蛋白激酶Cδ缺乏导致孟德尔系统性红斑狼疮伴B细胞缺陷性凋亡和过度增殖

单核苷酸多态性（SNP）绘图、序列捕获和测序

对受试者V-1、V-2、V-3和V-4进行全基因组扫描。使用Affymetrix基因芯片Genome-Wide Human SNP Array 6.0生成基因型。使用SNPsetter程序将数据集整理并标准化为单个最近的基因组构建（GRCh37/hg19）(http://dna.leeds.ac.uk/snpsetter/)，并使用AutoSNPa对合并数据进行分析(http://dna.leeds.ac.uk/autsnpa/)。进行连锁分析时，假设常染色体隐性遗传，疾病等位基因频率为0.001，外显率完全，标记等位基因的频率相等。使用Merlin链接包计算优势对数（LOD）得分(网址：www.sph.umich.edu/csg/abecasis/Merlin).

对于全基因组分析，在3μg从受试者V-1外周血中提取的DNA。使用SureSelect人类全外显子试剂盒第2版（安捷伦）对应用生物系统SOLiD系统进行富集。对得到的样本库进行电子聚合酶链反应（PCR），然后在SOLiD 4系统（生命技术）上进行测序。序列数据使用SOLiD BioScope软件（Life Technologies）和GRCh37/hg19 Human Genome作为参考进行绘制。使用BioScope软件套件中的diBayes工具，以中等严格度设置调用SNP，然后过滤那些覆盖率小于5倍的SNP。共有78%的读码与基因组参考唯一对应，75%的靶向外显子覆盖10倍或更高。平均而言，整个外显子组的覆盖率达到82倍（见补充表1，可在关节炎和风湿病网站位于http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/art.38008/摘要)。突变筛选PRKCD公司通过PCR扩增基因组DNA片段，并使用BigDye终止剂化学和3130测序器（应用生物系统）对产物进行直接测序。突变描述基于参考互补DNA（cDNA）序列ENST00000330452，ATG起始位点位于第3外显子的起始处，终止密码子位于第19外显子。

蛋白质表达

使用效应试剂（Qiagen）对HEK 293T和H157细胞系进行瞬时转染。转染后，细胞在缓冲液1中溶解（50 mmoles/升磷酸氢二钠[pH7.5]，1 mmole/l焦磷酸钠，20 mmole/L氟化钠，2 mmoles/l EDTA，2 mmols/升EGTA，1%十二烷基硫酸钠[SDS]，蛋白酶抑制剂混合物[Roche]），在12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶（Bio-Rad）上分离裂解产物。对于淋巴母细胞系（LCL），用10 mM（M）EDTA–含有蛋白酶抑制剂的放射免疫沉淀分析缓冲液（罗氏）。蛋白质表达通过使用下文所述抗体和浓度进行蛋白质印迹分析。

PKC抗体δ，磷酸-PKCδ（T507），磷-PKCδ（S645），磷-PKC（pan）(βII Ser662）和磷酸化-MARCKS（S152/156）购自Cell Signaling Technology（均以1:1000稀释度使用）。抗磷酸化MARK2（T595）抗体（1:1000）购自Abcam，抗微管蛋白抗体（1:100）和β-肌动蛋白（1:14000）购自Sigma。辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG或山羊抗小鼠IgG购自细胞信号技术公司。使用Pierce ECL Western Blotting基板检测到信号。对于佛波酯-肉豆蔻酸酯（PMA）处理，用500 nM（M）转染后24小时的PMA（Promega），1分钟或5分钟后裂解。人PKC的蛋白质序列δ与小鼠中674个残基的长度相比。这是由于在人体305和306位氨基酸中存在2个额外的残基。文献中存在这两种常用序列之间的命名差异，例如，Tyr³¹³可以称为Tyr³¹¹反之亦然。为了避免当前研究中与此相关的任何混淆，我们仅根据人类序列对残留物进行编号。

结构建模

PKC的同调建模δ酪氨酸激酶结构域基于PKC的晶体结构θ（PDB 1XJD；该域上73%同源）并使用Schrodinger Suite 2012/Maestro9.3.5执行。

