癌相关蛋白激酶C突变揭示激酶作为肿瘤抑制剂的作用

总结

简介

自从发现蛋白激酶C（PKC）是促进肿瘤的佛波酯的受体以来，人们就在癌症的背景下对其家族进行了深入的研究(Castagna等人，1982年)。这导致了一个信条，即佛波酯激活PKC可促进致癌物诱导的肿瘤发生(Griner和Kazanietz，2007年)然而，针对癌症中PKC的研究一直没有成功。

PKC家族包含九个基因，它们具有许多靶点，因此具有多种细胞功能，包括细胞生存、增殖、凋亡和迁移(Dempsey等人，2000年)。PKC同工酶包括三类：常规（cPKC:α，β，γ），新（nPKC:δ，ε，η，θ）和非典型（aPKC:ζ，γ）。cPKC和nPKC同工酶在三个启动位点（激活环、转向基序和疏水基序）组成磷酸化，以构建PKC用于催化(牛顿，2003)。假底物片段将PKC维持在第二信使结合解除的自抑制构象中。cPKC同工酶通过与二酰甘油（DAG）和钙结合而被激活²⁺而nPKC同工酶仅由DAG激活，DAG是在膜上与PKC结合的事件。因此，这些PKC同工酶有两个激活的先决条件：组成加工磷酸化和第二信使依赖的膜重定位。与佛波酯长时间激活cPKC和nPKC同工酶导致其去磷酸化和随后的降解，这一过程被称为下调(Hansra等人，1996年；Young等人，1987年)。aPKC同工酶既不结合Ca²⁺也不是DAG。

PKC已被证明是癌症治疗中的一个棘手的靶点(康，2014)。PKCⅠ被认为是肺癌和卵巢癌的癌基因(Justilien等人，2014年；Regala等人，2005年；Zhang等人，2006年)，并且PKCε由于其转化细胞的能力而被归类为癌基因(Cacase等人，1993年)。然而，对于大多数PKC同工酶来说，关于它们是作为致癌基因还是作为肿瘤抑制因子，存在着相互矛盾的证据。例如，PKCδ因其促凋亡作用而被认为是肿瘤抑制因子(雷兰德，2007)。然而，它在某些情况下促进肺癌和胰腺癌的肿瘤进展(Mauro等人，2010年；Symonds等人，2011年)。类似地，据报道，PKCζ在结肠癌细胞中的过度表达和丢失分别会降低裸鼠或细胞系的致瘤性(Luna-Ulloa等人，2011年；Ma等人，2013年)。同样，PKCα也被报道诱导(Walsh等人，2004年；Wu等人，2013年)抑制结肠癌细胞增殖(Gwak等人，2009年)并抑制APC中结肠肿瘤的形成^最小值/+模型(Oster和Leitges，2006年)。基于PKC同工酶对癌症进展有积极作用的信条，许多PKC抑制剂已进入临床试验；然而，它们一直是无效的(Mackay和Twelves，2007年)。事实上，最近对PKC抑制剂联合化疗与单纯化疗对照试验的荟萃分析显示，PKC抑制剂显著降低了非小细胞肺癌的缓解率和疾病控制率(Zhang等人，2014年)。为什么抑制PKC在临床上失败了？已经很好地证明，长期或重复使用佛波酯处理会消耗细胞中的cPKC和nPKC同工酶(布隆伯格，1980年；Nelson和Alkon，2009年)PKC的丢失，而不是其激活，是否会促进肿瘤的发生。

PKC在人类癌症中经常发生突变。为了揭示PKC功能的丧失或获得是否有助于癌症的进展，我们选择了整个主要序列和家族成员的突变，并评估了它们的功能影响。具体地说，我们使用我们的基因编码报告基因C激酶活性报告基因（CKAR），询问这些癌症相关突变如何改变PKC的信号输出(Violin等人，2003年)。对其中46个突变的特征分析表明，大多数突变降低或消除了PKC活性，而没有任何突变激活。对所有PKC突变的生物信息学分析表明，它们可能与已知受PKC调控的癌基因和肿瘤抑制因子中的同步突变协同作用。在一个结肠癌细胞系中纠正一个患者识别的杂合性功能丧失（LOF）PKCβ突变，显著减小小鼠异种移植瘤的肿瘤大小，表明PKC功能丧失会促进肿瘤生长。我们的数据与PKC同工酶作为肿瘤抑制因子的功能一致，逆转了其过度激活促进肿瘤生长的范式。

结果

在9个PKC基因中发现了大量与癌症相关的突变

截至2014年10月，已在多种癌症中发现554个突变，其中大多数为杂合突变(Cerami等人，2012年；Gao等人，2013年)在cPKC（242）、nPKC（236）和aPKC（76）同工酶内(图1)。这些突变存在于整个编码区，没有明显的突变热点。因此，我们对PKC结构域内和结构域间区域内的突变进行了全面研究，以确定它们如何影响PKC信号传导从而促进癌症发病。从所有三类PKC同工酶中选择了46个保守和非保守残基突变(表1和表S1).

