TRIB3沉默抑制糖尿病ApoE动脉粥样硬化并稳定斑块^−/−/低密度脂蛋白受体^−/−老鼠

所有动物程序均按照山东大学齐鲁医院的机构指南进行，并经山东大学机构动物护理和使用委员会批准。每个笼子里有五只老鼠，允许它们进食和饮用高压水。协议的架构如所示补充图S1.

3周龄雄性apoE/LDLR DKO小鼠喂食高脂肪饮食（HFD；20%脂肪、20%糖和1.25%胆固醇）。6周后，DKO小鼠进行腹腔葡萄糖耐量试验（IPGTT）。任何表现出IR的小鼠一次性注射低剂量链脲佐菌素（STZ，75-80 mg/kg i.p.）以诱导部分胰岛素缺乏。STZ注射两周后，大多数HFD/STZ治疗小鼠表现出高血糖、IR和葡萄糖不耐受，如之前报道的那样(14). 在11周龄时将具有相似高血糖程度和体重的动物随机分为载体（DM，n个=15）和TRIB3筛选（DM+RNA干扰[RNAi]，n个=15）组。喂食正常饮食的小鼠被用作非糖尿病对照组，分为两组(n个=15）和TRIB3（chow+RNAi，n个=15）组。

用1.5 g/kg体重的葡萄糖对禁食过夜的小鼠进行腹腔内激发。在给糖后的特定时间，用OneTouch SureStep血糖仪（加利福尼亚州Milpitas市LifeScan公司）测量每只动物的尾血血糖水平。

重组腺病毒全长转染TRIB3协议将短发夹RNA从pGenesil-1.2亚克隆到pShuttle载体中。然后，使用pAdxsi腺病毒系统（SinoGenoMax，中国北京）构建重组pAdxsi-腺病毒。扩增后，对病毒进行纯化、滴度测定，并将其储存在−80°C下，直至使用。给所有小鼠5×10⁹尾静脉注射20周及5×10周后病毒的斑形成单位⁹22周时病毒的斑形成单位。周组感染控制病毒（载体）。2周后处死所有小鼠进行进一步研究。

实验结束时，DKO小鼠被禁食一晚，并被过量的戊巴比妥杀死。测定空腹血清胰岛素、葡萄糖、总胆固醇、甘油三酯、LDL胆固醇和HDL胆固醇（HDL-C）。使用稳态模型评估（HOMA）方法计算IR(15).

糖原含量通过酸水解和葡萄糖测量测定(16). 简而言之，将50 mg肝脏在0.5 mL 2 mmol/L HCl中煮沸2 h，并用等体积的2 mmol/L NaOH中和。使用葡萄糖（HK）检测试剂盒（密苏里州圣路易斯Sigma-Aldrich）测量葡萄糖含量。

如前所述，提取了肝脏甘油三酯(16)，并使用甘油三酯定量试剂盒（Abcam，Cambridge，MA）进行测量，遵循制造商的比色测定说明。

所有动物均被麻醉，仰卧在加热的桌子上，并将加热的超声波透射凝胶放置在胸部。使用机械换能器（Vevo 770；VisualSonics，加拿大安大略省多伦多市）中心频率为40 MHz的实时显微可视化扫描头（RMV 704）进行二维成像。内中膜厚度（IMT）测量是根据先前验证的人类方案进行的。对每幅图像进行三组测量。

将小鼠麻醉并处死。用10mL磷酸盐缓冲盐水（PBS）和10mL 4%多聚甲醛（PFA）在生理压力下经降主动脉灌注小鼠心脏30分钟。在4%PFA中孵育过夜后，纵向切开主动脉。为了计算病变面积，在分析之前用油红O（Sigma-Aldrich）染色主动脉。

将腕头动脉嵌入最佳切割温度的复合物中（樱花Finetek，中国北京）。沿着头臂动脉每30μm切开一次切片，并用苏木精和伊红、苦味酸红和尼罗河红染色。使用Image Pro Plus 5.0软件（Media Cybernetics，Inc.，Bethesda，MD）对病变区域进行量化。