克隆和突变

对全长PKC进行突变δ穿梭克隆（IOH26352；Invitrogen Ultimate Open Reading Frame）使用QuikChange定点突变试剂盒（Agilent）通过进行相应的核苷酸改变生成G510S、K378M和D491A。所用引物如下：对于G1528A，正向5′-CAGCACCTTCTGCAGCACCCTGACTAT-3′，反向5′-ATAGTCAGGGTGCCAGAAGGTGTGG-3′；对于A1472C，正向5′-CACACATCAAGATGTCCGCCT-TTGGGATGTGCAAAG-3′，反向5′-CTTTCACACC AAAGGCGGCACATCTTGTGGG-3′；对于A1133T，正向5′-GAGGAGTACTTGCCATGGCCCCTCA-AGA-3′，反向5′-TCTTGAGCCATAGT-ACTCCTC-3′。使用Gateway LR克隆酶II（Invitrogen）将克隆转移到血凝素目的载体。

逆转录酶-PCR（RT-PCR）

根据制造商的协议，使用Qiagen OneStep RT-PCR试剂盒进行RT-PCR。使用RNeasy迷你试剂盒（Qiagen）从患者LCL和野生型293T细胞系中提取RNA。每个反应使用20毫微克RNA。PCR的循环条件如下：cDNA合成和预变性（50℃下1个循环30分钟，然后95℃下15分钟），PCR扩增（95℃下28个循环变性30秒，55℃下退火30秒，68℃下延伸60秒），最后在72℃下延伸10分钟。PCR产物在1%琼脂糖凝胶上电泳，并在紫外线下用溴化乙锭进行可视化。底漆PRKCD公司由Eurofins MWG Operon合成，引物用于GAPDH公司由集成DNA技术合成。这些引物的序列如下：PRKCD1项目（648 bp），正向5′-TCTGTCCGTGAAGATGAAG-3′，反向5′-CAACTACATGAGCCCCACCT-3′；对于PRKCD公司2（429 bp），正向5′-GCCTCAACAGCAAGGCTAC-3′，反向5′-CAGCAACTCCCGGTCTTC-3′；对于GAPDH公司（668 bp），正向5′-CAAGTGAGAAGGCTGGGG-3′，反向5′-CIAAGTTGTCATGGACC-3′。通过凝胶提取纯化RT-PCR产物，并通过Sanger测序对293T细胞进行序列测定。

B细胞纯化

血样取自法国血站（健康成人献血者）或患者及其家属。通过Ficoll（Eurobio）密度梯度离心分离外周血单个核细胞（PBMC），然后通过Percoll（GE Healthcare）密度梯度离心机分离淋巴细胞。根据制造商的建议（EasySep人类B细胞富集试剂盒；StemCell Technologies），通过使用磁珠的阴性选择进行B细胞富集。流式细胞术测定，分离的CD19+B细胞纯度始终>95%。纯化的B细胞在添加10%（体积/体积）热灭活胎牛血清（Lonza）的RPMI 1640（Life Technologies）中培养，10 mM（M）HEPES pH 7.5（Life Technologies），2米M（M）谷氨酰胺（生命科技公司）和0.04 mg/ml庆大霉素（生命科技）。

LCL生成

使用标准方案，通过体外感染Epstein-Barr病毒实验室株（B95-8细胞株），从家庭成员的PBMC中产生LCL（CBC Biotec Centre de Ressource Biologique，Hospices de Lyon）(20)属于MAI-Lupus系列。细胞保存在RPMI 1640（生命技术）中，补充12%热灭活胎牛血清（Lonza），10 mM（M）HEPES pH 7.5，2 mM（M）37°C、5%CO的增湿空气中的谷氨酰胺、0.04 mg/ml庆大霉素和0.250 mg/ml真菌酮（均来自Life Technologies）₂.

增殖试验

评估细胞分裂，2×10⁵细胞与10个微米5,6-羧基荧光素二乙酸丁二酰酯（CFSE；分子探针）在37°C下保持12分钟，然后在冷培养基中洗涤两次。细胞重新悬浮在补充2.5的培养基中μg/ml抗F（ab′）₂（杰克逊免疫研究），1μg/ml CD40L，在1μg/ml增强子（酶生命科学）和2.5μg/ml CpG寡脱氧核苷酸2006（5′-TCGCGTTTGTCGTGTTGTCGTT-3′）全硫代磷酸（克分子量[GMW]）。培养96小时后，用FACSCalibur流式细胞仪（BD Biosciences）评估CFSE染色，并用FlowJo软件（Tree Star）分析数据。

细胞凋亡测定

在单独培养基中培养的原代CD19+B细胞或LCL的活性，2.5μg/ml Toll样受体9（TLR-9）配体CpG 2006（GMW），或10微米thapsigargin（一种诱导Ca的内质网泵抑制剂²⁺流入；Sigma）通过碘化丙啶和异硫氰酸荧光素（FITC）-共轭膜联蛋白V（BD Biosciences）联合标记进行评估，并通过流式细胞术和FlowJo软件进行分析。

