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.2015年1月29日；160（3）：489-502。
doi:10.1016/j.cell.2015.01.001。 Epub 2015年1月22日。

癌相关蛋白激酶C突变揭示激酶作为肿瘤抑制剂的作用

Corina E Antal公司 1, 安德鲁·哈德森 2, 艾米丽·康 三, 西罗·赞卡 4, 克里斯托弗·沃思 5, 娜塔莉·斯蒂芬森 2, 埃莉诺·W·特罗特 2, 丽莎·加列戈斯 1, 克里斯宾·J·米勒 5, 弗兰克·B·富纳里 4, 托尼·亨特 6, 约翰·布罗格纳德 7, 亚历山大·牛顿 8
附属机构

癌相关蛋白激酶C突变揭示激酶作为肿瘤抑制剂的作用

Corina E Antal公司等。 单元格. .

摘要

尽管蛋白激酶C（PKC）同工酶的强效配体佛波酯具有明确的促肿瘤功能，并且其突变普遍存在，但它们仍然是难以确定的癌症靶点。我们分析了8%在人类癌症中发现的PKC突变，令人惊讶的是，大多数是功能丧失，没有激活。所有PKC亚群均发生功能丧失突变，阻碍第二信使结合、磷酸化或催化。通过CRISPR介导的基因组编辑纠正患者源性结肠癌细胞系中功能丧失的PKCβ突变，抑制了异种移植模型中的锚定非依赖性生长和肿瘤生长。半合子缺失促进了凤尾鱼的非依赖性生长，表明PKCβ对肿瘤的抑制是单倍体的。一些突变为显性阴性，抑制了全球PKC信号输出，生物信息学分析表明，PKC突变与癌症驱动因素中的同时发生突变相结合。这些数据表明，PKC同工酶通常具有抑癌作用，表明治疗应侧重于恢复而非抑制PKC活性。