对于抗单核细胞+巨噬细胞抗体（MOMA-2）和α-平滑肌肌动蛋白染色，冷冻切片用4%PFA固定20分钟，然后在室温下用PBS冲洗15分钟。然后将截面浸入3%H中₂O（运行）₂冲洗后转移到5%的正常山羊血清中，然后用大鼠抗鼠MOMA-2抗体（Abcam，Cambridge，U.K.）和辣根过氧化物酶结合山羊抗鼠二级抗体染色。最后，用DAB（中国北京索拉比奥）制作切片，并用苏木精对部分切片进行复染。α-平滑肌肌动蛋白染色的过程与MOMA-2染色的过程相似。用Image Pro Plus 5.0对染色区域进行量化。

脆弱性指数计算为（巨噬细胞+细胞外脂质）/（SM细胞+胶原纤维）的比率(17). 对于转移酶介导的dUTP镍标记（TUNEL）染色，用原位细胞死亡检测试剂盒-POD或原位细胞死亡测试试剂盒-TMR红色（德国曼海姆罗氏）对切片进行染色。简而言之，将切片在室温下浸泡在PBS中15分钟，在冰上的渗透溶液中培养2分钟，转移到TUNEL反应混合物中，并在黑暗中37°C的增湿大气中培养60分钟。通过将切片转移到PBS停止标记。试剂盒中提供了所有试剂，PBS除外。

在0.5 mL无菌PBS中腹腔注射40μg伴刀豆球蛋白A（Sigma-Aldrich）后3天，从24周龄雄性DKO小鼠的腹腔内采集巨噬细胞。用5 mL HyClone Dulbecco改良的Eagle’s培养基（DMEM；Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA）两次灌洗腹腔，用MOMA-2抗体对等分细胞进行染色。一般来说，72小时后分离出的细胞中95%为MOMA-2阳性。

用24孔Costar-Transwell板（5μm）进行细胞迁移分析。在通宵饥饿后，我们将75000个腹腔巨噬细胞装入上腔。用DMEM中的单核细胞趋化蛋白-1（100 ng/mL；PeproTech，Inc.，Rocky Hill，NJ）溶液填充下部腔室。在37°C下孵育6小时后，粘附在插入物两面的巨噬细胞被固定并用结晶紫（Sigma-Aldrich）染色。用棉签清除膜上侧的巨噬细胞。计算下侧巨噬细胞的平均数量。

将500万腹膜巨噬细胞加入预涂有50μg/mL聚赖氨酸（Sigma-Aldrich）的Costar培养板中。37°C孵育10分钟后，用DAPI染色粘附细胞，并在荧光显微镜下计数。

腹腔巨噬细胞以1×10的密度接种到12孔板或玻璃底微孔皿（MatTek Corporation，Ashland，MA）中⁶细胞/孔在37°C下放置3小时。在37°C下，将培养基改为含有10μg/mL Alexa Fluor 488 AcLDL（分子探针、Invitrogen、Eugene、OR）的DMEM培养10分钟。过度乙酰化的LDL被冲走，巨噬细胞通过胰蛋白酶分离并通过流式细胞仪进行分析（FACSCaliber；BD Biosciences Franklin Lakes，NJ）。将玻璃底部微孔皿中的样品固定并用DAPI染色，然后在激光扫描共焦显微镜下观察（Leica TCS SP2；Leica，Wetzlar，德国）。

用TRIzol试剂（Invitrogen）从每个主动脉中分离总RNA。总RNA通过分光光度法定量，并使用M-MLV逆转录酶系统（Promega，Madison，WI）和寡核苷酸（dT）引物进行反转录。mRNA水平TRIB3协议按照制造商的说明，使用10 ng总RNA，通过SYBR green（Applied Biosystems）实时PCR检测。PCR引物TRIB3协议为5′-TCAAGCTTGCGTCTTTGTC-3′（正向）和5′-AGCTGTATCTCG GTCCCACGTA-3′（反向）；β-actin分别为5′-CAACTTGATGTATGAAGGCTTTGGT-3′（正向）和5′-ACTTTTATGCTCAAGTCATAC-3′（反向）。所有获得的值均归一化为小鼠β-肌动蛋白。

