flowjo.com/
ZEN 2011轻版蔡司https://www.zeiss.com/microscopy网站/
R（右）R开发核心团队https://www.r-project.org/
顶帽2Kim等人，2013年http://tophat.cbcb.umd.edu
数据序列2Love等人，2014年https://www.bioductor.org网站/
HT序列Anders等人，2015年网址：http://www-huber.embl.de/HTSeq/
GSVA公司Hänzelmann等人，2013年https://www.bioconductor.org/

试剂和资源共享联系人

作为首席联系人，邹伟平负责所有试剂和资源请求。请通过联系邹伟平ude.hcimu.dem@uozw提出请求和询问。

实验模型和受试者详细信息

老鼠

对于异种移植物实验，将四周大的雄性BALB/c裸鼠置于层流柜中，在特定的无病原体条件下，随意提供食物和水。大肠癌细胞（1×107SW480-male电池或5×106HCT116-雄性细胞）皮下注射到每只小鼠的右腋下，建立CRC异种移植模型。皮下接种6天后，将小鼠随机分为不同组进行不同组的实验。相关病毒载体和有核F多点瘤内注射，每周两次，持续三周。化疗药物和CQ通过腹腔注射给药，每周两次，持续三周。

探讨有核F在体内奥沙利铂敏感性肿瘤的化疗耐药中，我们使用SW480-male细胞（1×107)在异种移植实验中。共有六组：i）盐水（对照组）；ii）有核F菌液；iii）低剂量奥沙利铂（5 mg/kg）；iv）低剂量奥沙利铂（5 mg/kg）和有核F; v） 大剂量奥沙利铂（10 mg/kg）；vi）高剂量奥沙利铂（10 mg/kg）和有核植物F.nucleatum。小鼠接受瘤内注射有核F每周两次，连续三周腹腔注射奥沙利铂。

在以下实验中，我们使用HCT116雄性细胞（5×106)建立异种移植模型，用CQ（30mg/kg）、奥沙利铂（7.5mg/kg）和5-FU（50mg/kg）治疗小鼠。

探讨F.有核我们使用HCT116雄性细胞（5×106)在异种移植实验中。共有八组：i）生理盐水（对照组）；ii）有核F细菌溶液；iii）miRNA载体病毒；iv）miR-18a*病毒；v） miR-4802病毒；vi）控制病毒；vii）ATG7过表达病毒；和viii）ULK1过表达病毒。

探讨自噬在有核F-在体内介导化疗耐药，我们设计了七组：i）对照组；ii）有核F组；iii）CQ集团；iv）奥沙利铂（或5-FU）组；v） 奥沙利铂（或5-FU）和有核F组；vi）奥沙利铂（或5-FU）和CQ组；vii）奥沙利铂（或5-FU），有核F和CQ集团。

探讨特异性miRNAs和自噬元件在有核F-在体内介导化疗耐药，我们设计了七组：i）对照组；ii）奥沙利铂（或5-FU）组；iii）奥沙利铂（或5-FU）和有核F组；iv）奥沙利铂（或5-FU），有核FmiR-18a*病毒组；v） 奥沙利铂（或5-FU），有核F和miR-4802病毒组；vi）奥沙利铂（或5-FU），有核FmiR-18a*病毒和ULK1过表达病毒组；vii）奥沙利铂（或5-FU），F.有核miR-4802病毒和ATG7过表达病毒组。

探讨TLR4信号通路在有核F-在体内介导化疗耐药，我们设计了八组：i）对照组；ii）对照shRNA组；iii）TLR4 shRNA病毒组；iv）MYD88 shRNA病毒组；v） 奥沙利铂（或5-FU）组；vi）奥沙利铂（或5-FU）和有核F组；vii）奥沙利铂（或5-FU），核F，TLR4 shRNA病毒组；viii）奥沙利铂（或5-FU），核F，MYD88 shRNA病毒组。

每三天用卡尺测量肿瘤的长度和宽度（毫米）。使用公式（A×B）计算肿瘤体积2)/2，其中A和B分别是长尺寸和短尺寸。三周后，处死所有小鼠，收集皮下肿瘤并称重。肿瘤体积和重量表示为平均值±SEM（n=8）。小鼠实验按照美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南进行。研究程序由上海交通大学医学院仁济医院动物护理和使用委员会批准。

