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.2016年5月18日；7(4):427-42.
doi:10.1080/21505594.2016.1144001。 Epub 2016年1月25日。

人呼吸道合胞病毒诱导DNA双链断裂和细胞衰老

伊西多罗·马丁内斯 1, 维罗尼卡·加西亚·卡皮佐 2, 特立尼达-吉亚罗 1, 安娜·加西亚·戈麦斯 1, 迭戈·纳瓦罗 2, 阿娜·阿兰达 2, 阿尔贝托·赞布拉诺 1
附属公司

人呼吸道合胞病毒诱导DNA双链断裂和细胞衰老

伊西多罗·马丁内斯等。 毒力. .

摘要

人类呼吸道合胞病毒（HRSV）是婴儿和儿童下呼吸道感染的主要原因，与严重的发病率和死亡率相关。HRSV在细胞系统（如永生化上皮细胞）中引起增殖停滞和特征性合胞体。我们在这里表明，HRSV诱导培养细胞中继发于线粒体活性氧（ROS）产生的DNA损伤标记物的表达和增殖抑制，如P-TP53、P-ATM、CDKN1A和γH2AFX。DNA损伤灶含有γH2AFX和TP53BP1，表明双链断裂（DSBs），可通过N-乙酰半胱氨酸（NAC）或还原型谷胱甘肽乙酯（GSHee）等抗氧化剂处理逆转。观察到的损伤与衰老细胞的积累有关，在单核细胞和合胞体中都显示出典型的衰老表型。此外，在病毒清除后很长时间内，我们发现感染小鼠呼吸道上皮细胞中存在DNA损伤和老化迹象，例如γH2AFX和CDKN2A的表达。总之，这些结果表明，HRSV触发了DNA损伤介导的细胞衰老程序，可能是由氧化应激介导的。结果还表明，该程序可能导致感染的生理病理学、组织重塑和衰老，并可能与HRSV感染的长期后果有关。