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图1

在9个PKC基因中发现了大量与癌症相关的突变

（左）显示启动磷酸化位点的传统（α，β，γ）、新（δ，ε，η，θ）和非典型（ζ，）PKC成员的结构域：激活环（粉红色）、转向基序（橙色）和疏水基序（绿色）。（右）在每个PKC同工酶中鉴定出的TCGA与癌症相关突变（错义、无义、插入、缺失、剪接位点或翻译起始位点）的病例数。

表1

癌症中失去功能的PKC突变

突变一	活动	域	癌症	残留物重要性	等位基因频率	其他突变b条
γG23E	没有人c（c）	PS（聚苯乙烯）	结直肠的	在假衬底上加负电荷	不适用	γG23W δG146R （G128C）
εR162H	低的		头部和颈部	非服务的	0.15
αW58L	没有人c（c）	C1A公司	头部和颈部	DAG结合；在所有C1a结构域中保守	0.22	γW57拼接 θW171*
αG61W	低的		肺	在cPKC-C1a结构域中保守	0.05	βG61W
βG61W	低的		肺	在cPKC-C1a结构域中保守	0.06	αG61W
γQ62H	没有人c（c）		肺	在所有PKC同工酶中保守	0.45	αQ63H εQ197P
αH75Q	没有人天		结直肠的	坐标Zn2+; 在所有C1结构域中保守	不适用	ηH284Y ¨H179Y
γD193N	没有人c（c）	指挥与控制	结肠直肠/黑色素瘤/卵巢	钙2+结合位点	0.28
γT218M	没有人c（c）		胃	非服务的	0.42	γT218R
γD254N	低的		子宫内膜/卵巢	钙2+结合位点	0.43
αG257V	没有人c（c）		肺	cPKC同工酶中保守	0.12
γF362L	没有人c（c）	激酶	子宫内膜	cPKC和nPKC同工酶中保守	0.21	γF362fs βF353L
βY417H	没有人c（c）		肝脏	cPKC同工酶中保守	0.67	γY431F
ζE421K	没有人天		乳房	APE基序；在大多数蛋白激酶中保守	不适用	αE508K （E423D）
αF435C	没有人c（c）		子宫内膜	cPKC和nPKC同工酶中保守	0.31
αA444V	低的		子宫内膜/乳房	cPKC和nPKC同工酶中保守	0.27	βA447T γA461T γA461V δa54v θa485吨 S359C系列
γG450C	没有人c（c）		子宫内膜/肺/肝	cPKC同工酶中保守	0.41	εR502*
αD481E	低的		结直肠的	DFG基序；在大多数蛋白激酶中保守	不适用	βD484N γD498N 第396E页
βA509V	没有人天		乳房	APE基序；在大多数蛋白激酶中保守	不适用	αA506V αA506T βA509T
βA509T	没有人c（c）		结直肠的	APE基序；在大多数蛋白激酶中保守	0.53	αA506V αA506T βA509V
γP524R	没有人天		胰腺的	APE基序；在大多数蛋白激酶中保守	不适用	γP524L δP517S εP576S θP548S
δD530G	没有人天		结直肠的	锚定保守的调控脊椎；在所有真核激酶中保守	不适用	βD523N γD537G γd537年
δP568A	没有人c（c）		头部和颈部	在所有PKC同工酶中保守	0.16	δP568S βP561H γP575H
βG585S	低的		肺	在所有PKC同工酶中保守	不适用	ηG598V
ηK591E	低的		乳房	守恒电荷反转	不适用	ηK591N θR616Q
ηR596H	没有人天		结直肠的	在所有PKC同工酶中保守	0.50
ηG598V	没有人天		肺	在所有PKC同工酶中保守	不适用	βG585S
βP619Q	没有人天	羧基末端	子宫内膜	PXXP基序；在AGC激酶中保守	0.48

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PKC突变表明任何激动剂都没有活性，生理刺激也没有活性，或对生理刺激反应活性降低。等位基因频率从cBio Portal获得。