菌种和生长条件

核梭杆菌菌株ATCC 25586(Castellarin等人，2012年),脆弱拟杆菌应变43860，粪肠球菌应变47077，厌氧消化链球菌菌株27337，微小假单胞菌应变33270，以及中间普氏菌菌株49046购自美国型培养物收藏中心（ATCC，Manassas，VA）。F.有核和P.米卡拉在37°C的厌氧条件下（英国西约克郡Don Whitley Scientific的DG250），在补充了氯化血红素、钾血红素的脑心灌注肉汤中培养过夜2高功率放大器4、维生素K1和L-半胱氨酸(Rhee等人，2009年).厌氧假单胞菌和中间P.intermedia在37°C厌氧条件下，在Wilkins-Chalgren厌氧肉汤（CM0643，佛罗里达州西棕榈滩赛默飞世尔科学公司）中培养。脆弱类杆菌在37°C的厌氧条件下，在ATCC 1490改良碎肉培养基中培养过夜。粪大肠杆菌和共生体大肠杆菌菌株DH5α（中国天根）在37°C的Luria-Bertani（LB）培养基中以220 rpm/min的振荡培养过夜。

单元格行

人类结直肠癌细胞系RKO-NA、SW1116-male、DLD1-male、SW480-male，Caco2-male、LOVO-male和HT29-female以及HCT116-maile（ATCC）在37°C添加10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培养基（GIBCO、Carlsbad、CA）中在5%湿CO中培养2大气。人类结肠上皮细胞FHC（来自妊娠13周）在DMEM/F12培养基（GIBCO，Carlsbad，CA）中培养，该培养基补充有25mM HEPES、10 ng/ml霍乱毒素、0.005mg/ml胰岛素、0.005 mg/ml转铁蛋白、100 ng/ml氢化可的松和10%FBS，培养温度为37°C，湿度为5%CO2大气。为了建立对奥沙利铂耐药的SW480细胞，我们用逐渐增加的奥沙利汀培养SW480电池两个月。欧盟委员会50对于已建立的奥沙利铂耐药细胞SW480和亲代SW480细胞，奥沙利汀的浓度分别为190.9μM和109.9μM。

患者和临床样本

我们研究了2012年至2015年间上海交通大学医学院附属仁济医院的3组结直肠癌患者。队列1和队列2来自仁济医院西校区。队列3来自仁济医院东校区。队列1中有31个新鲜组织，队列2和队列3中分别有92个和173个福尔马林固定石蜡包埋组织（FFPE）。我们在队列1中进行了16s RNA测序研究，以确定复发性结直肠癌组织中与非复发性结肠癌组织相比，哪种细菌占优势（和/或不同）。我们使用队列2作为发现临床样本集，以确定有核F与化疗耐药相关的癌症复发有关。我们使用队列3作为验证数据集，以评估队列2生成的截止值是否可以在具有已知临床信息（如复发或无复发癌症）的独立队列中应用和验证。因此，队列1、队列2和队列3分别作为我们的研究探索、发现和验证的模型。所有患者信息都可以在表S1–S2和S4.

患者经病理和临床诊断为结直肠癌。在外科治疗后，患者接受了XELOX方案治疗（奥沙利铂130 mg/m2第一天静脉注射超过两小时；卡培他滨850~1000 mg/m2，每天两次，连续14天；每三周重复一次）。根据机构指南，在采集样本之前，获得患者的知情同意。通过影像检查系统（胸部X光和CT）、胃镜活检和电话随访监测复发情况。仁济医院的伦理委员会批准了研究方案。本研究的所有参与者均获得了书面知情同意书。所有研究都是根据1975年《赫尔辛基宣言》的规定进行的。

方法详细信息

高通量排序

对于RNA测序，每个样品在RNeasy迷你柱（德国希尔登QIAGEN）上进行清理，用DNase处理，并在安捷伦2100生物分析仪上进行质量分析。样品在Illumina HiSeq 3000上进行2×150bp配对末端测序。根据TopHat-HTSeq-DeSeq2框架进行RNA-seq数据分析(Anders等人，2013年). 简单地说，使用TopHat v2.0.11将读数映射到人类基因组（hg19）(Kim等人，2013年)(http://tophat.cbcb.umd.edu)使用默认选项，使用从Ensemb_GRCh37构建的TopHat转录索引。对齐排序读取的计数文件由htseq-Count脚本使用GTF注释文件从联合模式的Python包htseq生成(Anders等人，2015年). 将每个测序样本的读取计数合并到计数文件中，随后用于差异表达分析。使用DESeq2软件包对计数文件进行差异分析，遵循标准规范化程序(Love等人，2014年). 在这两种情况下，总计数少于5的基因从进一步分析中删除。RNA序列数据保存在NCBIs基因表达总览（GEO，网址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)并可通过GEO系列登录号访问GSE90944标准.

