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.2006年2月；26(4):1318-32.
doi:10.1128/MCB.26.4.1318-1332.2006。

Smad3核出口的机制涉及exportin 4和Ran

黑崎明（Akira Kurisaki） 1, Keiko Kurisaki先生, 马金·科瓦内茨, Hiromu Sugino公司, Yoshihiro Yoneda公司, 卡尔·亨里克·赫尔丁, 阿里斯蒂迪斯·穆斯塔卡斯
附属公司

Smad3核出口的机制涉及exportin 4和Ran

黑崎明（Akira Kurisaki）等。 分子细胞生物学. 2006年2月.

摘要

转化生长因子β（TGF-β）受体磷酸化Smad3并诱导其核导入，从而调节基因转录。Smad3可以返回细胞质，进一步传播信号转导周期或被降解。我们证明Smad3是通过对钩体霉素B不敏感的组成机制导出的。Mad同源性2（MH2）结构域负责Smad3导出，这需要GTPase Ran。失活、GDP锁定的RanT24N或微量注射Ran GTPase激活蛋白1阻断Smad3的输出。Ran鸟嘌呤核苷酸交换因子RCC1的失活抑制了Smad3的输出，并导致磷酸化Smad3在核内积聚。与Smad3相关的导入/导出蛋白家族成员的筛选确定了导出蛋白4，它以Ran-dependent方式结合Smad3 MH2结构域中的保守肽序列。出口4足以与Ran合作进行Smad3的体外核出口。内源性exportin 4的敲除完全消除了内源性Smad3的输出。一个代表Smad3最小相互作用域的短肽有效地与Smad3结合竞争，以导出蛋白4，并阻断体内Smad3的核输出。因此，我们为Smad3描绘了一条新的核出口途径。