流式细胞术分析

如前所述，通过流式细胞术测定过渡期、幼稚期、幼年期和记忆性B细胞亚群的百分比(13,20)。藻红蛋白（PE）偶联抗CD24、PerCP–Cy5偶联抗CD38、PE–Cy7偶联抗CD19和别藻蓝蛋白偶联抗CD5是从Beckman Coulter获得的，FITC-偶联抗CD27和PE偶联抗CD20是从BD Biosciences获得的，PE偶联抗人IgD是从Dako购买的。染色细胞在磷酸盐缓冲盐水中清洗，用1%多聚甲醛固定，并在24小时内进行分析。在FACSAria II流式细胞仪上采集样本，并使用FACSDiva软件（BD Biosciences）分析具有淋巴细胞光散射特性的细胞。如补充图1所示（可在关节炎和风湿病网站位于http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/art.38008/摘要)用PE-结合的抗CD20、FITC-结合的CD24和PerCP–Cy5结合的CD38（BD Biosciences）标记后，通过流式细胞术测定过渡期B细胞的百分比。数据通过FACSCalibur流式细胞仪（BD Biosciences）采集，并使用FlowJo软件进行分析。

LCL中的表型救援实验

慢病毒感染在24孔板中进行，接种0.2×10⁶8个细胞μg/ml聚布伦溶液。用pLenti6.3/V5-DEST-PKC转导从受试者V-1和V-2建立的LCLδG510S或野生型pLenti6.3/V5-DEST-PKCδ将板在37°C下以每分钟1800转的速度离心100分钟。然后将细胞重新悬浮在完整的RPMI 1640培养基中并培养7天，然后以0.01 mg/ml的浓度向培养基中添加短梗霉素（Sigma-Aldrich）。将产生的稳定的感染细胞系保存在补充短梗菌素的培养基中。PKC公司δ通过蛋白质印迹法测定转导的LCL中的表达。

B细胞克隆性和B细胞储备

根据标准方法进行B细胞克隆性和B细胞储备评估，这些方法在《补充方法》中有详细描述关节炎和风湿病网站位于http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/art.38008/摘要.

纯合子突变PRKCD公司通过靶向外显子组测序揭示

在受试者V-1、V-2、V-3和V-4中进行的全基因组SNP扫描确定了一个大小大于1.5 Mb的单一纯合子区域，该区域由3个受影响个体（V-1、V-3和V-4）共享，未受影响的同胞（V-2）未观察到。染色体3p21上该区域的连锁分析（rs7650998；46607255–rs864623；55735226）得出LOD评分为2.4。通过溶液内杂交和受试者V-1 DNA的大规模平行测序来进行全外显子组捕获。生成了大约5 Gb的序列，使得超过75%的GENCODE定义外显子组的编码碱基由至少10个读数表示（见补充表1，可从关节炎和风湿病网站位于http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/art.38008/摘要).

PRKCD公司使用这种调用策略，在染色体3p21上假定的5-Mb候选疾病基因区间内，仅2个基因显示纯合子非同义变异体（c.1528G>a；p.G510S）。Sanger测序仅证实了PRKCD公司变异，在所有3名受影响的患者中均为纯合状态(图1C)。父母双方都是变异的杂合子，而未受影响的兄弟姐妹是野生型纯合子。G510残基对PKC中的酵母高度保守δ正交曲线(图1D)并位于PKC的激活回路中δ(图1E)。这种氨基酸在AGC激酶家族中也是不变的(图1F)。dbSNP中未注释c.1528G>A替换(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/)，ClinSeq(http://www.genome.gov/20519355)和1000个基因组项目数据库(http://browser.1000genomes.org/index.html)在外显子变异体服务器上为该等位基因定型的13006条控制染色体中也没有(http://evs.gs.washington.edu/evs/)。SIFT分析将c.1528G>A的变化归类为有害（得分为0）(http://sift.jcvi.org/)而PolyPhen将该突变注释为“可能具有破坏性”（得分为1.0）(http://genetics.bw.harvard.edu/ph2/)。此外，PKC的x射线建模δ预测甘氨酸到丝氨酸的取代将导致蛋白质激活环的破坏(图1G)。识别其他SLE患者PRKCD公司，我们对其编码外显子和保守的内含子/外显子边界进行了测序PRKCD公司在230名受影响个体中，但没有发现任何可能的致病性变体（数据未显示）。

