硬脑膜淋巴管系统，用于排出脑间质液和大分子

大脑被脑膜衬里所包裹，脑膜衬里由三层组成：软脑膜紧紧贴附在大脑表面，蛛网膜下腔上覆盖着无血管蛛网膜，血管化的硬脑膜与颅骨融合。为了确定中枢神经系统和周围脑膜内是否存在淋巴管，我们分析了Prox1-GFP传感器和素食者3^+/LacZ公司报告小鼠和WT小鼠颅骨和大脑针对LYVE1、PROX1、PDPN、CCL21、VEGFR3和PECAM1的整体免疫荧光制剂。为了可视化血管Prox1绿色荧光蛋白用荧光染料1,1′-二十八烷基-3,3,3′，3′-四甲基吲哚碳菁（DiI；Li等人，2008年)。

从颅骨中取出大脑后，在脑实质或软脑膜上看不到淋巴管（未描绘）。然而，在颅骨下方的脑膜中观察到一个惊人的广泛淋巴管网络(图1，A–J; 和视频1). 在内颅骨的矢状面上，观察到淋巴管沿着横窦、乙状窦、关节盂后静脉、口侧鼻静脉以及脑膜中动脉和脑膜前动脉的主要分支向下延伸至颅底(图1、B和D; 和视频1). 在颅骨上部的准备过程中，沿上矢状窦、横窦、口鼻腔静脉和脑膜中动脉可见淋巴管(图1、E和F). 沿着翼腭动脉的脑膜部分，可以观察到大量淋巴管从颅骨流出，翼腭血管是颈内动脉的一个分支，从颅骨内外潜入，形成脑膜中动脉(图1 I). 乙状窦和肩胛后静脉的淋巴管沿静脉从颅骨流出(图1、B和D). 在颅底的准备过程中，可以在几个颅神经（视神经、三叉神经、舌咽神经、迷走神经和附件）的远端看到淋巴管，沿着神经离开颅骨(图1，G和H). 筛板的硬脑膜衬里中也可以观察到淋巴管，其中一些血管穿过颅骨进入鼻粘膜(图1、G和J)。

一般来说，颅骨上部的淋巴管相对稀少，而颅底包含更广泛的淋巴管网络(图1 A). 有趣的是，只有颅底的淋巴管含有瓣膜，但它们的分布相对较少。阀门被无阀血管段的长延伸分开(图1，B–D)。

为了确定这些血管相对于脑膜的位置，分析了厚颅骨切片。在这些制剂中，PROX1和CCL21阳性淋巴管出现在颅骨骨质部分下方的脑膜中，靠近硬脑膜血管(图1 K)。

上矢状淋巴管的整体免疫荧光染色显示，与传统淋巴管一样，硬脑膜淋巴管表达极低水平的PECAM1(图1 L)但LYVE1、PDPN、VEGFR3、CCL21和PROX1水平较高(图1，M–P;Aspelund等人，2014年). 因此，硬脑膜淋巴管由末端分化的淋巴管内皮排列。

总的来说，这些数据表明，中枢神经系统的硬脑膜中存在淋巴管，并通过颅底孔沿着动脉、静脉和颅神经排出颅骨。我们根据这些淋巴管的静脉、动脉或颅神经对应物来命名这些淋巴管。血管的定位提示了脑脊液通过蛛网膜吸收的可能作用。

注射到大脑ISF中的示踪剂已被证明可以通过glymphatic系统转移到CSF中，并进一步转移到dcLNs中(Koh等人，2005年;Iliff等人，2012年;Plog等人，2015年). 然而，尚不清楚这些示踪剂是如何进入LN的。我们假设硬脑膜淋巴管吸收脑内ISF和CSF。为了测试这一点，我们注入了明亮的近红外染料IRDye 680（PEG-IR染料；Proulx等人，2013年)进入脑实质Prox1-GFP传感器老鼠。注射后2小时，观察到示踪剂通过静脉旁途径离开大脑进入脑脊液空间（未描述），如之前所述(Iliff等人，2012年). 脑ISF的淋巴引流通过在dcLN中观察到强烈信号而不是在颈浅LNs（scLNs；图2，A和B). 观察到优先引流至注射侧的同侧dcLN(图2，A和C). 当追踪充满示踪剂的dcLN传入淋巴管上游时，这些淋巴管似乎从颅底流出(图2、C和D). 在头骨内部，仅在头骨的基底部分观察到硬脑膜淋巴管的一些PEG-IRDye填充(图2、E和F)表明淋巴管吸收，但很快就会被冲走。当结扎dcLN的传出淋巴管时(图2、G和H)，硬脑膜淋巴管充盈增强(图2，I–K). 这些数据表明，硬脑膜淋巴管从蛛网膜下腔吸收脑内ISF/CSF，并将其转运至下游dcLNs。

