编码Pyst1和Pyst2磷酸酶的人类基因的分离：Pyst2作为胞浆双特异性MAP激酶磷酸酶的特征及其被MAP和SAP激酶催化活化

丝裂原活化蛋白激酶是从酵母到哺乳动物细胞高度保守的信号转导途径的组成部分(西田和后藤，1993年;马歇尔，1994年;Robinson和Cobb，1997年). 这些中继、放大和集成不同的信号，使细胞能够协调各种各样的细胞功能。这些包括增殖、分化、发育、炎症反应和凋亡。迄今为止，已在哺乳动物细胞中鉴定出10个MAP激酶家族成员，这些成员根据不同激动剂对其的不同激活程度进行分类(科恩，1997年). 研究最广泛的MAP激酶是“经典的”42和44kDa亚型（也称为ERK2/ERK1或MAPK2/MAPK1），它们对生长因子和佛波酯有强烈的反应，并与细胞增殖和分化有关(Cobb等人，1994年). 第二组激酶优先被细胞应激激活，包括渗透性休克、氧化应激、DNA损伤剂和蛋白质合成抑制剂。这些包括应激活化蛋白（SAP）激酶，包括c-Jun激酶亚型JNK-1、JNK-2和JNK-3（SAPK1c、SAPK1a和SAPK1b）、p38/RK/CSBP（SAPK2a）、p38β（SAPK2 b）、ERK6/p38γ（SAPK3）、SAPK4和ERK5/BMK1（SAPK5）(科恩，1997年).

所有MAP激酶都是通过双特异性MAP激酶（MEK或MKK）磷酸化保守标志序列T-X-Y内的苏氨酸和酪氨酸残基来激活的。除了介导MAP激酶的激活外，最近已经证明这些关键残基的磷酸化是促进ERK2/MAPK2二聚体和核移位的原因(Khokhlatov等人，1998年). 其他MAP和SAP激酶也形成二聚体，表明这是MAP激酶家族的一般作用机制。这具有重要的功能意义，因为MAP激酶信号的大小和持续时间以及酶的核移位是生物效应的关键决定因素(马歇尔，1995年). 对培养中大鼠PC12细胞分化的研究最能说明这一点。这些细胞在表皮生长因子（EGF）的作用下增殖，而暴露于神经生长因子（NGF）会导致以细胞分裂停止和突起生长为标志的细胞分化。这种差异反应完全是由于NGF能够引起MAP激酶的持续激活和核转位。相反，EGF只引起MAP激酶的一个非常短暂的激活，而该激酶不进入细胞核(Traverse等人，1992年).

MAP激酶信号的大小和持续时间可能反映了上游激活物（如MEK/MKK）的活性与蛋白磷酸酶活性之间的平衡。现在很清楚，有一些特定的蛋白磷酸酶负责调节酵母中MAP激酶的活性，果蝇属和哺乳动物细胞(Keyse，1998年). 特别是，一个以可诱导的核CL100（MKP-1）酶为代表的双特异性（Thr/Tyr）MAP激酶磷酸酶家族（MKPs）似乎在哺乳动物细胞中MAP激酶活性的调节中发挥着关键作用(Keyse和Emslie，1992年;Alessi等人，1993年;Sun等人，1993年). 目前已分离出至少九种CL100样酶，并对其进行了表征，这些酶显示出不同的转录调控模式、组织/细胞分布和亚细胞定位(Keyse，1998年). 其中包括Pyst1磷酸酶（也称为MKP-3），它能够与p42（ERK2）MAP激酶结合，并在体内外对MAP激酶的p42/p44（ERK2/1）亚型表现出显著的底物选择性(Groom等人，1996年;Muda等人，1996a，b）。最近的研究表明，p42（ERK2）底物结合伴随着体外Pyst1（MKP-3）的催化活化(Camps等人，1998年)这可能提供了靶向灭活不同MAP激酶亚型的机制。