组织在液氮中快速冷冻，粉碎，并在冰镇裂解缓冲液（Solarbio）中再次悬浮。蛋白质浓度用Bradford法测定。允许裂解液在冰上溶解30分钟，并通过离心（15000克)在4°C下保持15分钟。用SDS-PAGE分析上清液。使用的主要抗体包括TRIB3多克隆抗体（p-Ab）（Imgenex，加利福尼亚州圣地亚哥）和Akt p-Ab、phospho-Akt473 p-Ab，裂解的caspase 3 p-Ab和caspase 3p-Ab（马萨诸塞州丹佛市细胞信号技术）。次要抗体是辣根过氧化物酶标记的抗体（伊利诺伊州罗克福德的Thermo Scientific Pierce）。使用Pierce ECL Western印迹底物（Thermo Scientific Pierce）处理印迹以增强化学荧光。

所有数据均以平均值±标准差表示，并由配对和非配对双尾学生进行分析t吨测试、单向方差分析和2×2析因方差分析（视情况而定）。值为P（P）<0.05被认为是显著的。使用SPSS 13.0软件（伊利诺伊州芝加哥SPSS Inc.）对数据进行分析。

为了建立一个与人类糖尿病动脉粥样硬化疾病非常相似的非遗传啮齿动物模型，经IPGTT证实，仅HFD可在6周后诱导IR，而HFD和STZ联合治疗可导致明显的高血糖和IR(图1B). 实验结束时，糖尿病小鼠的血糖仍显著升高(P（P）= 0.026,表1). 在9周龄时，糖尿病小鼠的平均体重显著高于正常饮食小鼠(图1A).

高分辨率超声检查显示糖尿病小鼠动脉中有动脉粥样硬化斑块(图1C)20周龄时，DM小鼠的主动脉和头臂IMT显著高于chow小鼠，24周龄时无显著差异。然而，在24周时，DM小鼠的颈动脉IMT显著增加(图1D). HFD/STZ小鼠模型显示出典型的T2DM特征，即高血糖、IR和肥胖，这些特征在整个实验过程中可能持续存在。正如超声波显示的那样，这些糖尿病小鼠表现出明显更多的动脉粥样硬化。

相对mRNA表达TRIB3协议与饱食组小鼠相比，糖尿病组小鼠主动脉中的脂肪含量显著增加（4.97±1.30 vs.1.69±0.76，P（P）= 1 × 10⁻⁷)而TRIB3的沉默显著降低了相对TRIB3协议糖尿病患者的mRNA表达（4.97±1.30 vs.1.59±0.52，P（P）= 1 × 10⁻⁷)与35.50%相比，周鼠减少了68.01%（1.69±0.76对1.09±0.32，P（P）= 2 × 10⁻⁴).

在该小鼠模型中敲除TRIB3导致糖尿病小鼠的血糖显著降低(P（P）= 0.019,表1)在小鼠中（7.00±4.54对3.80±1.71，P（P）= 0.033,表1). 然而，TRIB3的DM和RNAi沉默没有表现出显著的相互作用(P（P）= 0.375,表1). 此外，TRIB3的沉默对HOMA-IR也有类似的影响(表1). TRIB3沉默不会显著改变体重、胰岛素、胆固醇和低密度脂蛋白水平。进一步研究表明，肝糖原含量显著增加（2.59±0.30 vs.4.79±0.57，P（P）= 2 × 10⁻⁷,表1)TRIB3无反应，但肝甘油三酯水平无反应(表1).

无论糖尿病状态如何，沉默TRIB3都能减少主动脉斑块的数量和大小。面对面检查显示，DM小鼠的动脉粥样硬化病变覆盖面积明显大于chow小鼠（30.99±3.12 vs.17.00±3.12%，P（P）= 1 × 10⁻¹⁷,图2B和C类). 转染后4周，与DM+RNAi小鼠相比，DM小鼠的病变面积显著减少（30.99±3.12 vs.22.54±2.13%，P（P）= 1 × 10⁻¹³,图2B和C类). 此外，与chow小鼠相比，chow+RNAi小鼠的动脉粥样硬化负荷显著降低（5.43±1.22 vs.17.00±3.12%，P（P）= 4 × 10⁻¹⁴,图2B和C）。

在小鼠的头臂动脉中发现了自发性斑块破裂(18). 与饱食组小鼠相比，糖尿病组小鼠的纤维帽厚度显著降低(P（P）= 2 × 10⁻⁶,表2和图3,上部面板)但与DM小鼠相比，DM+RNAi小鼠中显著增加(P（P）= 0.021,表2和图3,上部面板)，在吃过食物的老鼠中没有变化。进一步的因子分析表明，DM和RNAi在纤维帽厚度方面存在显著的相互作用(P（P）= 1 × 10⁻⁹,表2和图3,上部面板)表明沉默TRIB3在糖尿病中的益处。因为TRIB3的沉默会改善代谢，即使在调整了血压、血糖和HDL-C后，也会显著增加糖尿病小鼠的冠层厚度(P（P）= 0.021,表2).