^一本研究中检测的突变。

^b条其他突变出现在相同/其他PKC同工酶的相同/对应残基上。

^c（c）Kinase-dead公司。

^天对生理刺激无反应。

调节C1和C2结构域中的PKC突变是LOF

cPKC和nPKC同工酶的C1结构域对其激活至关重要，因为它们通过与DAG结合介导PKC易位到膜。因此，我们研究了C1结构域突变如何改变PKC易位和活化。为了测量激动剂依赖性PKC活性，用细胞渗透性DAG、DiC8或佛波酯、佛波醇12,13-二丁酸酯（PDBu）刺激共同表达FRET-based PKC报告子（CKAR）和同等水平的野生型（WT）或突变型mCherry-tagged PKC的COS7细胞，并记录磷酸化依赖性FRET比率的变化。福尔波酯是一种有效但非生理学的工具，可以最大限度地激活PKC，因为它们与C1结构域的亲和力是DAG的100倍(莫西奥和牛顿，1998年)。在结直肠癌肿瘤中发现的一个突变改变了锌的配位所需的一个残基（PKCαH75Q）²⁺从而用于C1结构域的折叠(图2A)。与只含有内源性PKC的细胞相比，这种突变消融了激动剂刺激的活性，FRET比率较低(图2B)。这种低激动剂诱导(图2B)和基础活动(图S1A)表明该突变体对全球PKC输出呈显性负向。在头颈癌患者体内，一个突变改变了控制DAG亲和力所需的关键残基（PKCαW58L），但没有改变佛波酯(Dries等人，2007年) (图2A)。这种突变也消除了DiC8-诱导的活性，但保留了PDBu诱导的一些活性，这与该残基选择性调节DAG亲和力一致(图2B)。由于膜易位是cPKC同工酶激活的先决条件，我们使用FRET比较了YFP标记的WT和突变的PKC与膜靶向CFP的易位(Antal等人，2014年)。DiC8，佛波酯刺激后任一残基受损易位的突变(图2C)或天然激动剂UTP(图2D)解释了这些激动剂无法激活突变体的原因。最后，我们问这些突变如何影响PKC的磷酸化过程。PKCαH75Q（而非W58L）未磷酸化，可能是因为H75Q突变体错误折叠的C1A结构域阻止了其处理(图2E)。PKCα（G61W）、PKCβ（G61W）和PKCγ（Q62H）的C1A结构域中的另外三个突变也表现出激动剂诱导的PKC活性降低(图S1B-S1D)。我们对9个C1结构域突变的分析表明，有5个活性降低或消失，而没有一个活性过度(表1和S1（第一阶段）)。通过改变PKC功能所需的两个关键输入来实现失活：与DAG结合的中断或磷酸化处理。

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图2

调控C1和C2结构域中的PKC突变是LOF

（A） PKCγ（PDB 2E73）C1A结构域的溶液结构，显示了与Zn配位的相应PKCαHis75残基²⁺和PKCαTrp58。

（B） 在共同表达CKAR和mCherry-tagged WT、突变PKCα或无外源性PKC（内源性）的COS7细胞中，CKAR读出的代表DiC8-（10μM）和PDBu-（200 nM）的正常FRET比值变化（平均值±SEM）诱导的PKC活性。

（C） （左）在基础和PDBu处理条件下（200 nM；15 min）显示的PKC同工酶的代表性YFP图像，显示WT（而非突变PKCα）重新定位到膜。（右）标准化FRET比率变化（平均值±SEM），量化用10μM DiC8刺激后YFP标记的PKCα蛋白向膜靶向CFP的易位，然后用200 nM PDBu刺激。

（D） UTP（100μM）刺激后，正常FRET比率变化（平均值±SEM）显示PKC易位。

（E） 免疫印迹显示所示YFP标记的PKCα蛋白的磷酸化状态。

（F） PKCγ（PDB 2UZP）C2结构域的晶体结构，突显Ca中Asp193和Asp254残基²⁺结合。

（G） 正常化FRET比率变化（平均值±SEM）显示CKAR在细胞内Ca升高时读出的PKC活性²⁺先用他必佳（5μM）刺激，然后用PDBu（200 nM）刺激。

（H） 归一化FRET比率变化（平均值±SEM）显示，在用thapsigargin（5μM）和PDBu（200 nM）刺激COS7细胞后，YFP标记的PKCγ构建体向膜定位的CFP移位。将数据归一化为每个细胞的最大易位幅度，然后使用公式从0缩放到1：X=（Y−Ymin）/（Ymax−Y最小），其中Y=归一化FRET比率，Ymin=Y的最小值，Ymax是Y的最大值。

（一） 正常化的FRET比率变化显示，在共表达膜靶向CFP并用10μM组胺刺激的HeLa细胞中，YFP标记的WT PKCγ（而非PKCγ突变体D193N和D254N）发生振荡移位。数据是来自三个独立实验的单个细胞的代表性痕迹。

另请参见图S1.