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数字

图1
图1。在9个PKC基因中发现了大量与癌症相关的突变
（左）显示启动磷酸化位点的传统（α，β，γ）、新（δ，ε，η，θ）和非典型（ζ，）PKC成员的结构域：激活环（粉红色）、转向基序（橙色）和疏水基序（绿色）。（右）在每个PKC同工酶中鉴定出的TCGA与癌症相关突变（错义、无义、插入、缺失、剪接位点或翻译起始位点）的病例数。
图2
图2。调控C1和C2结构域中的PKC突变是LOF
（A） PKCγ（PDB 2E73）C1A结构域的溶液结构，显示了与Zn配位的相应PKCαHis75残基2+和PKCαTrp58。（B） 在共表达CKAR和mCherry标记的WT、突变体PKCα或无外源性PKC（内源性）的COS7细胞中，由CKAR读出的代表DiC8-（10μM）和PDBu-（200 nM）诱导的PKC活性的归一化FRET比率变化（平均值±SEM）。（C） （左）在基础和PDBu处理条件下（200 nM；15 min）显示的PKC同工酶的代表性YFP图像，显示WT（而非突变PKCα）重新定位到膜。（右）标准化FRET比率变化（平均值±SEM），量化用10μM DiC8刺激后YFP标记的PKCα蛋白向膜靶向CFP的易位，然后用200 nM PDBu刺激。（D） UTP（100μM）刺激后，正常FRET比率变化（平均值±SEM）显示PKC易位。（E） 免疫印迹显示所示YFP标记的PKCα蛋白的磷酸化状态。（F） PKCγ（PDB 2UZP）C2结构域的晶体结构，突显Ca中Asp193和Asp254残基2+结合。（G） 正常化FRET比率变化（平均值±SEM）显示CKAR在细胞内Ca升高时读出的PKC活性2+先用他必佳（5μM）刺激，然后用PDBu（200 nM）刺激。（H） 经标准化的FRET比率变化（平均值±SEM）显示，在用毒精（5μM）和PDBu（200 nM）刺激COS7细胞后，YFP标记的PKCγ结构向膜定位CFP移位。将数据归一化为每个细胞的最大易位幅度，然后使用以下等式从0缩放到1：X=（Y−Ymin）/（Ymax−Y最小），其中Y=归一化FRET比率，Ymin=Y的最小值，Ymax是Y的最大值。（I）归一化的FRET比率变化显示YFP标记的WT-PKCγ的振荡易位，但不是PKCγ突变体D193N和D254N，在HeLa细胞中共同表达膜靶向CFP并用10μM组胺刺激。数据是来自三个独立实验的单个细胞的代表性痕迹。另请参见图S1。
图3
图3。激酶结构域PKC突变是LOF
（A） PKCβII（PDB 2I0E）激酶结构域的晶体结构，突出癌相关残基和调节棘（黄色空间填充）。（B） 正常化FRET比率变化（平均值±SEM）显示COS7细胞中PKCδ结构的PKC活性，共同表达质膜靶向的PKCδ特异性报告蛋白PM-δCKAR。用UTP（100μM）刺激细胞，然后用PDBu（200 nM）刺激。（C） PKCδWT和突变体磷酸化状态的免疫印迹分析。（D） mCherry-tagged PKCηWT或突变体的代表性mCherry图像显示在基础条件下和向COS7细胞添加200 nM PDBu后15分钟的定位。（E） （左）免疫印迹显示PKC底物磷酸化。用4μM Gö6976预处理过度表达所示结构的COS7细胞10分钟，以抑制cPKC同工酶，然后用200 nM PDBu刺激或不刺激COS7，以激活nPKC同功酶。（右）免疫印迹定量，并归一化为总PKCη水平和微管蛋白（右）。数据表示三个独立实验±SEM的平均值。采用重复测量的单因素方差分析（ANOVA）和事后邓内特（Dunnett）的多重比较试验对基础活动和刺激活动进行比较*与WT组相比，p<0.05。（F） mCherry-tagged PKCηWT和突变体磷酸化状态的免疫印迹分析。（G） 标准化FRET比率变化（平均值±SEM）表明，在200 nM PDBu刺激下，COS7细胞共同表达CKAR和RFP标记的PKCγ突变体的PKC活性。（H） 免疫印迹显示PKCγWT和P524R磷酸化。星号表示磷酸化和破折号非磷酸化PKCγ。（一） 正常化FRET比率变化（平均值±SEM）显示共同表达CKAR的COS7细胞中PKCβII构建物的PKC活性。用UTP（100μM）刺激细胞，然后用PDBu（200 nM）刺激。（J） 免疫印迹显示mCherry-tagged PKCβII WT和突变磷酸化。星号表示磷酸化和破折号非磷酸化PKCβII。另请参见图S1。
图4
图4。PKC突变大多为LOF
（A） 研究的PKC突变的功能影响饼图，亮红色代表缺乏活性的突变，中红色代表对生理刺激（DAG或Ca）无反应的突变2+但对非生理性佛波酯有一些反应，淡红色表示与相应的WT同工酶相比，对生理刺激表现出活性降低的突变，蓝色表示与相应WT PKC同工酶没有差异。（B） cPKC、nPKC和aPKC同工酶的结构域，覆盖着同工酶颜色编码的LOF突变。（C） PKCβII（PDB 2I0E）激酶结构域的晶体结构，突显在各种PKC同工酶内至少四个肿瘤样本中突变的“温锅”残基。（D） 描绘各种癌症中每个PKC同工酶的突变百分比的条形图。
图5
图5。杂合子LOF-PKCβ突变的校正降低了软琼脂、悬浮液和异种移植模型中的生长
（A） DLD1细胞中PKCβII、PKCα和GAPDH水平的免疫印迹（左）和定量（右；平均值±SEM）。（B） 磷酸化-（Ser）PKC底物的免疫印迹（左）和定量（右；平均值±SEM）。采用重复测量单因素方差分析（ANOVA）和事后Dunnett多重比较测试进行比较*与DLD1亲代细胞相比，p<0.05。数据代表三个独立的实验±SEM。（C）通过台盼蓝排除试验在三个独立实验的悬浮液中72小时后评估的相对活细胞数（平均值±SEM）。采用单因素方差分析和事后Dunnett多重比较检验进行比较***与DLD1亲代细胞组相比，p<0.001。（D） 悬浮培养24小时的DLD1细胞的典型相位对比图。（E）（左）软琼脂中的集落形成试验。（右）三到六个独立实验中直径≥50μm菌落的菌落面积量化（平均值±SEM）。采用单向方差分析和事后Tukey多重比较测试进行比较****与DLD1亲代细胞组相比，p<0.0001和***p<0.001。（F） 肿瘤生长表示为平均肿瘤体积（mm三)±SEM，红色代表注射DLD1亲本细胞的小鼠的数据（A509T/WT；五只小鼠），紫色代表三个校正克隆的平均值（总共17只小鼠）。对每个时间点采用双尾、非配对学生t检验进行比较**p<0.005和***p<0.0005。（G） （上图）来自DLD1细胞的肿瘤TUNEL染色切片的代表性区域。（底部）TUNEL阳性细胞核定量（平均值±SEM）。采用单因素方差分析和事后Dunnett多重比较测试进行比较****与DLD1亲代细胞组相比，p<0.0001。另请参见图S2。
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工具书类

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