Eos, MITF, and PU.1 recruit corepressors to osteoclast-specific genes in committed myeloid progenitors

doi:10.1128/MCB.01839-06

.2007年6月；27(11):4018-27.

doi:10.1128/MCB.01839-06。 Epub 2007年4月2日。

Eos、MITF和PU.1在骨髓祖细胞中招募破骨细胞特异性基因的共抑制因子

胡蓉（音）¹, Sudarshana M Sharma公司, 阿格涅斯卡·布罗尼兹, 鲁奇卡·斯里尼瓦桑, 乌玛·桑卡尔, 迈克尔·奥斯特罗斯基

附属机构

PMID： 17403896
预防性维修识别码：项目经理1900027
DOI（操作界面）： 10.1128/MCB.01839-06

Eos、MITF和PU.1在骨髓祖细胞中招募破骨细胞特异性基因的共抑制因子

荣虎等。分子细胞生物学. 2007年6月.

.2007年6月；27(11):4018-27.

doi:10.1128/MCB.01839-06。 Epub 2007年4月2日。

作者

荣虎¹, Sudarshana M Sharma公司, 阿格涅斯卡·布罗尼兹, 鲁奇卡·斯里尼瓦桑, 乌玛·桑卡尔, 迈克尔·奥斯特罗斯基

隶属关系

¹分子和细胞生物化学系和综合癌症中心，370A Tzagurnis医学研究机构，俄亥俄州立大学，420 West 12th Avenue，Columbus，OH 43210，美国。

PMID： 17403896
预防性维修识别码：项目经理1900027
DOI（操作界面）： 10.1128/MCB.01839-06

摘要

转录因子MITF和PU.1协同增加破骨细胞分化过程中组织蛋白酶K（Ctsk）和酸性磷酸酶5（Acp5）等靶基因的表达。我们表明，这些因子还可以抑制能够形成巨噬细胞或破骨细胞的髓样前体中靶基因的转录。MITF和PU.1与锌指蛋白Eos（Ikaros家族成员）的直接相互作用对于Ctsk和Acp5的抑制是必要的。Eos在靶基因启动子处与MITF和PU.1形成复合物，并通过共抑制因子CtBP（C末端结合蛋白）和Sin3A的募集抑制转录，但在破骨细胞分化过程中，Eos与Ctsk和Acp5启动子的结合显著降低。随后，MITF和PU.1向这些靶基因招募辅激活子，从而使靶基因得到稳健表达。骨髓源性前体细胞中Eos的过度表达扰乱破骨细胞分化并选择性抑制MITF/PU.1靶点的转录，而Eos的小干扰RNA敲除导致Ctsk和Acp5的基础表达增加。这项工作提供了一种机制，解释了在破骨细胞分化开始之前，对适当的细胞外信号作出反应，MITF和PU.1活性在定向髓系祖细胞中的调节。

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数字

**图1。**
破骨细胞分化过程中Eos表达下调。（A）相对（rel）表达式*Eos公司*,*Acp5公司*、和*Ctsk公司*在指定时间（天[d]）和细胞因子治疗时，通过qRT-PCR测量mRNA。三个独立实验的结果显示为平均值加上平均值的标准误差（误差条）。（B）使用抗Eos抗体通过Western blotting分析在指定时间（天[d]）从破骨细胞中提取的核提取物。组蛋白H3用作负荷对照。

**图2。**
Eos抑制两者*Acp5基因*和*Ctsk公司*启动子活性。（A）*Acp5公司*和*Ctsk公司*小鼠和人类细胞的启动子序列，具有保守的MITF和PU.1结合位点（用括号表示）和假定的Eos结合位点（下划线）。如图所示，M1和M2显示Eos DNA共识中的序列替换。（B） NIH 3T3细胞的瞬时转染分析。要么*Acp5公司*萤光素酶报告基因(*Acp5公司*-luc）或*Ctsk公司*荧光素酶报告子(*Ctsk公司*-luc）单独或与编码MITF、PU.1和Eos的表达载体的指定组合一起转染。通过添加空表达载体，每次转染的总DNA保持不变。相对（Rel）荧光素酶活性表示为与基础启动子活性的差异(n个-折叠）（设置为1）。三个独立实验的结果显示为平均值加上平均值的标准误差（误差条）。（C）使用γ的EMSA-³²P端部标记*Acp5公司*寡核苷酸和重组GST或GST-Eos（101-230）蛋白。DNA-Eos复合物（箭头）的形成与不断增加的冷量竞争*Acp5公司*探查。（D）使用γ的EMSA-³²P末端标记野生型或突变型*Acp5公司*重组His存在下的寡核苷酸₆-PU.1和GST-Eos（101-230）蛋白质。显示了Eos-DNA复合体（粗箭头）、PU.1-DNA复合物（细箭头）和包含Eos和PU.1的超移带（折断箭头）。

**图3。**
Eos与PU的物理相互作用1。（A）本研究中使用的Eos和PU.1结构域及其各自缺失突变的示意图。Eos中的锌指表示为黑色垂直日食。AD，激活域；DBD，DNA结合域。（B）重组GST-Eos（101-230）和His-tagged全长（f.l）PU.1，以及PU.1的不同缺失，用于体外GST下拉分析，并用抗-His抗体进行Western blotting分析。（C）如图所示，使用用编码Flag-Eos（50-230）和HA-PU.1的表达载体转染的COS-7细胞的提取物进行Co-IP测定。箭头表示重链（H.C）和轻链（L.C）。在B组和C组中，使用所示的适当抗体，通过Western blotting或免疫印迹（IB）分析输入对照。