cPKC同工酶的C2结构域也对激活至关重要，因为它介导钙²⁺-依赖性预靶向质膜，在质膜上这些同工酶结合DAG并被激活(牛顿，2003)。在PKCγC2结构域（D193N）中发现的一个突变存在于结直肠癌、卵巢癌和黑色素瘤中。另一种（D254N）在子宫内膜癌和卵巢癌中发现。因为这两种天冬氨酸残留(图2F)坐标Ca²⁺(梅德科娃和乔，1998年)，我们监测细胞内Ca升高时它们的激活²⁺与thapsigargin，一种肌/内质网钙²⁺-ATP酶抑制剂(罗杰斯等人，1995年)。与WT PKCγ相比，两个突变体均未被激活(图2G)也没有转位到质膜(图2H)添加thapsigargin后，与钙受损一致²⁺结合。然而，这两个突变体都对佛波酯保持完全反应，与未受损的C1结构域一致。进一步证实突变体不能结合Ca²⁺，我们监测组胺诱导的振荡钙刺激的PKC振荡移位²⁺HeLa细胞释放(小提琴等，2003年)。虽然WT PKCγ在一些细胞中表现出振荡移位，但C2域突变体对组胺无反应(图2I)。因此，这些C2结构域突变抑制PKCγ活性，因为它们阻碍钙²⁺结合。不直接参与Ca的其他两个C2结构域残基的突变²⁺结合（PKCγT218M和PKCαG257V）也引起LOF(图S1D和S1E); PKCαG257V是LOF，因为它没有被磷酸化处理(图S1F)，而其余C2域突变体为（数据未显示）。我们对6个C2结构域突变的分析显示有4个LOF突变，没有过度激活的突变(表1和S1（第一阶段）).

激酶结构域PKC突变是LOF

接下来我们评估了21个激酶结构域突变，其中两个在结直肠癌中位于PKCδ：D530G内，在头颈癌中位于P568A内(图3A)。Asp530起着激酶调节棘的锚定作用，激酶调节棘是真核激酶的一种高度保守的结构元件(Kornev等人，2006年；Kornev等人，2008年); 毫不奇怪，D530G突变体是激酶死亡的，没有通过磷酸化启动(图3B和3C)。保守的Pro568突变为Ala也阻止了对天然激动剂刺激的反应，但保持了一些PDBu刺激的活性，因为该突变体的一小部分被磷酸化(图3B和3C).

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图3

激酶结构域PKC突变是LOF

（A） PKCβII（PDB 2I0E）激酶结构域的晶体结构，突出癌相关残基和调节棘（黄色空间填充）。

（B） 正常化FRET比率变化（平均值±SEM）显示COS7细胞中PKCδ结构的PKC活性，共同表达质膜靶向的PKCδ特异性报告蛋白PM-δCKAR。用UTP（100μM）刺激细胞，然后用PDBu（200 nM）刺激。

（C） PKCδWT和突变体磷酸化状态的免疫印迹分析。

（D） mCherry标记的PKCηWT或突变体的代表性mCherry图像显示在基础条件下和向COS7细胞添加200nM PDBu后15分钟的定位。

（E） （左）免疫印迹显示PKC底物磷酸化。用4μM Gö6976预处理过度表达所示结构的COS7细胞10分钟，以抑制cPKC同工酶，然后用200 nM PDBu刺激或不刺激COS7，以激活nPKC同功酶。（右）免疫印迹定量，并归一化为总PKCη水平和微管蛋白（右）。数据表示三个独立实验±SEM的平均值。采用重复测量的单因素方差分析（ANOVA）和事后邓内特（Dunnett）的多重比较试验对基础活动和刺激活动进行比较*与WT组相比，p<0.05。

（F） mCherry-tagged PKCηWT和突变体磷酸化状态的免疫印迹分析。

（G） 标准化FRET比率变化（平均值±SEM）表明，在200 nM PDBu刺激下，COS7细胞共同表达CKAR和RFP标记的PKCγ突变体的PKC活性。

（H） 免疫印迹显示PKCγWT和P524R磷酸化。星号表示磷酸化和破折号非磷酸化PKCγ。

（一） 正常化FRET比率变化（平均值±SEM）显示共同表达CKAR的COS7细胞中PKCβII构建物的PKC活性。用UTP（100μM）刺激细胞，然后用PDBu（200 nM）刺激。

（J） 免疫印迹显示mCherry-tagged PKCβII WT和突变磷酸化。星号表示磷酸化和破折号非磷酸化PKCβII。

另请参见图S1.

引人注目的是，所检测的所有三种PKCη突变（K591E、R596H和G598V）在刺激前通过在质膜上预先定位改变了其亚细胞定位(图3D)。然而，尽管构成膜相关，这些突变体降低了磷酸化-（Ser）PKC底物抗体读出的基础和刺激活性(图3E)因为它们不是通过磷酸化处理的(图3F)。我们之前已经证明，未处理的nPKC同工酶暴露了C1结构域，这些结构域诱导了构成膜的结合(Antal等人，2014年).

在与底物结合和激酶变构活化有关的高度保守的APE基序中存在许多突变(Kornev等人，2008年)。PKCγP524R和PKCβA509V突变通过阻止加工磷酸化而阻断活性，两者均表现出显性负性作用(图3G–3J)。PKCβA509T（结直肠癌）对UTP的反应也表现出功能丧失，但被强效配体PDBu适度激活(图3I)可能是因为有一小部分被磷酸化了(图3J)。在APE基序（E421K；图S1G).