除Pyst1外，还报道了与Pyst1（MKP-3）密切相关的人类（Pyst2）和大鼠（MKP-X）酶的部分cDNA序列(Groom等人，1996年;Muda等人，1996a). 此外，分离出第三种酶，命名为MKP-4，与Pyst1比其他MAP激酶磷酸酶更密切相关，并发现其对p42/p44 MAP激酶具有底物选择性(Muda等人，1997年). 这表明这些酶可能构成一个独特的结构同源的双特异性（Thr/Tyr）MAP激酶磷酸酶亚家族。在这里，我们根据人类Pyst1和Pyst2基因的结构提出证据，证明情况确实如此。此外，我们已经证明，Pyst2是一种细胞溶质蛋白，在体内外对p42 MAP激酶具有底物选择性。最后，我们表明，Pyst2在体内与p42 MAP激酶（ERK2）结合的能力与重组MAP和SAP激酶在体外引起Pyst2催化活化的能力相关。

我们筛选了大约2.4×10⁵使用标准技术从克隆到EMBL3（Clontech）的人类胎盘DNA构建的人类基因组文库中的斑块(Sambrook等人，1989年). 最初使用来自Pyst2的3'非翻译区的300 bp cDNA片段探测斑块。然后使用从Pyst1的3'非翻译区衍生的600 bp探针重新筛选过滤器。阳性斑块被鉴定和纯化。然后切除插入物，亚克隆并结合限制性分析、PCR和DNA测序进行分析。

所有操作均使用标准技术进行(Sambrook等人，1989年)通过DNA测序验证质粒结构(桑格等人，1977年). 完整的Pyst2开放阅读框由我们的部分cDNA组装而成(Groom等人，1996年)和重叠延伸PCR的Pyst2基因组克隆(Ho等人，1989年). 然后将该cDNA亚克隆为Nde公司我-Xho公司I片段进入细菌表达载体pET15b（Novagen）并作为生态RI公司-Xho公司如前所述，I片段进入编码C末端myc-tag的改良pSG5哺乳动物表达载体（Stratagene）(Groom等人，1996年). 利用Sculptor系统（Amersham）通过寡核苷酸定向突变对全长Pyst1 cDNA中的假定起始密码子进行定点突变。编码myc标记的p42 MAP激酶和p38/RK SAP激酶以及HA标记的JNK-1的质粒已经在前面描述过(Groom等人，1996年)

按照制造商的建议，使用TRIzol试剂（Gibco BRL）从培养细胞中制备总RNA，并使用标准技术对mRNA进行northern blot分析(Sambrook等人，1989年).³²通过随机引物标记产生P标记的cDNA探针(范伯格和沃格尔斯坦，1984年)使用以下模板：完整的人类Pyst2 cDNA；完整的人类Pyst1 cDNA(Groom等人，1996年); 完整的人CL100 cDNA(Keyse和Emslie，1992年)1400个基点Pst（磅/平方英尺）大鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酶cDNA的I片段(Piechaczyk等人，1984年).

FEK4原代人皮肤成纤维细胞常规培养，并用前面描述的辐射和化学物质处理(Keyse和Emslie，1992年). COS-1细胞保存在补充有10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM）中，并使用标准磷酸钙方法转染。如前所述，使用抗myc单克隆抗体9E10对瞬时转染myc标记的Pyst2、Pyst1和CL100蛋白的COS-1细胞进行间接免疫荧光实验(Lewis等人，1995年). 使用装有×100物镜的Olympus BX-60显微镜，使用FITC和DAPI的激发/发射过滤器观察和拍摄细胞染色。每种细胞类型至少检测50个9E10阳性细胞，染色模式与拍摄的代表性细胞完全一致。

在共转染实验中，以每6cm培养皿2µg的速度引入编码激酶报告子的质粒，并结合不同数量（0.1-2.0µg）的编码Pyst2的表达质粒。

抗Pyst1抗体如前所述产生(Groom等人，1996年). 纯化的Pyst2蛋白表达于大肠杆菌用SDS-PAGE分离并转移到硝化纤维素中，然后用标准技术用抗Pyst1抗血清进行免疫印迹(哈洛和莱恩，1988年). 为了检测COS-1细胞中磷酸化和非磷酸化形式的p42-MAP激酶，用SDS-PAGE（10%）分离裂解产物，转移到硝酸纤维素中，并用抗MAP激酶单克隆抗体（Zymed）或myc标记的p42-MAP激酶、抗myc单克隆抗体9E10进行免疫印迹，与前面描述的完全一样(Groom等人，1996年).