通过VEGFR3的VEGF-C/D信号是淋巴管生成的关键调节器(Secker和Harvey，2015年). 为了（a）研究硬脑膜淋巴管是否受VEGFC/D–VEGFR3信号调节，以及（b）确定一个可以检测硬膜淋巴管再生障碍的功能后果的动物模型，我们研究了K14-VEGFR3-Ig转基因（TG）小鼠，其VEGF-C/D–VEGFR3信号受损。这些小鼠表达一种可溶性VEGF-C/D陷阱蛋白，该蛋白由VEGFR3的配体结合Ig同源结构域1-3与Igγ的Fc结构域融合而成(Mäkinen等人，2001年). 虽然VEGF-C/D trap转基因在角质形成细胞中表达，但循环蛋白抑制大多数组织中的淋巴管生成，小鼠表现为LN发育不全(Mäkinen等人，2001年;Alitalo等人，2013年). 与WT同窝小鼠相比，TG小鼠颅骨上部和底部均无淋巴管(图3，A–F). 令人惊讶的是，小鼠只表现出缺乏scLNs，而没有dcLNs(图3，G–I; 和图4C). 这些数据表明，硬脑膜淋巴管对VEGF-C/D信号的抑制非常敏感，并且硬脑膜的淋巴管对血管内皮生长因子-C/D的信号传导非常敏感K14-VEGFR3-IgTG小鼠是研究大脑淋巴引流缺失的功能后果的合适模型。

首先，我们假设硬脑膜淋巴管的缺失会损害ISF和溶质从大脑中的清除。因此，在TG和WT小鼠中测量了脑含水量和ISF压力（IFP）。令人惊讶的是，IFP（TG vs.WT：2.50±0.54 vs.2.53±0.53 mmHg，P=0.92，n个=6/组）和含水量（TG vs.WT:3.68±0.023 vs.3.71±0.043 g/g干重，P=0.27，n个=4/组），两组之间无显著差异。这些结果表明，在生理条件下，大脑有其他方法来管理从血管中溢出的液体。

其次，我们假设硬脑膜淋巴管的缺失可能会损害脑内大分子的清除。为了验证这一点，我们研究了Alexa Fluor 488共轭OVA（A488-OVA，～45 kD）的大脑清除率，这是一种在固定过程中保留荧光信号的大分子。在TG和WT同窝小鼠脑实质注射后2 h，我们记录了脑组织、dcLN和硬脑膜淋巴管荧光。小鼠在处死后进行灌注固定，以防止示踪剂流出。有趣的是，TG小鼠在注射后2小时的时间点表现出OVA清除量的显著减少(图4，A和B). 此外，在TG小鼠的dcLNs中观察到OVA积累几乎完全消除(图4、C和D). 在WT小鼠翼腭动脉和脑膜中动脉周围可以观察到充满示踪剂的淋巴管，但在TG小鼠中没有这种现象(图4、E和F). 为了评估引流缺陷的其他可能原因，我们分析了脂肪族功能和dcLN的引流能力。在这种程度上，TG小鼠没有显示出glymphastic功能的质量缺陷，正如在内皮下和血管周间隙中可检测到的血管旁流出的示踪剂所示(图4、G和H)或dcLN中引流淋巴管数量显著减少(图4、I和J). 我们还研究了大池注射后PEG-IRDye从蛛网膜下腔转移到dcLNs的情况，这在TG小鼠中明显受到抑制(图5). 总的来说，这些数据表明硬脑膜淋巴管有助于清除大脑中的大分子。