RNA提取和实时PCR

使用Trizol试剂（Invitrogen，Carlsbad，CA）从CRC株系中提取总RNA，并使用PrimeScript RT试剂盒（Perfect Real Time；Takara，Japan）逆转录1μg总RNA以检测相对mRNA。对于MiRNA，根据制造商的说明，使用All-in-One MiRNA Q-PCR检测试剂盒（GeneCopoeia，Rockville，MD）逆转录1μg总RNA，总反应体积为25μl。如前所述，在Applied Biosystem 7900定量PCR系统（Applied Biosystems，Foster City，CA）上进行三次定量实时PCR(Sun等人，2015). 使用2-ΔΔCt方法。β-actin和U6分别作为内部参考基因。

检测有核F

参考基因前列腺素转运体（PGT）的引物序列及检测方法有核F检测方法如前所述(Castellarin等人，2012年;Chen等人，2013). gDNA使用QIAamp DNA Mini Kit（德国希尔顿QIAamp公司）从新鲜结直肠癌组织中提取，使用QIAamp DNA FFPE tissue Kit（美国希尔顿QIA公司）从FFPE中提取。对每个样本的gDNA进行qPCR，以确定有核F通过检测16S基因。每个反应包含40ng gDNA，并在10μL反应中一式三份进行分析，反应包含1×Power SYBR Green PCR Master Mix（Thermo Fisher Scientific，West Palm Beach，FL），每个引物0.4μM，并置于96孔光学PCR板中。使用ABI StepOne Plus Real-Time PCR系统（加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）在以下反应条件下进行DNA扩增和检测：95°C下10分钟，然后在95°C条件下40个变性周期15秒，60°C条件下达1分钟有核F通过使用PGT作为参考基因，将每个反应中人类活检gDNA的数量标准化(Castellarin等人，2012年).

Western印迹和化学试剂

如前所述，使用标准技术进行蛋白质印迹(熊等，2012). 使用BCA蛋白质分析试剂盒（佛罗里达州西棕榈滩赛默飞世尔科学公司）收集细胞提取物并进行定量。通过12%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳40μg蛋白质，然后转移到PVDF膜（Bio-Rad，Hercules，CA）。将膜在5%无脂牛奶中封闭1小时，然后在4°C下与一级抗体孵育过夜。二级抗体用HRP（中国康晨）标记，信号用ECL试剂盒（伊利诺伊州罗克福德Pierce Biotech）检测。随后，使用ImageJ 1.43软件对图像进行分析。使用β-肌动蛋白抗体作为全细胞裂解物的对照。所有抗体的信息列在资源表中。

细胞增殖试验、凋亡检测和TUNEL试验

通过Cell Counting Kit-8（Dojindo，日本）分析评估细胞增殖。以2000个细胞/孔的速度将细胞接种到带有100μL培养基的96 well板中。在特定时间点将10μL CCK-8溶液添加到细胞中，并在37°C下培养细胞2小时。根据制造商的说明对反应产物进行量化。

流式细胞仪检测细胞凋亡。按照制造商的方案进行Annexin V FITC/PI双染色试验（BD Biosciences，San Jose，CA）。当细胞被阿霉素处理时，我们进行了FVS510和Annexin V-FITC双重染色，以避免药物的荧光信号。使用原位细胞死亡检测试剂盒（德国曼海姆罗氏分子生物化学公司），通过末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）技术检测异种移植瘤组织中的肿瘤细胞凋亡。阴性对照用标记溶液（无末端转移酶）培养，而不是用TUNEL反应混合物培养。

寡核苷酸转染

siRNA、miRNA模拟物和抑制剂购自Genepharma（中国上海）(表S7). 使用DharmaFECT 1 siRNA转染试剂（Invitrogen，Carlsbad，CA）进行寡核苷酸转染，同时使用非特异性siRNA或miRNA作为阴性对照。

荧光素酶测定

将80 ng荧光素酶报告质粒、10 ng pRL-TK-Renilla-luciferase质粒（Promega，Madison，WI）和指示的RNA（最终浓度为20 nmol/L）共同转染HCT116细胞或HT29细胞。转染后24小时，使用双荧光素酶检测试剂盒（威斯康星州麦迪逊市普罗米加）对萤火虫和Renilla荧光素酶活性进行定量。每次转染分三次进行，重复两次。