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数字

图1。
图1。
Smad3的核输出是结构性的，需要C末端MH2结构域。（A） 重组GFP-Smad3（1 mg/ml）或GST-Smad4（1 mg/ml），均为野生型（wt）形式，分别与注射控制蛋白TRITC-IgG或GST-GFP一起注射到NIH 3T3细胞的细胞核中。在37°C的温度下，在不存在或存在指示浓度的LMB的情况下培养1小时后，固定细胞，并通过自体荧光显微镜检查GFP-Smad3的定位。用抗GST抗体间接免疫荧光法检测GST-Smad4。（B） 将融合GST的重组Smad3缺失突变体与注射对照Cy3标记的BSA一起微量注射到NIH 3T3细胞的细胞核中，并在37°C下孵育1h，用抗GST抗体间接免疫荧光检测蛋白质定位。（C） 将融合到GST-GFP的重组Smad3蛋白与注射对照Cy3-标记的BSA一起注射到NIH 3T3细胞产生的双核体中的一个细胞核中，并在37°C下培养1 h。用GFP自身荧光和细胞核DAPI染色检测蛋白定位。L表示Smad3的链接器域。箭头表示双核细胞中注入的细胞核。（D） 将重组野生型Smad3和Smad3的三个C末端丝氨酸残基改变为天冬氨酸（3D）或丙氨酸（3A），并在37°C下孵育1小时后进行微量注射和分析，如面板B所述。
图2。
图2。
Smad3需要胞质辅因子和Ran才能在体外进行核输出。（A） GFP-Smad3D首先在细胞溶质和ATP生成系统存在下导入渗透性HeLa细胞的细胞核。12分钟后，在所示条件下将细胞进一步孵育20分钟，并通过GFP自体荧光监测蛋白质的分布。（B和C）GFP-Smad3D或GST-NLS-NES-GFP首先在ATP-生成系统importin-β1、Ran-GDP和p10的存在下导入渗透细胞的细胞核（对于GST-NLS-NES-GFP，使用importin-Al2和importin-Bl1）。孵育12分钟后，在所示条件下再孵育细胞20分钟（GFP-Smad3D）或5分钟（GST-NLS-NES-GFP），并通过GFP自发荧光监测蛋白质的分布。（B和C）来自两个不同的代表性实验的结果；面板C将Ran GDP的效果与其突变衍生物RanT24N GDP的效果进行比较。出口反应中添加的重组蛋白浓度为3μM Ran-GDP（或RanT24N-GDP）加上1μM p10、0.2μM CRM1和0.1μM exportin-t。
图3。
图3。
Ran的GTP形式对体内Smad3的核输出至关重要。（A） GFP-Smad3野生型（wt）（1 mg/ml）或GST-NES-GFP（1 mg/ml）与缓冲液（−）或GST RanGAP1（5 mg/ml）和注射标记物Cy3标记的BSA一起注入NIH 3T3细胞的细胞核。在37°C下孵育1小时后，用GFP自体荧光监测蛋白质的定位，并用细胞核的DAPI染色作为对照。（B） 将GFP-Smad3野生型（wt）（1 mg/ml）或GST-NES-GFP（1 mg/ml）与注射对照Cy3标记的BSA一起微量注射到tsBN2细胞的细胞核中。注射前，细胞在允许温度（33.5°C）或非允许温度（39.5°C）下培养24小时。在37°C下孵育1小时后，用GFP自体荧光监测蛋白质的定位，并用细胞核的DAPI染色作为对照。（C） Ran GEF RCC1失活导致Smad3核累积。在用2 ng/ml TGF-β1刺激指定时间段以及细胞裂解和分馏之前，在允许温度（33.5°C）和非允许温度（39.5°C）下培养24小时的tsBN2细胞中内源性磷酸化S-mad3（pSmad3）和Smad3核水平的免疫印迹分析。具体的蛋白质带用箭头表示，星号表示背景带。PCNA代表核蛋白标记。（D） 面板C中蛋白质带密度定量的图形表示，磷-Smad3水平（左图）或总Smad3水平（右图）归一化为相应的PCNA水平。灰色条表示允许温度（33.5°C），黑色条表示非允许温度（39.5°C）。（E） 对C组细胞质蛋白标记Grb2（箭头所示）实验中使用的细胞核（Nucl）和相应细胞质（Cyto）提取物的等分样品进行免疫印迹分析。
图4。
图4。