在当前的研究中，糖尿病小鼠的帽芯比明显低于饱食组小鼠(P（P）=0.033），同时沉默TRIB3显著增加DM的比率(P（P）=0.025）和吃老鼠(P（P）=0.043）。进一步的因子分析显示DM和RNAi之间没有显著的交互作用(P（P）=0.625），表明沉默的TRIB3和DM独立地对该比率产生影响。然而，调整血压、血糖和HDL-C后，TRIB3的沉默对比率没有影响(P（P）= 0.914,表2).

调整血压、血糖和HDL-C后，DM小鼠的胶原蛋白含量显著低于cho小鼠(P（P）= 0.004,表2和图3,中间面板)，而与DM小鼠相比，DM+RNAi小鼠的表达量显著增加(P（P）= 0.02,表2和图3,中间面板)，在进食小鼠中没有差异。随后的因子分析显示DM和RNAi之间存在显著的交互作用(P（P）= 0.013,图3,中间面板). 调整血压、血糖和HDL-C后，未发现DM和RNAi之间存在显著交互作用(P（P）= 0.215,表2). 进一步研究表明，沉默TRIB3可以显著增加糖尿病患者的胶原蛋白I-III比率(P（P）=0.034）和吃老鼠(P（P）= 0.038,图3,中间面板)增加I型胶原蛋白的比例以稳定斑块。然而，在调整血压、血糖和HDL-C后，TRIB3的沉默对胶原蛋白I-III比率没有影响(表2).

与chow小鼠相比，DM小鼠的其他细胞外成分脂质显著增加(P（P）= 0.032,表2和图3,底部面板)调整血压、血糖和高密度脂蛋白胆固醇后，TRIB3的沉默并没有显著改变。

细胞成分，即平滑肌细胞，未被DM显著改变，但随着TRIB3沉默而显著增加。然而，DM小鼠的巨噬细胞含量显著高于chow小鼠(P（P）= 0.0005,表2和图3,底部面板)调整血压、血糖和HDL-C后，TRIB3的沉默没有显著改变。

描述斑块稳定性的易损性指数在DM小鼠中显著高于chow小鼠(P（P）= 0.004,表2)调整血压、血糖和HDL-C后，TRIB3的沉默显著降低了DM患者的脆弱性指数(P（P）= 0.015,表2)但不是吃老鼠。进一步的因子分析表明，DM和RNAi在脆弱性指数方面没有显著的交互作用(P（P）= 0.245,表2)表明沉默TRIB3和DM独立地影响脆弱性指数。即使不调整血压、血糖和HDL-C，TRIB3的沉默也能显著降低脆弱性指数(表2).

DM小鼠的细胞凋亡显著高于正常小鼠（201.00±61.01 vs.85.63±38.46，P（P）= 0.00003,图4)与DM小鼠相比，TRIB3沉默显著降低了DM+RNAi小鼠的细胞凋亡（201.00±61.01 vs.95.86±39.80，P（P）= 0.0001,图4)，对小鼠无影响。进一步的因子分析显示DM和RNAi在凋亡方面存在显著的相互作用(P（P）= 0.007,图4).