对转染myc标记RK/p38、HA标记JNK-1或myc标记p42 MAP激酶的COS-1细胞进行裂解，然后对该激酶进行免疫沉淀，然后进行激酶活性检测或如前所述的SDS-PAGE分析(Groom等人，1996年).

磷酸化酶a是³²P-完全按照Alessi等人（1993年）MAP激酶被激活³²使用活化MAP激酶激酶标记P，如所述Alessi等人（1995年）纯化的MalE-RK融合蛋白如前所述被激活和磷酸化(Groom等人，1996年).

活化的c-Jun激酶是从紫外线照射（80 J/m²)使用GST-c-Jun（残基1-191）融合蛋白的COS-1细胞。Pyst2和Pyst1蛋白在细菌中表达，并按照之前对CL100的描述进行纯化和复性(Keyse和Emslie，1992年). p42 MAP激酶、p38/RK和c-Jun激酶磷酸酶活性的测定和磷酸化氨基酸分析完全按照前面所述进行(Keyse和Emslie，1992年;Alessi等人，1993年).

Pyst2和Pyst1的催化活性使用第页-硝基苯磷酸盐(第页-NPP）在25°C下水解。在含有10 mM DTT、20 mM的200µl 50 mM咪唑（pH 7.5）的96个平板中测量磷酸酶活性第页-NPP和指示量的重组Pyst2或Pyst1以及各种纯化的重组MAP激酶。反应速率在微孔板阅读器（Bio-Rad）中以405nm的吸光度进行监测，与所述完全一致(Camps等人，1998年).

用髓磷脂碱性蛋白作为底物，用9E10单克隆抗体从COS-1细胞中检测重组p42-MAP激酶或myc标记的p42-MA激酶和p38/RK免疫沉淀的活性，如Groom等人（1996年）使用GST-c-Jun融合蛋白或使用抗12CA5单克隆抗体从COS-1细胞免疫沉淀的HA标记JNK-1，从COS-2细胞裂解物中“拖出”Jun激酶，按照Hibi等人（1993年）.

用全长Pyst1 cDNA和我们的部分Pyst2 cDNA对人类基因组文库进行严格筛选，产生了许多阳性信号。根据这些克隆的进一步特征，阳性斑块被鉴定为包含Pyst1和Pyst2基因的重叠克隆或姐妹克隆。然后对其进行详细分析。Pyst1基因由三个外显子组成，由两个相对较短的内含子（约700 bp）中断(图1A). Pyst1第三外显子的大小尚未确定，因为尚未发现该基因的多聚腺苷酸化信号。Pyst2基因跨越约7kb，与Pyst1基因一样，包含三个外显子，由两个稍长（约2kb）的内含子中断(图1B). Pyst2基因第一外显子的大小尚未确定，因为转录起始位点未知。该外显子包含编码Pyst2蛋白残基1-46的DNA序列，该残基在我们的原始cDNA中缺失。

这两个基因的结构高度保守，外显子1编码这两种蛋白质的氨基末端，并在所有哺乳动物双特异性MAP激酶磷酸酶和cdc25蛋白质之间的两个短同源区域中的第二个区域结束(Keyse和Ginsburg，1993年). PTPase活性位点位于Pyst1和Pyst2的外显子3内。两个基因的序列比较表明，所有剪接连接都符合供体和受体序列一致性(Breathnach和Chambon，1981年)并且这两个基因的内含子/外显子边界是相同的(表1). 利用我们的基因组克隆进行的FISH分析将Pyst1基因映射到人类染色体12q21，将Pyst2基因映射到人体染色体3p21（数据未显示）。