**图4。**
Eos和MITF之间的物理相互作用。（A）本研究中使用的MITF结构示意图。B、基础；HLH，螺旋-环-螺旋；LZ，亮氨酸拉链。（B）使用表达全长（f.l）GST-Eos的COS-7细胞和MITF的标记全长、N末端（aa 1至218）和C末端（aa219至419）片段的GST下拉分析。（C）使用与标记的N末端MITF（1-218）和全长（f.l）GST-Eos或Eos缺失突变共同转染的COS-7细胞进行GST下拉分析。根据指示，使用适当的抗体，通过Western blotting或免疫印迹（IB）分析输入对照。（D）如图所示，内源性Eos、MITF和PU.1蛋白与来自单用CSF-1生长的骨髓祖细胞核提取物的特异性抗体共免疫沉淀。最右边的通道（仅珠子）是非特异性兔免疫球蛋白G对照物。

**图5：。**
招聘Eos、MITF和PU.1到*Acp5公司*和*Ctsk公司*破骨细胞分化过程中的启动子。（A）（左）分析区域的图形表示*Ctsk公司*和*Acp5公司*ChIP分析中的基因。（右）Eos ChIP的代表性凝胶图片*Ctsk公司*基因，经过40个PCR周期。输入表示添加抗体前每个分析中的总DNA。阴性对照包括无抗体（no Ab）和3′外显子/内含子区（exon）。使用抗孕酮H3作为阳性对照。d、天。（B） ChIP分析研究Eos、MITF和PU.1与*Ctsk公司*和*Acp5公司*单用CSF-1处理细胞中的启动子（第0天）或随后使用CSF-1和RANKL处理0.5、3和5天。相对富集，相对富集。（C） MITF、PU.1和Eos在*Bcl2公司*和c-*飞行管理系统*促破骨细胞前体中的启动子。（D） MITF、PU.1和Eos在*Acp5公司*CSF-1单独作用于细胞的启动子*米特夫*^vga/vga小鼠（左）或Pu.1条件敲除细胞（右）。三个独立实验的结果表示为面板B至D中每个实验的平均值±平均值标准误差（误差条）。

**图6。**
Eos、MITF和PU.1与共加压剂的关联*Ctsk公司*和*Acp5公司*破骨细胞前体中的启动子。（A）辅抑制因子和辅活化因子与*Ctsk公司*和*Acp5公司*通过ChIP分析，在CSF-1和RANKL治疗3天后（第3天），破骨细胞前体中的启动子仅生长于CSF-1（第0天）和破骨细胞样细胞中。rel富集；相对富集。（B） ReChIP分析破骨细胞前体中同时存在Eos、MITF、PU.1和共抑制剂。三个独立实验的结果表示为平均值加上平均值的标准误差（误差条）。

**图7。**
BMM中Eos的过度表达破坏破骨细胞的分化。原代破骨细胞前体细胞要么是模拟感染的，要么是用空的MSCV-IRES-GFP（MSCV）和MSCV-Flag-Eos-IRES-GFP进行逆转录的。（A）感染后1天用核提取物通过Western blotting分析外源性Eos的表达。（B）代表*Acp5公司*CSF-1和RANKL治疗3天后感染BMM的（TRAP）染色（顶部面板）。*Acp5公司*-对每个孔（左条形图）和GFP阳性细胞（右条形图）中的阳性多核细胞（MNC，三个或更多核）进行计数。（C）相对（rel）mRNA表达*Acp5公司*和*Ctsk公司*在指定的时间点（天[d]）通过qRT-PCR测量基因。面板B和面板C中的结果均来自三个独立的实验，并以平均值加标准平均值误差（误差条）的形式表示。使用两个样本进行统计分析t吨测试（*，*P（P）*< 0.01). （D）通过siRNA敲低Eos。（左）扰乱siRNA转染（对照[Con]）或Eos特异性siRNA转染（Eos）细胞中Eos蛋白水平的蛋白质印迹分析。MITF水平作为负荷控制进行测量。（右）级别*Ctsk公司*和*Acp5公司*通过qPCR测定Eos敲除细胞与对照细胞的mRNA。

**图8。**
的示意模型*Acp5公司*和*Ctsk公司*破骨细胞分化过程中转录因子及其辅因子的基因调控。（A）在仅存在CSF-1的情况下，MITF、PU.1和Eos复合物与共抑制剂结合，从而抑制*Acp5公司*或*Ctsk公司*表达式。（B） CSF-1和RANKL的联合刺激触发Eos和辅升压复合物的分离以及辅活化剂的招募。（C）持续的CSF-1和RANKL治疗随后导致了*Acp5公司*和*Ctsk公司*表达式。

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1. de la Serna，I.L.、Y.Ohkawa、C.Higashi、C.Dutta、J.Osias、N.Kommajosyula、T.Tachibana和A.N.Imbalzano。2006.小眼畸形相关转录因子需要SWI/SNF酶来激活黑色素细胞特异性基因。生物学杂志。化学。281:20233-20241.-公共医学
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