为了评估巨噬细胞在斑块稳定性中的作用，对巨噬细胞凋亡进行了分析。我们发现糖尿病小鼠皮损中TUNEL阳性、MOMA-2阳性的巨噬细胞数量显著高于正常小鼠（108.80±33.44 vs.48.31±28.39，P（P）= 0.0001,图4). 与DM小鼠相比，沉默TRIB3显著降低了DM+RNAi小鼠皮损中巨噬细胞的凋亡（46.20±15.21 vs.108.80±33.44，P（P）= 0.00006,图4)，对小鼠无影响。进一步的因子分析表明，DM和RNAi在巨噬细胞凋亡方面存在显著的相互作用(P（P）= 0.013,图4)表明在DM中沉默TRIB3的益处。

糖尿病小鼠的TRIB3水平高于饱食组小鼠(图5,车道4与。车道2). 相应地，Akt的磷酸化水平较低(图5,车道4与。车道2)因此，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3在糖尿病小鼠中上调。然而，沉默TRIB3增加了DM+RNAi小鼠Akt的磷酸化(图5,车道3与。车道4). 同时，在DM+RNAi小鼠中检测到caspase-3下调。这些现象也在老鼠身上观察到。

为了测试TRIB3沉默是否对巨噬细胞粘附、迁移和吞噬功能产生影响，对四个不同组的腹腔巨噬细胞进行了检测。我们首先通过Transwell迁移分析检测了TRIB3缺陷对趋化性的影响。DM小鼠的巨噬细胞迁移明显多于chow小鼠（14.00±2.45 vs.5.60±2.37，P（P）= 1 × 10⁻⁸,图6A和E类). 与DM小鼠相比，TRIB3沉默显著降低了DM+RNAi小鼠的巨噬细胞迁移（7.10±3.28 vs.14.00±2.45，P（P）= 4 × 10⁻⁴,图6A和E类). 两组小鼠分离的细胞中巨噬细胞的迁移是等效的(P（P）= 0.603,图6A和E类). 进一步的因子分析表明，DM和RNAi在巨噬细胞迁移中存在显著的相互作用(P（P）= 4 × 10⁻⁴,图6E)，表明在DM中沉默TRIB3的益处。

DM小鼠腹腔巨噬细胞与聚赖氨酸涂层表面的粘附性显著增加（44.83±8.81 vs.25.71±2.50%，P（P）= 3 × 10⁻⁴,图6B和F类). 与chow小鼠相比，TRIB3沉默显著增加了chow+RNAi小鼠的巨噬细胞粘附（34.07±9.00 vs.25.71±2.50%，P（P）=0.020，图6B和F类)，对糖尿病小鼠无影响(P（P）=0.515，图6B和F类). 进一步的因子分析表明，DM和RNAi对巨噬细胞粘附无显著交互作用(P（P）=0.142），这表明沉默TRIB3和DM独立地影响巨噬细胞粘附。

流式细胞术分析显示，DM小鼠巨噬细胞的吞噬能力显著高于chow小鼠（47.50±15.92 vs.27.67±0.77，P（P）= 0.004,图6G,C、，和D类). TRIB3的沉默显著增加了巨噬细胞的吞噬功能，而与糖尿病无关(图6G,C、，和D类). 进一步的因子分析表明，DM和RNAi对巨噬细胞吞噬作用无显著交互作用(P（P）=0.131），这表明沉默TRIB3和DM独立地对巨噬细胞吞噬作用产生影响。

由于IR可触发糖尿病和动脉粥样硬化的发展，而TRIB3参与IR，因此我们旨在研究TRIB3是否与小鼠糖尿病动脉粥样硬化有关。我们发现，在糖尿病动脉粥样硬化小鼠模型中，体内沉默TRIB3改善了代谢，减轻了动脉粥样硬化病变负担，并稳定了动脉粥样硬化斑块。从机制上讲，这种表型归因于促动脉粥样硬化途径的减少，如Akt磷酸化增加、IR改善和巨噬细胞凋亡减少。据我们所知，这些发现为TRIB3与糖尿病动脉粥样硬化直接相关的分子机制提供了新的见解。

发现TRIB3抑制胰岛素刺激的Akt磷酸化(三)并调节啮齿动物肝脏的糖异生(19). 一些研究表明，TRIB3诱导是人类IR和糖尿病的一种新的分子机制(5,7,8). 先前的研究已经描述了TRIB3的获得性功能突变与IR和相关异常相关(9–11). 在目前的研究中，TRIB3在糖尿病小鼠模型中的表达更高。此外，TRIB3的沉默可以改善IR和降低血糖，这可能归因于Akt磷酸化的增加，这对胰岛素信号至关重要(三).