关键词：DNA损伤；活性氧；细胞衰老；人体呼吸；合胞病毒。

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数字

图1。
图1。
HRSV感染细胞中细胞衰老的发生（A）5200个细胞/cm接种A549细胞HRSV裂解感染过程中细胞衰老发生2在48 h.p.i.（MOI=3）时处理细胞进行SA-βgal测定。放大倍数：200X，比例尺：50μm。（B） A549细胞中SA-βgal表达的定量（总人口和合胞体). （C） 和（D）HEp-2细胞中的类似分析。（E） 免疫-SA-βgal，一种检测大量感染的HEp-2细胞中SA-βgal表达的方法，用α-HRSV抗体染色（红色染色）。放大倍数：200倍；比例尺：50μm。（F） HRSV持续感染HEp-2细胞培养中细胞衰老的发生和量化。放大倍数：200X；比例尺：50μm。（G） 培养细胞上清液中IL-6和TNF-α的定量。图中的条形代表2-3个实验的平均值±SD。n=3次重复。（H） 凋亡/坏死分析。将8000个细胞/孔接种在6孔板中，并在MOI＝3的第二天用HRSV感染。在60小时p.i.时，对细胞进行流式细胞术处理。用荧光探针（AnnexinV-AlexaFluor488™和Sytox™）处理后，凋亡细胞显示绿色荧光，死亡细胞显示较亮的绿色荧光，而活细胞显示很少。这些人群通过FACSCalibur流式细胞仪的FL1通道进行区分。用20μM喜树碱（CPT）处理细胞12 h作为凋亡阳性对照。（一） 使用荧光素β半乳糖苷酶底物C12FDG和流式细胞术（上面板）或传统SAβgal（下面板）进行SAβgal。将8000个细胞/孔接种在6孔板中，第二天在MOI=3时感染HRSV。在60 h.p.i.时，用Bafilomycin A1和C12FDG培养细胞，并按照材料和方法进行流式细胞术或传统SA-βgal分析（底图）。放大倍数：200倍；比例尺：50μm。
图2。
图2。
HRSV诱导DNA损伤。（A） HRSV感染A549细胞中DNA损伤标记物γH2AFX和TP53BP1共焦共定位分析（48 h.p.i.MOI=3）。放大倍数：600倍；比例尺：10μm（B）常规间接免疫荧光显示模拟和感染A549细胞中存在γH2AFX和TP53BP1（48 h.p.i.MOI=3）。放大倍数：600倍；比例尺：10μm。DNA损伤的量化焦点右面板显示含有γH2AFX和TP53BP1。（C） 通过western blot检测模拟和感染A549细胞中的各种DNA损伤和增殖抑制标记（30 h.p.i.MOI=3：面板p-TP53、CDKN2A、p-RB1、p-ATM）；48 h.p.i.MOI=3：面板CDKN1A和γH2FAX。KDa:千道尔顿。图中的条形代表2个实验的平均值±SD，n=3个重复。DNA损伤焦点在每个实验条件下，从>150个细胞中进行计数。数据c组是一个具有代表性的实验。
图3。
图3。
HRSV诱导线粒体活性氧（ROS）。（A） 使用DCFH-DA探针和荧光法测量模拟和感染A549细胞（48 h.p.i.MOI=3）的总ROS水平。（B） 模拟和感染A549细胞（24 h.p.i.MOI=3）的还原（GSH）和氧化（GSSG）谷胱甘肽的测量。（C） 用MitoSOX和荧光显微镜评估模拟和感染A549细胞（24 h.p.i.MOI=3）中的线粒体活性氧。阳性对照：100μM百草枯处理的细胞。显示了用百草枯处理的细胞的图像，这些细胞是在与其他样品相同的暴露量（等效暴露量）和减少的暴露量下获得的。放大倍数：400X；比例尺：20μm。（D） 用MitoSOX和流式细胞术评估模拟和感染A549细胞（24 h.p.i.MOI=3）的线粒体ROS水平。左侧面板显示了具有代表性的直方图。右侧面板显示了MitoSOX荧光的平均强度和阳性细胞的百分比。条形代表两个实验的平均值±SD，方差分析数据D： P<00001；n=3次重复。
图4。
图4。
HRSV诱导的DNA损伤通过抗氧化处理得以减少（A）DNA损伤的量化焦点在模拟和感染的A549细胞（48 h.p.i.MOI=3）中含有γH2AFX和TP53BP1，无论是否用N-乙酰半胱氨酸（NAC）处理。在感染前90分钟用5 mM NAC处理细胞，然后在病毒吸附后处理细胞，直到实验结束。（B） 经5 mM NAC处理或未经处理的A549感染细胞（48 h.p.i.MOI=3）上清液中的病毒滴度。（C） DNA损伤的典型图像焦点模拟和感染A549细胞（48 h.p.i.MOI=3），用或不用N-乙酰半胱氨酸（NAC）处理。放大倍数：600倍；比例尺：10μm。箭头：DD焦点（D）经2,5 mM GSH乙酯（GSHee）处理后，模拟和感染A549细胞（24 h.p.i.MOI=3）中细胞内还原型谷胱甘肽（GSH）增加。（E） DNA损伤的量化焦点在模拟和感染的A549细胞（48 h.p.i.MOI=3）中含有γH2AFX和TP53BP1，无论是否用GSHee处理。在感染前90分钟用GSHee处理细胞，然后在病毒吸附后处理细胞，直到实验结束。经2,5 mM GSHee处理或未经处理的A549感染细胞（48 h.p.i.MOI=3）上清液中的病毒滴度（右侧面板）。（F） DNA损伤的典型图像焦点在模拟和感染的A549细胞中（48 h.p.i.MOI=3），无论是否用GSHee治疗。放大倍数：600倍；比例尺：10μm。（G） 左侧面板：转染过氧化氢酶（标记的过氧化氢酶，绿色）和DD的表达焦点HRSV感染A549细胞（48 h.p.i.MOI=3）并转染质粒pCMV3-CAT-N-FLAG。标记为“b”和“c”的细胞显示过氧化氢酶过度表达和缺乏DD病灶；合胞体标记为“a”表示没有显著的过氧化氢酶过度表达，并且存在核窝藏大量DD焦点右面板：DD病灶（TP53BP1）和HRSV-F糖蛋白（绿色）在A549感染细胞中的表达（48 h.p.i.MOI=3）放大600X，比例尺：10μM。（h） 左：面板：DD量化焦点感染HRSV（48 h.p.i.MOI=3）并转染质粒pCMV3-CT-N-FLAG的A549细胞。CAT公司−：无明显过氧化氢酶过度表达的细胞，CAT+：细胞过度表达过氧化氢酶。右侧面板：感染HRSV（48 h.p.i.MOI=3）并转染空载体作为对照或过氧化氢酶（CAT）质粒的A549细胞培养上清的病毒滴度。条形图表示两个实验的平均值±标准差；n=3次重复。DNA损伤焦点在每个实验条件下，从>150个细胞中进行计数。
图5。
图5。
HRSV感染小鼠肺部DNA损伤和衰老标记物的表达。（A）模拟感染小鼠的肺上皮组织用抗体染色：αHRSV（HRSV抗体库）和γH2AFX。（B） HRSV感染小鼠肺组织αHRSV和γH2AFX抗体多重免疫荧光标记的代表性图像染色。（C） ，（D）上皮性肺组织多重免疫荧光标记阴性对照（无原发性）的代表性图像。放大倍数：600倍；比例尺：10μm。箭头信号细胞显示对γH2AFX的反应性。AE：牙槽骨上皮，Br：细支气管，CSCE：纤毛单柱状上皮（E）感染后4天小鼠肺组织（模拟感染或HRSV感染）上γ-H2AFX和CDKN2A常规免疫组化的代表性图像。（F） 感染后11天和30天小鼠肺组织γH2AFX和CDKN2A常规免疫组化的代表性图像。箭头信号细胞显示对γH2AFX和CDKN2A的反应性。两个实验，n=5（模拟感染）或6（感染）复制品（小鼠）每条件。
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