Transforming growth factor beta -inducible independent binding of SMAD to the Smad7 promoter

doi:10.1073/pnas.090099297

。2000年6月6日；97(12):6397-402.

doi:10.1073/pnas.090099297。

转化生长因子β诱导SMAD与Smad7启动子的独立结合

N G Denissova公司¹, C Pouponot公司, J龙, D He公司, F刘

附属机构

PMID： 10823886
预防性维修识别码：项目经理18614
内政部： 10.1073/pnas.090099297

转化生长因子β诱导的SMAD与Smad7启动子的非依赖性结合

N G丹尼索娃等人。美国国家科学院程序。 2000。

。2000年6月6日；97(12):6397-402.

doi:10.1073/pnas.090099297。

作者

N G Denissova公司¹, C Pouponot公司, J龙, D He公司, F刘

附属

¹美国新泽西州皮斯卡塔韦市新泽西州立大学罗格斯药学学院化学生物学系高级生物技术与医学中心和癌症研究实验室，邮编08854。

PMID： 10823886
预防性维修识别码：项目经理18614
内政部： 10.1073/pnas.090099297

摘要

SMAD蛋白可以介导转化生长因子β（TGF-β）诱导的转录反应。虽然SMAD可以识别特定的DNA序列，但它通常通过与DNA结合伙伴的相互作用被招募到启动子中。为了寻找TGF-β诱导的基因，我们使用了减法筛选方法，并鉴定了人Smad7，该Smad7能够拮抗TGF-α信号传导，并被TGF-γ快速上调。在本报告中，我们表明TGF-β可以稳定Smad7 mRNA并激活Smad7转录。Smad7启动子是脊椎动物中发现的第一个TGF-β反应性启动子，该启动子含有8 bp回文SMAD-结合元件（SBE），这是一个最佳结合位点，之前通过使用重组Smad3和Smad4从随机寡核苷酸中进行基于PCR的选择确定。我们证明，在TGF-β治疗中，内源性SMAD复合物可以与短至14或16 bp的Smad7启动子DNA结合，其中包含凝胶迁移率转移和超转移分析中的8 bp SBE。我们的研究提供了强有力的证据，证明SMAD蛋白可以独立于其他序列特异性转录因子与天然TGF-β应答启动子结合。我们进一步表明，虽然重组Smad3与SBE结合，但内源性或甚至转染的Smad3在没有Smad4的情况下不能与SBE相结合。这些发现对TGF-β/SMAD信号通路靶基因的鉴定具有重要意义。

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数字

图1
(A类)TGF-β快速诱导Smad7 mRNA水平。聚乙烯（A）⁺以Smad7的N末端结构域为探针，通过Northern blot分析未经处理或TGF-β处理不同时间的HaCaT细胞的RNA（4μg）。(B类)TGF-β能提高Smad7 RNA.Poly（A）的稳定性⁺用Smad7探针进行Northern blot分析，分析在没有或存在TGF-β（500 pM）的情况下用放线菌素D（1μg/ml）处理不同时间的HaCaT细胞的RNA（4μg）。在两者中A类和B类随后将每个印迹与甘油醛-3-磷酸脱氢酶探针杂交，以使RNA负载量正常化。

图2
人类Smad7启动子转录起始位点的测定。聚乙烯（A）⁺来自未经处理或用TGF-β（500 pM）处理1 h的HaCaT细胞的RNA（0.4μg）与22-bp寡核苷酸一起用于引物延伸分析。在变性凝胶上分析产品（参见A类)具有测序反应（未示出）。标记了两个转录起始位点（P1和P2）、SBE和22bp引物的位置。

图3
(A类)SBE对于Smad7启动子的TGF-β诱导至关重要。将含有不同长度Smad7启动子的荧光素酶构建物转染到HaCaT细胞中，并用TGF-β处理。然后分析荧光素酶活性。(B类)Smad3–Smad4复合物以最佳方式激活Smad7启动子的转录。将Smad2、Smad3和Smad4与−339至+641 Smad7-荧光素酶构建物共转染到SW480.7细胞中，并用TGF-β处理，如图所示。然后测定荧光素酶活性。

图4
内源性SMAD可与SBE结合以响应TGF-β。未经处理或用TGF-β处理1 h的HaCaT细胞的全细胞提取物与16-bp探针在凝胶迁移率变化分析中孵育，如A类和B类. (A类)抗Smad2/Smad3或Smad4抗体可引起TGF-β诱导的DNA-蛋白质复合物的超移位。(B类)特定竞争物是指侧翼序列发生突变但含有完整的8 bp SBE的寡核苷酸。非特异性竞争对手是指在SBE的GTCT序列中具有2 bp突变的寡核苷酸。(C类)HaCaT细胞未经处理或用TGF-β处理不同时间，然后在凝胶迁移率变化分析中分析SBE结合活性。

图5
(A类和B类)在没有Smad4的情况下，内源性或转染的Smad3不能与SBE结合，Smad3–Smad4复合物与SBE的结合最佳。(A类)用Flag-Smad2、Flag-Smad3和Smad4-HA共同转染SW480.7细胞，并用TGF-β处理。全细胞提取物用于16-bp探针的凝胶迁移率变化分析。(B类)针对Flag和HA表位的抗体被纳入超移位分析。(C类)重组Smad3和Smad4可以与16-bp探针结合。GST-SMAD蛋白（0.8μg）用于凝胶迁移率变化分析。

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