TRIB3在动脉粥样硬化不稳定斑块中上调(20). 研究表明，TRIB3被氧化低密度脂蛋白上调(21)并介导人单核细胞源性巨噬细胞凋亡(22). 然而，TRIB3沉默对斑块进展的影响仍有待专门研究。在这里，我们检测到糖尿病动脉粥样硬化小鼠中TRIB3上调，并伴有动脉粥样硬化斑块中巨噬细胞凋亡增加。随着TRIB3的沉默，主动脉粥样硬化负荷和病变形成减轻。此外，来自非糖尿病小鼠的数据显示，即使IR没有显著改善，TRIB3的沉默也可以减轻动脉粥样硬化负担。

动脉粥样硬化斑块的一些表型特征，如纤维帽厚度、胶原含量、斑块帽芯比和巨噬细胞数量，已被广泛用作斑块稳定性的指标。我们证实，DM小鼠的纤维帽比chow小鼠薄，沉默TRIB3可能导致纤维帽变厚。纤维帽由胶原蛋白组成，我们发现DM小鼠斑块的胶原蛋白含量低于chow小鼠，而TRIB3的沉默增加了斑块的胶原质含量以稳定斑块。

具有薄纤维帽和大脂核的斑块被认为是脆弱的(23). 因此，我们分析了帽芯比以确定斑块易损性。糖尿病小鼠的这一比率低于饱食组小鼠，TRIB3的沉默提高了稳定斑块的比率。然而，在控制代谢因子时，TRIB3的沉默对该比率没有影响，这表明该比率可能更多地依赖于代谢。脆弱性指数的调查表明，在控制代谢因素时，TRIB3的沉默增加了斑块的稳定性。

巨噬细胞被认为处于IR和动脉粥样硬化的十字路口(13). 巨噬细胞中的IR更容易发生细胞凋亡，可能会促进动脉粥样硬化的发展，从而增加其脆弱性。因此，TRIB3的沉默可以改善体内糖尿病动脉粥样硬化的IR，从而减少巨噬细胞凋亡，这与我们的体外研究结果一致(12).

进一步研究表明，来自DM小鼠的巨噬细胞表现出增加的迁移、增强的粘附和增强的吞噬作用，而TRIB3的沉默改变了这些。迁移增加表明巨噬细胞募集增强，这在动脉粥样硬化形成中具有重要作用。敲低TRIB3将显著减少巨噬细胞迁移，从而阻止动脉粥样硬化斑块的扩张。依从性增强表明糖尿病条件下组织浸润能力增强。敲除TRIB3只会增加咀嚼小鼠的粘附性，而DM小鼠的粘附功能保持不变，这可能是由于局部清除率增加所致。TRIB3沉默后，两种小鼠的吞噬作用均增强，这表明巨噬细胞吞噬了更多坏死脂质。因此，TRIB3沉默时吞噬功能增强表明吞噬细胞清除率恢复，这将抑制坏死核心的扩张。

尾静脉注射腺病毒基因传递是一种简单有效的体内基因传递方法。由于尾静脉注射，在巨噬细胞中观察到的效应可能来自TRIB3小干扰RNA在这些巨噬细胞中的直接作用，以及TRIB3 mRNA敲低对全身胰岛素敏感性小鼠的间接作用。由于静脉给药具有微创性和易操作性，它越来越多地被用于在动物模型中阐明基因在疾病发病机制中的作用。

总之，我们共同发现，TRIB3的沉默减少了糖尿病动脉粥样硬化小鼠的动脉粥样硬化负担并增加了斑块稳定性，这可能为减少糖尿病状态下动脉粥样硬化形成和促进斑块稳定提供了一种治疗方法。

本研究得到了山东省重点技术研发计划（2006GG22020和2010G0020262）、山东省自然科学基金（Y2005C11、ZR2009CM022、ZR2009CM025和BS2009YY026）、，国家自然科学基金（30670874、30871038、30971215、81070192、81070111和81100605）和国家基础研究计划（973计划，批准号：2009CB521904）。

没有报告与本文相关的潜在利益冲突。

Z.h.W.写了手稿并研究了数据。Y.-Y.S.和S.Z.研究了数据。M.Z.、J.-t.D.和J.P.审查并编辑了手稿。X.-p.W.参与了讨论，并审查和编辑了手稿。Y.Z.研究了数据并参与了讨论。W.Z.写了手稿。