突变PKC的活性和稳定性δ

G510S突变体PKC的表达δHEK 293T和H157细胞中的突变蛋白在激活环（T507）处不能磷酸化(图2A)导致转位基序（S645）和疏水基序（C662）的磷酸化预期降低(图2A)。激酶活性突变体K378M和D491A的表达量也出现了类似的减少（参见补充图2，可从关节炎和风湿病网站位于http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/art.38008/摘要)。PKC活化需要这些位点的磷酸化δ(21)。与这些观察结果一致，突变蛋白在基础条件下是不活跃的，并且不能被传统PKC激动剂佛波酯-肉豆蔻酸酯醋酸盐激活，因为下游底物MARCKS和Mark2的磷酸化没有明显增加(图2A和B)。PKC缺乏磷酸化δ导致蛋白质稳定性丧失，因此突变PKCδ以比野生型蛋白质更快的速度降解(图2C)，而RNA表达没有改变(图2D)。与这些数据一致，所有3名G510S突变纯合子患者表达的PKC显著减少δ与野生型和杂合型亲属相比(图2E和F)。患者细胞还显示T507、S645和S662位点的磷酸化降低，以及PKC下游靶点Mark2缺乏激活δ(图2G).

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图2

G510S突变对PKC稳定性和功能的影响δ.A、，蛋白印迹显示G510S PKC中T507、S645和S662位点磷酸化较弱δ–转染和野生型PKCδ–转染H157和HEK 293T细胞。PKC的磷酸化δG510S没有增加底物MARCKS和Mark2。B、，Western blot显示在表达G510S-PKC的细胞中未诱导Mark2磷酸化δ佛波酯醋酸酯（PMA）刺激后5分钟。C、，野生型PKC的表达δ和G510S PKCδ转染后的构建体。野生型PKCδ转染后表达持续96小时，而G510S突变体在96小时时未被检测到，在72小时时表达水平显著降低。D、，G510S突变对PRKCD公司mRNA完整性。逆转录聚合酶链式反应检测PRKCD公司和GAPDH公司从受影响同胞V-4和V-1、其父代（IV-2）、未受影响同胞（V-2）和HEK 293T细胞建立的淋巴母细胞系（LCL）中提取的RNA。E类和F、，从家族成员中采集的LCL裂解物的Western blot分析表明，G510S突变患者表达的PKC水平较低δ并减少T507、S645和S662位点的磷酸化。G、，PMA刺激受试者V-2和V-3 LCL的效果。刺激不会诱发PKCδ纯合患者V-3的激活。请参见图1其他定义。

协会PRKCD公司从B细胞向未成熟B细胞表型转变的突变

G510S突变纯合子受试者V-1、V-3和V-4的淋巴细胞计数在发病时正常，B、T和自然杀伤细胞比例正常。然而，受试者V-1和V-4的未成熟CD19+CD21−B细胞数量增加(表1)。过渡性（CD19+CD24^高的CD38型^高的或CD19+IgD+CD38^高的)患者V-4中的B细胞也反复增加(图3A、3B和补充图2[可从关节炎和风湿病网站位于http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/art.38008/摘要]). 受试者V-1不可能进行类似的测量，因为正在进行淋巴细胞减少（并且没有来自受试者V-3的额外样本）。患者V-4的成熟IgD+CD38−B细胞仍表达CD5，这是一种公认的未成熟B细胞标记物(图3B)。有趣的是，杂合子成熟B细胞显示CD5的中间标记，表明PKCδ是完全成熟的原始B细胞分化所必需的。

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图3

B细胞亚群的荧光激活细胞分选（FACS）分析。A、，典型的FACS图显示，从受试者V-4（受累同胞）分离的外周血单个核细胞中的过渡B细胞百分比增加，但从健康供体（Ctl）或受试者IV-1（其杂合子携带者母亲）获得的外周血单核细胞中没有增加。根据流式细胞术的结果，将过渡期B细胞定义为CD24^高的CD38型^高的CD19+细胞内的数量。B、，通过naive（CD19+CD27−CD38）评估CD5表达^低的IgD+），早期（CD19+CD27−CD38^中间的IgD+）和过渡性（CD19+CD27−CD38^高的来自健康供体、受试者IV-1和受试者V-4的IgD+）B细胞。C、，受试者V-4中CD19+CD27+IgD+和CD19+CD27+Ig D−记忆B细胞数量减少，但健康受试者或受试者IV-1中没有。在受试者V-4中，IgD−CD27−记忆性B细胞的百分比没有变化，而IgD+CD27-原始B细胞的比例则显著增加。