迄今为止，已经分析了编码双特异性MAP激酶磷酸酶的三个人类基因的结构。这些是CL100/MKP-1(Emslie等人，1994年;Kwak等人，1994年)PAC-1号机组(Yi等人，1995年)和HB5/hVH-5(Nesbit等人，1997年). 在所有这些基因中，与Pyst1和Pyst2中发现的内含子相比，中断第二个cdc25样序列并定义包含PTPase活性位点的外显子开始的两个内含子的位置和相位都是保守的。然而，与Pyst1和Pyst2相反，插入的编码序列（对应于外显子2）被一个额外的内含子中断。此外，我们对编码Pyst3（MKP-4）的小鼠基因的初步分析显示，与人类Pyst1和2基因的结构相同（我们的未发表数据），这表明缺乏这种保守内含子是MAP激酶磷酸酶Pyst亚家族的一个特征。

Pyst2完整编码序列的测定使我们能够对齐Pyst1、2和3氨基酸序列，并表明这些蛋白质高度同源，特别是在含有PTPase活性位点的区域(图2). 与Pyst2和Pyst3相比，Pyst1似乎具有约13个残基的氨基末端延伸。然而，表达编码Pyst1蛋白的cDNA的COS-1细胞裂解物的蛋白质印迹检测到两种不同的多肽，这两种蛋白质中较小的一种被更有效地翻译(图3B). 这些规模与第一次ATG和内部ATG（Met 14）启动的翻译产品相对应(图3A). 对这些起始密码子两侧的核苷酸序列的检查表明，第二个ATG处于更有利的翻译起始环境中(科扎克，1991年). 这些假定起始密码子的定点突变证实了Pyst1 cDNA的主要翻译产物对应于该内部ATG的起始(图3B)，表明这很可能代表体内表达的Pyst1的主要形式。

我们之前在包括肌肉、大脑、心脏和肝脏在内的许多人体组织中检测到了Pyst2 mRNA(Groom等人，1996年). 然而，使用与Pyst2的3'非翻译区相对应的探针，我们无法检测到原始人类皮肤成纤维细胞中的转录物。使用完整的Pyst2 cDNA，我们现在已经确定Pyst2 mRNA在多种人类细胞系中广泛表达，包括人类皮肤成纤维细胞（FEK4）、HeLa细胞和卵巢（1847，Green等人，1984年)，气囊（EJ138，O'Toole等人，1983年)和乳腺癌（MCF-7，Soule等人，1973年)-衍生细胞系(图4A). 在某些细胞中，如FEK4成纤维细胞和三种癌细胞系，Pyst1和Pyst2 mRNA同时表达。后一个结果表明，这些基因表达的缺失不是来源于至少一些常见人类肿瘤的细胞的特征。然而，在来源于人宫颈癌的HeLa细胞中检测不到Pyst1 mRNA，而在所有测试的细胞系中检测到CL100 mRNA，如Pyst2。我们还分析了暴露于生长因子和各种细胞应激（包括热休克、氧化应激和紫外线辐射）后FEK4细胞中Pyst2转录水平。与Pyst1相比，血清刺激后，Pyst2 mRNA在FEK4细胞中适度诱导并快速动力学(图4B). 然而，在暴露于各种应激条件后，我们没有发现这些细胞中Pyst2转录水平的显著增加(图4C).

一些CL100-like MAP激酶磷酸酶非常紧密地定位于细胞核(Keyse，1998年). 然而，Pyst1（MKP-3）明显定位于转染COS-1细胞和交感神经元的胞浆内(Groom等人，1996年;Muda等人，1996a)Pyst3/MKP-4的细胞溶质定位也有报道(Muda等人，1997年). 据报道，在Pyst1的大鼠同源物rVH6的氨基末端存在两个富含亮氨酸的序列，这两个序列让人想起在几种蛋白质中发现的核输出序列（NES）(Mourey等人，1996年)对Pyst1、2和3序列的比较表明，这些序列在Pyst蛋白亚家族的所有三个成员中都是保守的(图2). 与这些序列的功能作用一致，我们发现Pyst2蛋白在转染COS-1细胞中主要表现为细胞溶质定位(图5)我们在HeLa细胞和NIH 3T3成纤维细胞中获得了相同的结果（数据未显示）。