在这项研究中，我们报告了中枢神经系统硬脑膜中令人惊讶的淋巴管网络发现，硬脑膜淋巴管由完全分化的PROX1排列⁺/血管内皮生长因子3⁺/LYVE1系列⁺/PDPN（PDPN）⁺/CCL21型⁺/PECAM1公司^低的淋巴管内皮在其形态和瓣膜稀少方面是独特的。18世纪末，意大利解剖学家保罗·马斯卡尼（Paolo Mascagni）描述了脑膜和大脑表面的淋巴管，但他的发现无法重现(马斯卡尼和贝里尼，1816年;Lukić等人，2003年). 自那时以来，中枢神经系统本身被认为缺乏淋巴管。顺便提一下，在大鼠硬脑膜神经支配的电子显微镜研究中提到了淋巴管。此外，还检测到与小鼠筛状板和人类视神经相关的淋巴管(Andres等人，1987年;Gausas等人，2007年;Furukawa等人，2008年). 然而，硬脑膜淋巴网络的范围，或其在脑脊液清除中的作用，尚未认识到。

根据经典的教科书模型，脑脊液由脉络丛产生，流经脑室和蛛网膜下腔，被蛛网膜颗粒吸收并输送至脑静脉窦(2010年，波利). 然而，最近的发现已经证实，glymphatic系统是脑废物清除的关键调节因子，尤其是在睡眠期间(Iliff等人，2012年;谢等人，2013). 除了通过蛛网膜颗粒清除脑脊液外，几项研究已经证实，部分脑内ISF和CSF被排至颈部淋巴结，但目前尚不清楚CSF如何进入淋巴结(Koh等人，2005年;Weller等人，2009年). 筛板下鼻淋巴管中脑脊液示踪剂的观察表明通过嗅神经鞘通过筛板清除(Kida等人，1993年;Koh等人，2005年). 此外，观察到脑脊液清除沿脊髓和颅神经鞘发生，随后进入颅外淋巴管(Miura等人，1998年;Weller等人，2009年)。

我们的数据表明，软脑膜内注射示踪剂后，硬脑膜淋巴管充盈，而硬脑膜内缺乏示踪剂K14-VEGFR3-IgTG小鼠。这表明了一种模型，在该模型中，脑ISF的一部分，即glymphatic系统下游，作为脑脊液直接从蛛网膜下腔清除进入硬脑膜淋巴管。有趣的是，我们还观察到沿颅神经硬脑膜流出颅骨的淋巴管。此外，我们观察到淋巴管穿过筛板，这可能解释了之前的一些观察结果。由于脑脊液间隙和颅外淋巴管之间缺乏其他已知的直接解剖联系，硬脑膜淋巴管可能是颅外淋巴室最重要的脑脊液来源。

对于患有阿尔茨海默病和其他神经退行性疾病的患者来说，了解脑废物管理机制的重要性得到了强调，这些疾病的特点是错误折叠的蛋白质（如淀粉样β）在病理学上积聚到脑实质中(Deane等人，2008年;Huang和Mucke，2012年). 在其他组织中，淋巴管对大分子的吸收至关重要(Tammela和Alitalo，2010年). 在生理条件下，大脑中淀粉样β的主要部分通过血管途径被清除(兹洛科维奇，2011年;赵等，2015). 然而，最近的证据表明，glymphatic系统也可能是淀粉样β清除的关键(Iliff等人，2012年). 目前的数据表明，缺乏硬脑膜淋巴引流导致OVA从脑间质的清除受到抑制，这表明硬脑膜的淋巴管对脑ISF和CSF中大分子的吸收至关重要。

重要的是，这些发现为研究开辟了新的途径。可以预见硬脑膜淋巴管的其他几个潜在作用，例如在脑免疫细胞的运输、在dcLN中的抗原提呈以及在清除脑水肿中。这些数据也可以解释为什么原发性脑肿瘤很少转移到宫颈淋巴结(Mondin等人，2010年). 有趣的是，手术切除dcLN会导致小鼠认知功能障碍(Radjavi等人，2014年)据报道，结扎颈深淋巴管会增加大鼠脑水肿和梗死体积，从而加重中风后的脑缺血(Si等人，2006年). 应进行进一步的研究，以确定硬脑膜淋巴管在中枢神经系统稳态和疾病中的全部作用。