我们还观察到，在受试者V-4中，CD19+CD27+IgD+和CD19+CD27+IgD−记忆B细胞的数量显著减少，但在其母亲（受试者IV-1）中没有，后者是杂合子携带者(图3C)。对B细胞库的评估表明，具有有限多样性（48%）的多克隆性（参见补充图3，可在关节炎和风湿病网站位于http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/art.38008/abstract)。T细胞对多克隆或特异性抗原的增殖反应正常，所有病例的免疫球蛋白水平均在参考值范围内(表1)，并且在受试者V-4中ABO等血凝素和疫苗反应正常（数据未显示）。

PKC之间的关联δ缺乏和B细胞增殖增加

在研究B细胞反应时，我们观察到从受试者V-4中新分离的初级CD19+B细胞极易发生自发细胞死亡；在表达野生型PKC的青少年型SLE患者的B细胞中，通常没有观察到这种作用δ并接受了类似的治疗。重要的是，已知能直接激活B细胞的TLR-9配体CpG可完全保护受试者V-4衍生的B细胞免于自发凋亡(图4A)。这些结果表明，PKC突变的B细胞δ对B细胞刺激有高度反应。支持这一假设，我们观察到受试者V-4及其杂合携带者母亲（IV-1）的外周血B细胞对BCR、CD40和TLR-9刺激的超增殖反应，并与健康对照受试者或青少年型SLE患者的B细胞进行比较(图4B和补充图4[可从关节炎和风湿病网站位于http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/art.38008/摘要]).

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图4

突变和表型逆转的功能特征。A、，从野生型（WT）健康献血者（Ctl）、受试者V-4、其母亲（IV-1）和年轻型系统性红斑狼疮（JSLE）野生型患者中分离出的存活CD19+B细胞的百分比。B细胞在单独培养基（开条）或Toll-like受体9配体CpG（实心条）存在下培养24小时。数值为平均值±SEM（n=16名健康献血者，3名青少年型SLE患者，以及受试者IV-1和V-4各3名独立样本）。B、，CD19+B细胞的增殖是对来自健康献血者、受试者V-4和IV-1以及青少年型SLE患者的B细胞的抗IgM、CD40L和CpG刺激的反应。数值为平均值±SEM（n=10名健康献血者，4名青少年型SLE患者，以及受试者IV-1和V-4各3名独立样本）。C、，在单独培养基（开条）或thapsigargin（实心条）存在下培养24小时后，从野生型健康献血者和受试者V-4和IV-1中分离出的存活CD19+B细胞的百分比。数值为平均值±SEM（n=10名健康献血者和2名独立样本，分别来自受试者IV-1和V-4。D类和E中，在抗IgM存在下培养24小时后，从受试者V-1、V-2、V-4或IV-1建立的淋巴母细胞系的特异性凋亡百分比(D类)或是萨普西加金(E类)。使用Dunnett校正的方差分析进行统计分析。符号代表单个数据点；水平线和误差条显示了平均值±SEM（n=6–9个独立实验）。F、，左，从未转导（NT）或用蛋白激酶C转导的受试者V-2和V-1中建立的LCL特异性凋亡百分比δ（PKCδ)G510S突变体构造（左）或PKCδ野生型构建（右）并与thapsigargin培养24小时。对，蛋白印迹显示PKCδ在相应的LCL中表达。通过配对双尾比较转导和非转导LCL的结果t吨-测试。NS=不显著。

由里昂公民收容所、意大利皇家医学研究所、医学康复基金会、罗纳阿尔卑斯地区和法国罗马托洛基协会（全部由贝洛特博士提供）的专项资金支持，并由法国皇家医学研究院和里昂大学（向博内福伊博士提供）提供的机构赠款支持。Gaffney博士的工作得到了NIH的支持（拨款RC2-AR-058959和R01-AI-063274）。Brognard博士的工作得到了英国癌症研究所（C5759/A12328）的支持。Crow实验室为本研究做出贡献的工作得到了欧盟第七框架计划（FP7/2007-2013项目NIMBL；241779）的资助。

我们要感谢家人对本文研究的合作，以及Nadia Plantier（ImmunID Technologies）的有益讨论。克劳博士向NIHR曼彻斯特生物医学研究中心致敬。Bonnefoy博士感谢SFR生物科学公司Gerland-Lyon Sud（UMS344/US8）的Plateforme de Cytométrie en Flux提供的技术援助。