为了研究Pyst2酶的活性和特异性，我们在大肠杆菌获得了高纯度的重组酶(图6A). 令人惊讶的是，尽管该区域的两种酶之间只有50%的氨基酸同源性，但该蛋白却被针对跨越Pyst1蛋白C末端20个残基的肽制备的多克隆抗血清特异识别(图6A). Pyst2蛋白具有催化活性，因为它容易水解第页-硝基苯磷酸盐(第页-NPP），这种活性被原钒酸钠消除，原钒酸钠是蛋白质酪氨酸磷酸酶的特异性抑制剂(图6B).

我们检测了重组Pyst2在体外对一系列模型底物（包括MAP和SAP激酶亚型）进行去磷酸化的能力。我们发现Pyst2能有效地去磷酸化重组p42 MAP激酶（ERK2，MAPK2）。此外，其对该底物的比活性大约是其对重组RK/p38（SAPK2a）活性的两倍(表2). 这与之前对Pyst1的研究结果形成对比，在Pyst1中，该酶对p38/RK的比活性约为其对p42 MAP激酶的比活性的100倍(Groom等人，1996年). 对于Pyst2，这在很大程度上反映了该酶对p38/RK的活性较高，因为对p42 MAP激酶的比活性实际上大于对Pyst1的测量。与CL100和Pyst1一样，Pyst2对非MAP激酶底物（如磷酸化酶a）没有活性(表2). 这些物质的磷酸分析³²P-标记底物表明Pyst2对p42-MAP激酶具有双特异性（Thr/Tyr）磷酸酶的作用(图7A). 相反，即使在20倍高的水平下，Pyst2也只对T-G-Y特征序列的酪氨酸残基上的RK/p38（SAPK2a）进行去磷酸化(图7B). 除了p38/RK（SAPK2a）外，我们还测定了重组Pyst2对体外应激活化Junkinase亚型的活性(图7C). 我们发现，Pyst2在体外对这些激酶表现出可测量的活性水平。

我们扩展了这些研究，以观察Pyst2在更多生理条件下对MAP和SAP激酶亚型的活性。在这些实验中，我们用表位标记的MAP激酶亚型联合转染COS-1细胞，并增加编码Pyst2磷酸酶的质粒数量。在用适当的激动剂刺激以激活转染的MAP激酶后，对细胞进行裂解，使用适当的单克隆抗体对激酶进行免疫沉淀，并对髓鞘碱性蛋白（p42 MAP激酶和p38/RK）或GST-c-Jun融合蛋白（JNK-1/SAPK1c）的活性进行测定。与我们的体外结果一致，Pyst2在阻止p42 MAP激酶激活方面非常有效，其活性降低至背景水平，编码Pyst2的DNA仅为0.5µg(图8A). 相反，Pyst2对p38/RK和JNK-1的作用要小得多，即使在存在1-2µg Pyst2表达质粒的情况下也能检测到可测量的激酶活性水平(图8B、C).

我们之前已经证明Pyst1 MAP激酶磷酸酶能够在体内与p42 MAP激酶结合。此外，这种结合不需要激活MAP激酶(Groom等人，1996年). 最近的体外研究表明，MAP激酶结合由Pyst1蛋白的氨基末端介导，并导致酶的催化活化，如第页-NPP体外水解(Camps等人，1998年). 这里我们证明了Pyst2和Pyst1一样，在体内也能与p42MAP激酶结合(图9). 此外，Pyst2与浓度增加的重组p42 MAP激酶孵育刺激重组Pyst2的磷酸酶活性第页-体外磷酸硝基苯酯(图10A). p42-MAP激酶激活Pyst2具有剂量依赖性和饱和性。Pyst2在存在和不存在10µg p42 MAP激酶的情况下获得的动力学参数如下所示表3从这些可以清楚地看出，Pyst2与第页-p42-MAP激酶的加入大大提高了NPP和酶的催化速率。