电子显微镜

按指示处理细胞，并用含有0.1mol/L二碳酸钠的2.5%戊二醛固定。使用1%四氧化锇固定样品，然后通过增加乙醇和环氧丙烷的浓度梯度进行脱水。然后将样品嵌入，切割成50nm的切片，并用3%醋酸铀酰和柠檬酸铅染色。使用JEM-1200电子显微镜采集图像（日本东京JEOL）。

共焦显微镜

将HCT116细胞和HT29细胞接种在6孔板中，并在转染时使其达到50%-70%的融合。MRFP-GFP-LC3腺病毒载体购自HanBio Technology（中国上海）。检测原理基于绿色和红色荧光蛋白的不同pH稳定性。EGFP的荧光信号在溶酶体内的酸性条件下（pH值低于5）可以被猝灭，而mRFP荧光信号在酸性条件下没有明显变化。在绿色和红色图像中，自噬体显示为黄色斑点（即RFP+GFP公司+)，而自溶体显示为红点（即RFP+GFP公司−). 当细胞内黄点和红点均增加时，自噬通量增加，而当细胞内只有黄点增加而红点未改变，或黄点和红点均减少时，自吞噬通量被阻断(周等，2012).

根据制造商的说明进行腺病毒感染。将CRC细胞在含有腺病毒的生长培养基中在37°C下培养2小时，并在含有有核F和miRNAs在指定浓度下在37°C下持续0–24小时。使用配备63倍油浸物镜的蔡司LSM710共焦显微镜（卡尔蔡司）检查LC3穿孔。

腺病毒和质粒的构建

对照、对照shRNA、对照miRNA、miR-18a*、miR-4802、TLR4 shRNA、MYD88 shRNA腺病毒以及ULK1和ATG7过表达腺病毒和所有质粒均由中国上海奥比奥科技公司构建。

量化和统计分析

统计分析

使用程序R进行统计分析(网址：www.r-project.org). 至少三次独立实验的数据以平均值±SE表示。散点图和条形图中的误差条代表SE。通过单样本Kolmogorov-Smirnov检验对数据进行检查，以确定它们是否呈正态分布。如果数据是正态分布的，则使用独立样本t检验比较两组之间的测量数据，并首先使用单向方差分析检验比较三个或更多组之间的比较。如果结果存在显著差异，则当数据为偏态分布时，通过非参数检验进行比较。两组之间的测量数据采用非参数Mann-Whitney检验。为了生成ROC曲线，将患者分为复发时间大于或小于无复发生存期中位数，不包括最后随访时生存时间小于无复发存活期中位数的患者。单样本基因集富集分析（ssGSEA）用于评估基因表达谱数据中的基因集激活分数。ssGSEA通过比较基因集内外基因表达等级的分布来计算样本级基因集得分。ssGSEA评分通过基因集变异分析（GSVA）R包计算(Hänzelmann等人，2013年). 统计检验是双尾的，小于0.05的p值被认为具有统计学意义。

数据和软件可用性

本研究的数据已保存在基因表达综合数据库（GEO）中，如下所示：GSE90944标准.

​

集锦

  • 特定肠道微生物与大肠癌化疗后复发的关系
  • 有核F协调Toll样受体、微小RNA和自噬网络以控制癌症化学耐药性
  • 测量和瞄准有核F可能有助于患者的预后和管理

补充材料

补充信息

单击此处查看。（250万，pdf）

致谢

本项目部分获得了国家自然科学基金（81421001、81320108024、81530072、81522008、31371273、31371420、81572303和81001070）、国家重点技术研发计划（2014BAI09B05）、，上海高等学校特聘教授项目（东方学者201268号、2015年青年东方学者QD2015003号）、上海市教委高峰临床医学资助项目（编号20152512、20161309）、上海交通大学晨兴项目（陈海宏）、，和国家癌症研究所（CA211016，W.Z）。我们感谢钟铭博士为这项工作收集了阴茎癌组织和患者信息。我们感谢严婷婷博士的图形抽象概念。

脚注

补充信息

补充信息包括七个数字、七个表格，可以在网上找到这篇文章http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2017.07.008.

作者贡献

概念化，W.Z.，J.H.，J.-Y.F。；方法学，I.K.，N.N.，J.H.，H.C。；调查，T.Y.，F.G.，Y.Y.，T.S.，D.M.，J.H.，Y.Q.，D.S。；书面原稿，J.H.，H.C.，F.G。；统计分析，H.C.，F.G。；Writing-Reviewing&Editing，I.K.、N.N.、Y.C.、W.Z.、J.-Y.F。；融资收购，J.-Y.F.，J.H.，H.C.，Y.C.，W.Z。；监理、J.-Y.F.、W.Z.、J.H.和H.C。

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