进一步分析显示，我们分析的21个激酶域突变中有16个突变(表1和S1（第一阶段）)导致全部或部分LOF，大多数通过磷酸化阻止处理。例如，PKCαF435C、PKCαA444V、PKCβII Y417H、PKC？II G585S和PKCγG450C的磷酸化功能受损，活性降低(图S1C–S1F和S1H–S1J)。然而，在磷酸化维持的病例中也观察到部分LOF突变-PKCαD481E(图S1B和S1F)和PKCγF362L(图S1D和S1J)这表明这些突变可能会降低PKC的固有催化活性。

癌症相关PKC突变大多为LOF

我们对8个PKC基因中存在的46个突变的分析显示，其中约61%（28）是LOF，没有一个是激活的(图4A)。缺乏对激活突变的鉴定并不是我们分析的产物，因为增加PKC对DAG亲和力或降低自身抑制的激活PKC突变很容易被检测到（数据未显示）。LOF突变发生在cPKC（α，β，γ），nPKC（δ，ε，η）和aPKC（ζ）同工酶中，并发生在C1，C2和激酶结构域以及假底物和C末端尾部(图4B)。例如，PKCγG23E假底物突变不是通过磷酸化处理的(图S1J)因此缺乏UTP刺激的活性(图S1D)PKCεR162H假底物突变显示激动剂刺激和基础活性降低(图S1K和S1L)。PKCβP619Q C末端尾部突变，位于加工所需的保守PXXP基序内(Gould等人，2009年)也是LOF，因为它阻止了PKC磷酸化(图S1H)。总的来说，PKC LOF通过多种机制发生，最常见的是通过阻止加工磷酸化或配体结合，因此，没有功能丧失的突变热点。然而，我们发现了7个LOF突变“热点”(Sun等人，2007年)属于PKC-1在假底物中的高度保守区域和激酶结构域中的6个高度保守区域(图4C)。因此，失活突变以保守的调控元件为靶点，并经常击中相同的残基，而与WT无差异的突变则更随机发生(表S1).

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图4

PKC突变大多为LOF

（A） 研究的PKC突变的功能影响饼图，亮红色代表缺乏活性的突变，中红色代表对生理刺激（DAG或Ca）无反应的突变²⁺但对非生理性佛波酯有一些反应，淡红色表示与相应的WT同工酶相比，对生理刺激表现出活性降低的突变，蓝色表示与相应WT PKC同工酶没有差异。

（B） cPKC、nPKC和aPKC同工酶的结构域，覆盖着同工酶颜色编码的LOF突变。

（C） PKCβII（PDB 2I0E）激酶结构域的晶体结构，突显在各种PKC同工酶内至少四个肿瘤样本中突变的“温锅”残基。

（D） 描绘各种癌症中每个PKC同工酶的突变百分比的条形图。

对最常携带PKC突变的癌症类型的分析表明，尽管PKC同工酶在许多癌症中发生突变，但PKC突变在某些癌症中富集(图4D)。也就是说，PKC同工酶在20%–25%的黑色素瘤、结直肠癌或肺鳞癌中突变，但在<5%的卵巢癌、胶质母细胞瘤或乳腺癌中突变(Cerami等人，2012年；Gao等人，2013年)。此外，nPKC同工酶在胃肠道癌症（胰腺癌、胃癌和结直肠癌）中最常见的突变，与黑色素瘤和肺癌相比，胃肠道癌症的突变负担较低，这突出了它们在这类癌症中的重要性(图4D)。大多数PKC突变是杂合的，特征突变的等位基因频率从0.05到0.67不等(表1和S1（第一阶段）)。这表明PKC突变可能是肿瘤异质性的躯干事件，存在于肿瘤内的大多数细胞中，也可能是肿瘤发展到更具侵袭性阶段后在肿瘤发生过程中获得的鳃事件。这与PKC突变是共同驱动事件一致，共同驱动事件增强了由主要驱动因素介导的肿瘤发生。