为了将重组MAP激酶对Pyst2的催化活化与其对这些酶的体内外活性联系起来，我们分析了一系列MAP和SAP激酶亚型对Pyst1和Pyst2催化活化的能力。同意Camps等人（1998年）我们发现，Pyst1主要由p42 MAP激酶激活，而p38/RK（SAPK2a）、p38β（SAPK2 b）、ERK6/p38γ（SAPK3）和SAPK4没有显著激活，JNK-1（SAPK1c）只有非常小但显著的（1.9倍）激活。与Pyst1一样，Pyst2主要由p42 MAP激酶激活。

然而，在与JNK-1（SAPK1c）、p38/RK（SAPK2a）和p38β（SAPK2 b）孵育后，我们也检测到该酶显著（2到3倍）催化活化。

人类Pyst1和Pyst2基因的基因组结构的测定使得对编码双特异性MAP激酶磷酸酶的五个哺乳动物基因进行了详细的比较。所有这些基因中某些内含子/外显子边界的绝对保守性表明它们具有共同的祖先起源。特别是，在所有这些蛋白质的氨基末端中断第二个cdc25-like序列的内含子和定义包含PTPase活性位点序列的外显子起始点的内含子的位置可能在整个基因家族中都是保守的。

迄今为止，Pyst亚家族成员的独特之处在于缺乏一个内含子，该内含子可中断CL100和PAC-1（HB5/hVH-5中的外显子3）中与外显子2相对应的编码序列。此外，CL100、PAC-1和HB5/hVH-5中该内含子周围的序列变化更大，有人认为其位置可能反映了这些基因的进化发展(Nesbit等人，1997年). 在这方面，有趣的是，与CL100和PAC-1蛋白相比，没有内含子的Pyst1和Pyst2以及该内含子位置发生改变的HB5/hVH-5都表现出不同的底物特异性和亚细胞定位(Groom等人，1996年;Muda等人，1996a，b）。这可能特别相关，因为最近的工作表明，Pyst1（MKP-3）蛋白的氨基末端结构域（包括这些序列）对底物结合和催化活化至关重要(Camps等人，1998年).

我们对Pyst2转录物在哺乳动物细胞中的表达模式的分析表明，该基因在多种人类细胞系中表达。其中大多数也表达Pyst1 mRNA。然而HeLa细胞只表达Pyst2，这表明这两个基因在某些细胞类型中可能受到不同的调节。我们还发现，与Pyst1一样，Pyst2基因在人类皮肤成纤维细胞中的表达不受各种应激条件的诱导。然而，在血清刺激后，Pyst2转录物确实在这些细胞中迅速积累。这与Pyst1 mRNA水平形成了鲜明对比，Pyst1的mRNA水平仅略微升高，且动力学延迟(Groom等人，1996年). 这些差异表达和对生长因子反应的例子可能表明，Pyst1和Pyst2基因在这些细胞中可能并不完全冗余。

Pyst2基因的分离使我们能够完成部分Pyst2 cDNA，并对Pyst2蛋白的亚细胞定位和活性进行分析。在这项工作的过程中，发表了一个命名为B59的cDNA序列，该序列与Pyst2基因编码的序列完全对应(Shin等人，1997年). B59的异位表达被H-拉斯和V-英国皇家空军这些效应是由p42/p44MAP激酶失活介导的。然而，底物特异性、体内活性和磷酸酶的亚细胞定位尚未得到解决。我们发现，在转染COS-1细胞中，Pyst2蛋白主要是细胞质。这种定位模式与CL100蛋白不同，CL100蛋白紧密定位于细胞核，并被证实为Pyst蛋白亚家族的一般性质。MAP激酶定位研究表明，高达50%的酶留在细胞质中，主要与微管细胞骨架相关(Reszka等人，1995年)这进一步证明了MAP激酶磷酸酶的功能并不局限于细胞核。