Exportin 4以Ran-dependent方式与Smad3关联。（A） 筛选Smad3-相互作用转运蛋白的下拉试验。在293T细胞中表达了所示的16种标记的转运蛋白，转染细胞的总细胞提取物在2μM重组His-tagged RanQ69L-GTP存在下与GST或GST-Smad3珠孵育，然后用抗标记抗体进行免疫印迹。转染细胞裂解物的等分样品也用抗Flag抗体进行免疫印迹，以参考转运蛋白表达（Total）。（B） 使用zzExp4-IgG珠和瞬时转染293T细胞的总细胞提取物进行下拉分析，该细胞具有N末端标记的全长Smad3，且不存在（−）或（+）组成活性TGF-βI型受体ALK5（caALK5）。在没有（−）或存在（+）2μM重组纯化His-tagged RanQ69L-GTP的情况下进行关联反应。使用抗Flag或抗磷酸-Smad3抗体对与exportin 4珠（Pd）结合的蛋白质和总细胞提取物（total）进行免疫印迹分析。免疫印迹的Ponceau S染色显示使用的重组蛋白。箭头表示相关的蛋白质带，星号表示非特异性带。（C） 按照面板B所述进行下拉分析，但转染的Flag-Smad3要么是全长野生型（wt），要么携带两个C末端丝氨酸到丙氨酸（2A）的替代物，使用抗组氨酸抗体代替Ponceau S.Ib免疫印迹染色，在下拉试验中检测到重组His标记的RanQ69L-GTP。
图5：。
图5：。
映射与exportin 4交互的Smad3域。（A） 在RanQ69L-GTP存在的情况下，使用exportin 4 beads（zzExp4-IgG）和瞬时转染293T细胞的总细胞提取物，利用所示哺乳动物表达载体，对Smad3的各种缺失突变体进行下拉分析，这些突变体在其N端标记有6myc表位。（B） 用GFP标记的Smad3连接体（L）和MH2结构域N末端的缺失突变体进行如图A所述的下拉测定。星号表示下拉（Pd）和总细胞提取物免疫印迹中的相关蛋白带。（C） Smad3与exportin 4的相互作用域摘要。相互作用所需的最小MH2肽序列标记在两条细垂直线之间。交互表基于面板A和B以及未显示的实验数据（ns）。（D） 与exportin 4相互作用的人类Smad3片段的氨基酸序列，残基271至354，并与人类Smad（hSmad）家族的所有其他成员对齐。用灰色阴影表示家庭内氨基酸的保存。Smad3序列上方的黑色圆圈标记通过晶体学和Smad2中的突变映射出的关键氨基酸，它们负责Smad2与FoxH1家族的衔接蛋白SARA和转录因子的相互作用（25，33）。灰色圆圈标记氨基酸，当Smad2发生突变时，会阻止其核输出（41）。免疫印迹；WT，野生型。
图6。
图6。
导出4足以在体外携带Smad3的核导出。（A） GFP-Smad3D首先在ATP-生成系统importin-β1、Ran-GDP和p10的存在下导入渗透性HeLa细胞的细胞核。孵育12分钟后，在所示条件下再孵育6分钟，用GFP自体荧光监测蛋白质的分布。出口反应中添加的重组蛋白浓度为3μM Ran-GDP加1μM p10、0.2μM CRM1和0.1μM exportin 4。（B） 图中显示了与面板A中描述的相同的体外反向导入分析的动力学数据，并通过0到15分钟之间的时间过程进行。基准点表示在存在转运缓冲液的转运反应的每个时间点，GFP-Smad3D得分为阳性的平均细胞核数，Ran加p10，或exportin 4加Ran加上p10，如插图所示。误差条表示从每个条件计数的350个核的总体中得出的平均值的标准误差。（C） 实验重复A组，包括两种作为特异性控制的新条件：组成突变RanT24N-GDP代替野生型Ran和完全缺乏外源性Ran。
图7。
图7。
Smad3的核出口需要内源性exportin 4。（A） 用载体（−TGF-β1）或2 ng/ml TGF-？1处理HaCaT细胞1 h（+TGF-。以Smad4为对照，对细胞进行内源性Smad3、C末端磷酸化Smad3（pSmad3）的免疫染色。（B） HaCaT细胞瞬时转染25 nM对照物（siLuc）或exportin 4特异性物（siExp4）48小时，然后用如图A所示的化合物和指示蛋白的免疫荧光进行处理。棒材相当于10μm。（C） 使用抗exportin 4和抗β-微管蛋白（对照）抗体对B组中使用的相同细胞单层进行免疫印迹分析。用越来越多的siRNA寡核苷酸（25 nM和100 nM；三角形）转染细胞，并用载体（−）或2 ng/ml TGF-β1处理1 h。
图8。
图8。
Smad3和exportin 4之间的相互作用对Smad3的核输出至关重要。（A） 在RanQ69L-GTP存在的情况下，使用exportin 4珠（zzExp4-IgG）和瞬时转染293T细胞的总细胞提取物，使用Flag-Smad3（全长）和不同剂量的GFP-Smad3片段（氨基酸271-354和271-324）进行下拉分析。（B） 用pEGFP（GFP-mock）或pEGFP-Smad3（271-324）瞬时转染HaCaT细胞，24小时后，在免疫荧光显微镜检查内源性磷酸化Smad3和Smad4之前，严格按照图7图例所述进行处理。GFP显示每个场中转染细胞的自体荧光。条形对应于10μm，白色箭头指向转染细胞核，白色箭头则指向未转染细胞核。免疫印迹；利580276。
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