显性负性PKCβ突变具有肿瘤生长优势

由于检测的大多数PKC突变是LOF，我们测试了是否可以通过过表达WT PKCβII来拯救在PKCβC2结构域中具有杂合LOF移码突变的HCT116结肠癌细胞。这导致了凤尾鱼非依赖性增长的大幅下降(图S2A)是细胞转化的标志。因此，我们接下来使用CRISPR/Cas9介导的基因组编辑来询问将内源性LOF等位基因还原为WT是否也能拯救细胞生长。我们使用DLD1结肠癌细胞，因为它们含有PKCβA509T LOF突变(图3I)评估杂合子LOF-PKC突变是否能带来生存优势，因为大多数癌症相关PKC突变都是杂合子。我们在三个等基因克隆中将突变恢复为WT(图S2B和S2C)并证实在前两个最有可能预测的偏离目标内不存在序列改变（数据未显示）。内源性PKCβ中A509T突变的校正(PRKCB公司)等位基因导致PKCβ水平轻微但可重复地增加，PKCα水平增加了2倍以上，尽管二者均未达到统计显著性(图5A)。用磷酸化-（Ser）PKC底物抗体进行的免疫印迹分析显示校正细胞中的基础PKC活性显著升高(图5B)。这与DLD1亲代细胞由于LOF PKCβ突变和较低的PKCα水平而降低PKC活性一致。接下来我们测试了这些细胞悬浮生长的能力。与PKC活性较高和肿瘤抑制表型较多相一致，校正细胞在悬浮液中的存活率较低(图5C)因为当DLD1亲本细胞形成时，它们不太能够形成紧密的多细胞聚集体(图5D)。此外，修正后的克隆降低了凤尾鱼的非依赖性生长潜力(图5E)。这些结果证实了从过度表达PKCβII的HCT116细胞获得的结果，表明PKCβ活性的部分丧失是在软琼脂中生长所必需的。然而，在2D增殖试验中，DLD1校正细胞的增殖速度与DLD1亲代细胞相似(图S2D)这表明，这些细胞之间的差异不是增殖速度，而是它们在没有锚定的情况下生长的能力。

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图5

杂合子LOF-PKCβ突变的校正降低了软琼脂、悬浮液和异种移植模型中的生长

（A） DLD1细胞中PKCβII、PKCα和GAPDH水平的免疫印迹（左）和定量（右；平均值±SEM）。

（B） 磷酸化-（Ser）PKC底物的免疫印迹（左）和定量（右；平均值±SEM）。采用重复测量单因素方差分析（ANOVA）和事后Dunnett多重比较测试进行比较*与DLD1亲代细胞相比，p<0.05。数据代表三个独立的实验±SEM。

（C） 在三个独立实验的悬浮液中72小时后，通过台盼蓝排除试验评估相对活细胞数（平均值±SEM）。采用单因素方差分析和事后Dunnett多重比较检验进行比较***与DLD1亲代细胞组相比，p<0.001。

（D） 悬浮培养24小时的DLD1细胞的典型相位对比图。

（E） （左）软琼脂集落形成试验。（右）三到六个独立实验中直径≥50μm菌落的菌落面积量化（平均值±SEM）。采用单向方差分析和事后Tukey多重比较测试进行比较****与DLD1亲代细胞组相比，p<0.0001和***p<0.001。

（F） 肿瘤生长表示为平均肿瘤体积（mm^三)±SEM，红色代表注射DLD1亲本细胞的小鼠的数据（A509T/WT；五只小鼠），紫色代表三个校正克隆的平均值（总共17只小鼠）。对每个时间点采用双尾、非配对学生t检验进行比较**p<0.005和***p<0.0005。

（G） （顶部）来源于DLD1细胞的肿瘤的TUNEL染色载玻片的代表性场。（底部）TUNEL阳性细胞核定量（平均值±SEM）。采用单因素方差分析和事后Dunnett多重比较测试进行比较****与DLD1亲代细胞组相比，p<0.0001。

另请参见图S2.

为了确定PKC是否显示单倍体不足，我们利用基因组工程创建移码缺失，剔除DLD1细胞中突变的PKCβ等位基因(图S2E)。这个半合子克隆（WT/-23）仅包含一个WT等位基因，因此表达较低的PKCβII水平(图S2F)与含有两个WT等位基因的基因相比，PKCβII表现出显著增加的锚定非依赖性生长潜能，表明PKCβⅡ对肿瘤抑制是单倍体足够的(图5E)。此外，PKCβ半合子细胞在软琼脂中的生长不如PKCβA509T突变细胞，表明这种突变具有显性负效应。

为了确定杂合LOF PKCβ突变是否促进体内肿瘤生长，将DLD1亲代或校正细胞皮下注射到裸鼠的侧翼，并监测肿瘤生长。与我们的细胞数据一致，来自校正细胞的肿瘤明显小于来自DLD1亲代细胞的肿瘤(图5F和S2G公司)。通过肿瘤切片的TUNEL染色评估，这种生长减少与凋亡增加相关(图5G)。这些数据表明，杂合子、显性负性PKCβ突变可以显著增加肿瘤生长，从而确立PKCβ作为肿瘤抑制因子。