我们表达并纯化了Pyst2蛋白，发现它与Pyst1相比既有相似之处，也有潜在的重要差异。首先，当体外检测时，Pyst2优先去磷酸化p42 MAP激酶。然而，与Pyst1相比，这种选择性的程度大大降低。这主要是因为与Pyst1相比，Pyst2对p38/RK（SAPK2a）表现出更高的比活性。然而，与Pyst1一样，Pyst2只能在T-G-Y激活序列的酪氨酸残基上去磷酸化p38/RK SAP激酶。这可能是由于Pyst1和2蛋白的催化域无法有效识别这种SAP激酶作为底物。或者，它可以反映出这种MAP激酶亚型不能引起这些蛋白磷酸酶的完全催化活化（见下文）。Pyst2在体外也表现出对Jun相关激酶（SAPK1亚型）的可测量活性。在类似浓度下，Pyst1蛋白对这些激酶几乎不起作用(Groom等人，1996年).

这些结果与我们的COS-1细胞共转染实验基本一致，在该实验中，与对p38/RK（SAPK2a）的活性相比，Pyst2在阻止p42 MAP激酶激活方面表现出更高的活性。令人惊讶的是，根据我们的体外结果，Pyst2对这些细胞中表达的JNK-1激酶显示出几乎无法检测到的活性水平。然而，在我们的体外测定中使用的重组Pyst2的量远远大于通过体内表达所能达到的量。此外，体外研究是使用紫外线辐射后细胞裂解液中的GST-c-Jun“下拉”分析进行的，所测的Jun激酶活性可以反映多种JNK（SAPK1）亚型的活性，其中某些亚型可能更容易被Pyst2灭活。

我们之前已经证明，野生型Pyst1与CL100不同，能够在体内结合p42 MAP激酶(Groom等人，1996年). 裂变酵母中pmp1磷酸酶也证明了双特异性MAP激酶磷酸酶结合底物MAP激酶的能力，而酶活性部位内的必需半胱氨酸没有突变葡萄裂殖酵母(Sugiura等人，1998年). 这些结果表明，与使用底物捕获突变体观察到的结合相比，这种结合可能是体内底物的更可靠的指示。与此相一致，最近关于Pyst1（MKP-3）的研究表明，与p42 MAP激酶的特异性结合是由蛋白质的非催化氨基末端结构域介导的，并导致体外磷酸酶的催化活化(Camps等人，1998年).

我们在这里已经证明，Pyst2也能够在体内结合p42 MAP激酶。此外，我们已经证明p42-MAP激酶能够在体外引起Pyst2磷酸酶的催化活化。我们通过测定一系列MAP和SAP激酶亚型对Pyst1和2的催化活化能力来扩展这些研究，我们的结果表明，与Pyst1不同，Pyst2也可以在很大程度上被某些SAP激酶亚型别激活。其中包括p38/RK（SAPK2a）和p38β（SAPK2 b）。与Pyst1相比，这些SAP激酶亚型引起Pyst2催化活化的能力可能反映出这种酶对这些底物的特异性有所放松。

总之，我们的数据支持这样的观点，即蛋白的Pyst亚家族构成一个独特的、结构上同源的双特异性（Thr/Tyr）MAP激酶磷酸酶亚家族。所有这些蛋白质都显示出不同于核磷酸酶如CL100、PAC-1、hVH2和hVH3的细胞质定位模式，表明它们可能在胞质溶胶中而不是在细胞核中调节经典MAP激酶亚型的活性。尽管Pyst1、Pyst2和Pyst3表现出不同程度的底物选择性，但它们对MAP激酶的“经典”p42和p44亚型都最为活跃，这反映在MAP激酶亚型与这些磷酸酶结合并在体外引起催化活化的能力上。

我们感谢Iain Goldsmith的寡核苷酸合成，Sue Dale（邓迪大学MRC蛋白质磷酸化单元）的重组SAP激酶，Al Stewart和Neil McDonald（ICRF，Lincoln’s Inn Fields）的重组p42 MAP激酶，Jill Williamson和Denise Sheer（ICRF）的FISH定位，艾琳·麦克拉伦（Aileen McLaren）提供了人类癌症细胞系的mRNA样本。我们感谢Dario Alessi为S.D.准备³²P标记蛋白底物和进行磷酸酶分析。这项工作由帝国癌症研究基金资助。