讨论

在此，我们确定针对PKC的临床试验基于错误的假设；抑制肿瘤生长的不是PKC的失活，而是活化。因此，我们建议治疗应以恢复PKC信号输出的机制为目标，而不是减少其。我们的综合分析表明，61%的PKC突变特征为LOF，没有激活。我们没有考虑无义突变或缺失，所以更高比例的PKC突变是LOF。为了验证我们的数据，之前已经描述了另外三种LOF-PKC突变。在三种类型的癌症中发现了LOF PKCα突变（C2域中的D294G）(Alvaro等人，1993年；Prévostel等人，1997年；Zhu等人，2005年)在结直肠癌中发现了LOF PKCζ突变（激酶域中的S514F）(Galvez等人，2009年)。三种不同癌症中存在的PKCⅠ（R471C）的部分LOF突变破坏了底物结合并导致上皮极性异常(Linch等人，2013年)。据我们所知，在癌症中没有观察到获得功能的PKC突变。在PKC家族和各种癌症中LOF突变的鉴定支持了PKC同工酶作为肿瘤抑制剂的一般作用。

引人注目的是，一些LOF PKC突变（例如，PKCβA509V、PKCγP524R和PKCαW58L、H75Q和G257V）通过降低全球内源性PKC活性以显性-阴性方式起作用。此外，DLD1细胞中突变的PKCβA509T蛋白降低了PKCα水平。这种交叉PKC显性负效应的一个机制是LOF-PKC损害其他PKC的启动磷酸化，从而降低其稳态水平。之前的一项研究证明，未经处理的激酶缺失PKC同工酶可以阻止其他PKC同功酶的磷酸化，这可能是因为它们的磷酸化需要共同的可滴定成分(Garcia-Paramio等人，1998年)。研究表明，激酶导向的PKC同工酶以显性负向方式发挥作用，对细胞产生致瘤效应，从而证实了LOF突变的显性负向作用(Galvez等人，2009年；Hirai等人，1994年；Kim等人，2013年；Lu等人，1997年)。重要的是，尽管一些PKC突变为显性阴性，但无义突变或基因缺失导致的PKC丢失也具有生长优势(图5E)，表明PKC对肿瘤抑制具有单倍性。

PKC基因敲除小鼠模型和细胞研究支持PKC的抑瘤作用。PKCα缺乏(普尔科卡^−/−)小鼠敲除小鼠发生自发性肠道肿瘤(Oster和Leitges，2006年)。在APC中^最小值/+背景，PKCα的缺失诱导了更具侵袭性的肿瘤，并降低了生存率(Oster和Leitges，2006年)在致癌Kras的背景下，PKCα缺失增加了肺肿瘤的形成(Hill等人，2014年)。PTEN单倍体小鼠PKCζ的缺失导致APC中更大、更具侵袭性的前列腺肿瘤和肠道肿瘤的发生^最小值/+背景(Ma等人，2013年)。敲除结肠癌细胞PKCδ促进裸鼠肿瘤生长(Hernández-Maqueda等人，2013年)。相反，PKC的过度表达显示了保护作用。PKCβI在结肠癌细胞中的再表达(Choi等人，1990年)角质形成细胞中PKCδ的或(D'Costa等人，2006年)或PKCζ在结肠癌细胞中的过度表达(Ma等人，2013年)或Ras转化成纤维细胞(Galvez等人，2009年)裸鼠致瘤性降低。

临床数据显示，与同源正常组织相比，肿瘤组织中PKC蛋白水平和活性较低，也支持PKC的抑瘤作用。与正常粘膜相比，人类结直肠癌中的总PKC活性显著降低，因为PKCβ和PKCδ降低(Craven和DeRubertis，1994年)或PKCβ和PKCε蛋白水平(Pongracz等人，1995年)。60%的人结直肠癌中PKCα蛋白下调(Suga等人，1998年)肾癌中PKCζ下调(Pu等人，2012年)和非小细胞肺癌(Galvez等人，2009年)。PKCβ和PKCδ水平降低与膀胱癌分级增加相关(Koren等人，2000年；Langzam等人，2001年；Varga等人，2004年)PKCδ水平降低与子宫内膜癌和胶质瘤分级增加相关(雷诺等人，2008年；Mandil等人，2001年)。PKCη在结肠癌和肝细胞癌中表达下调，且PKCη的低表达与较低的长期生存率相关(Davidson等人，1994年；Lu等人，2009年)。然而，在某些癌症中观察到PKCι蛋白和DNA拷贝数水平增加(Perry等人，2014年；Regala等人，2005年)。PKCⅠ是3q26扩增子的一部分，其DNA拷贝数的增加与mRNA表达的增加相关(图S3)。然而，DNA拷贝数和mRNA水平与cPKC基因无关(图S3)。事实上，对于PKCα，拷贝数水平与乳腺癌中的蛋白质水平呈负相关(Myhre等人，2013年)PKCα扩增最快的癌症(Cerami等人，2012年；Gao等人，2013年)。许多研究报告癌症中其他PKC基因的mRNA表达增加；然而，mRNA表达和蛋白质水平往往相关性很差(Myhre等人，2013年)。因此，这类临床数据与PKC同工酶的抑瘤功能相一致，尽管PKC l可能存在上下文特定的例外。

最近发现，PKCδ的种系LOF突变是自身免疫性淋巴增生综合征和系统性红斑狼疮（与获得癌相关表型相关的疾病）的病因驱动因素，支持PKC在人类中的真正抑瘤作用(Belot等人，2013年；Kuehn等人，2013年；Salzer等人，2013年)。这两种疾病的特征都是B细胞增殖增加和凋亡减少(Belot等人，2013年；Kuehn等人，2013年)患者经常发生淋巴瘤(Bernatsky等人，2005年；Mellemkjaer等人，1997年)。此外，我们发现LOF PKCδ突变的同胞纯合子降低了PKCζ水平（数据未显示），支持LOF突变的显性负作用。

PKC活性降低如何促进肿瘤发生？一种可能是PKC同工酶通过抑制致癌基因的信号或稳定肿瘤抑制因子来抑制致癌信号。支持这一观点的是，对含有PKC LOF突变的肿瘤样本进行无偏见的生物信息学分析，结果显示TP53型（p53）是肿瘤中最常见的突变基因之一，每个PKC同工酶都有LOF突变(表2)。PKC可能通过稳定WT蛋白来促进p53的抑瘤功能。大量证据表明，PKCδ磷酸化可稳定p53，从而促进细胞凋亡(Abbas等人，2004年；Yoshida等人，2006年)但其他PKC同工酶的作用尚不清楚。KRAS公司在7种PKC同工酶的PKC突变癌症中，也是前10个突变基因之一(表2)特别是Gly12突变(表S3)。这说明PKC可能会抑制Kras信号传导，因此Kras需要失去PKC才能发挥其全部致癌潜能。与此一致，PKC通过Ser181的磷酸化调节Kras的活性和定位(Bivona等人，2006年)。尽管这个磷酸化位点在肿瘤中的作用仍然存在争议(Barceló等人，2014年)，我们的分析与PKC丢失增强其致癌潜能一致。事实上，我们检测中使用的DLD1和HCT116细胞含有致癌Kras突变（G13D），这是这些细胞在软琼脂中生长所必需的（数据未显示）。这表明LOF-PKC突变不是主要的癌症驱动因素，而是共同驱动因素，有助于癌症进展。

我们还分析了哪些激酶或癌症普查基因（与癌症有关的基因）在含有PKC突变的肿瘤中与缺乏PKC变异的肿瘤中显著更常见的突变（>15倍）(表S4)。这使我们能够识别可能是PKC重要共同驱动因素或代表新的遗传依赖性的蛋白质。抑制Hippo通路的肿瘤抑制因子LATS2，以及非小细胞肺癌细胞锚定非依赖性生长和侵袭所需的激酶ROCK1和ROCK2，是在含有PKC突变的肿瘤中显著富集的前20个突变蛋白之一(表S4)。我们的分析表明，在缺乏PKC信号的情况下，可能需要这些基因的获得性功能突变来促进肿瘤的发生。我们还对肺癌、结直肠癌或黑色素瘤中经常与PKC共突变的癌症特异性基因进行了分析。这表明三种癌症之间以及三类PKC同工酶之间的共突变基因几乎没有重叠(表S5)表明单个PKC同工酶在不同的癌症中调节不同的通路。有趣的是，PKC突变负荷高的癌症，如黑色素瘤和结直肠癌，PKC扩增很少。相反，PKC扩增率较高的癌症，如乳腺癌和卵巢癌，PKC突变很少(Cerami等人，2012年；Gao等人，2013年)与PKC突变在乳腺癌和卵巢癌中的作用较小或不同相一致。

上述数据提供了一种机制，解释了为什么在癌症临床试验中抑制PKC被证明是不成功的，而且实际上是有害的：不是功能获得，而是LOF带来了生存优势。因此，治疗策略应以恢复PKC活性的方式为目标。PKC激动剂Bryostatin-1也不能作为治疗药物，事实上，它在宫颈癌中表现出对抗治疗作用(Nezhat等人，2004年)可能是因为它下调PKC(Szallasi等人，1994年)。因此，激活PKC而不下调PKC的策略具有重要的临床潜力。这项研究的一个重要分支是，抑制PKC加工蛋白的药物会导致PKC丢失。值得注意的是，目前临床上使用的mTOR和HSP90抑制剂(Don和Zheng，2011年；内克斯和工人，2012年)，阻止处理PKC(Gould等人，2009年；Guertin等人，2006年)因此会对消除其抑癌功能产生不利影响。鉴于PKC同工酶是致癌信号的刹车，而不是主要驱动因素，恢复PKC活性必须伴随其他化疗药物。我们发现PKC活性降低会促进肿瘤生长，这对抑制癌症中PKC同工酶的概念提出了挑战，并强调了恢复或稳定细胞中PKC活性的治疗方法的必要性。

实验程序

补充材料

致谢

脚注

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