这项研究得到了芬兰南部地区动物实验委员会的批准。

这个K14-VEGFR3型_1-3-免疫球蛋白（FVB/N和C57BL/6J背景；Mäkinen等人，2001年),Prox1-GFP传感器（C57BL/6J白化背景；Choi等人，2011年)、和素食者3^+/LacZ公司（FVB/N背景；Dumont等人，1998年)鼠标线之前已经发布过。以WT同窝小鼠为对照。对于WT分析，使用C57BL/6J小鼠。为了进行组织分析，小鼠被给予致死剂量的氯胺酮和甲苯噻嗪，并在右心房穿刺后用冰镇1%多聚甲醛（PFA）通过左心室灌注固定。立即将组织浸泡在4%冰镇PFA中，并在4°C下固定过夜，在PBS中清洗，然后进行染色处理。Prox1-GFP传感器小鼠组织新鲜成像，未固定。

为了对用于激光扫描共焦显微镜的颅骨进行整体染色，对固定颅骨进行解剖，并在4°C下使用0.5 M EDTA（pH 7.4）过夜进行轻度脱钙。对于用于荧光立体显微镜的颅底全山染色，未进行脱钙。用PBS清洗后，组织在0.3%Triton X-100中的PBS（PBS-TX）中渗透，并在5%驴血清/2%牛血清白蛋白/0.3%PBS-TX.将一级抗体添加到封闭缓冲液中，并与组织在室温下培养过夜（RT）。在PBS-TX中清洗后，组织在RT中与PBS-TX中的荧光结合次级抗体孵育过夜，然后在PBS-T中清洗。在1%PFA中固定后，用PBS清洗颅骨的上部，并安装在含有1,4-二氮杂二环的Mowiol 4-88安装介质（Sigma-Aldrich）中[2.2.2]辛烷（DABCO；Sigma-Aldrich）并用Cytoseal（Thermo Fisher Scientific）密封。在Cytoseal和Mowiol变硬之前，用衣夹将盖玻片和显微镜载玻片夹在一起。用于荧光立体显微镜的组织存储在PBS中并立即成像。

对于颅骨的冷冻切片，固定组织用0.5 M EDTA脱钙，pH 7.4，72小时，在4°C下浸泡在20%蔗糖和2%聚乙烯吡咯烷酮（PVP）中24小时，包埋在OCT化合物（Tissue-Tek）中，并在−80°C下冷冻保存。对于其他冷冻切片，将固定组织浸入25%的蔗糖中，并如上所述进行包埋。使用低温恒温器（Microm HM 550；Thermo Fisher Scientific）将组织切割成10–100-µm的切片。将切片风干，用pap笔包围，在PBS中再水化，并在室温下用PBS-TX中的3%BSA封闭。在4°C下在PBS中的3%BSA中孵育过夜后，用PBS洗涤切片，并用适当的荧光团缀合的第二抗体缀合物和PBS中的3%BSA孵育2-3小时。用0.1%PBS-TX清洗后，用含有DAPI（Vector Laboratories）的Vectashield安装介质安装节段。用于头骨的X-gal染色LacZ公司报告小鼠，组织用0.2%戊二醛固定，并按已公布的方案用β-半乳糖苷酶底物X-Gal（Promega）染色(Karkkainen等人，2004年)。

血管Prox1绿色荧光蛋白如前所述，用荧光亲脂碳菁染料DiI对小鼠进行心脏灌注标记(Li等人，2008年). 用荧光立体显微镜观察掺入EC膜的DiI。

以下主要抗体用于小鼠组织的免疫染色：兔抗鼠PROX1（1:200；Petrova等人，2008年)、山羊抗人PROX1（1:500；研发系统）、多克隆山羊抗小鼠VEGFR3（1:50；研发系统；Karkkainen等人，2004年)，山羊抗CCL21（1:500；研发系统），兔多克隆抗小鼠PDPN的IgG部分（1:500，由奥地利维也纳大学D.Kerjaschki提供；Wick等人，2007年)和大鼠抗小鼠内粘蛋白（EMCN；1:500；克隆V.7C7；Santa Cruz Biotechnology，Inc.）。用适当的Alexa Fluor 488、568/594或633/647二级抗体结合物（1:500；分子探针/Invitrogen）检测一级抗体。

为了评估流出途径和清除脑间质中的示踪剂，用80 mg/kg氯胺酮（氯胺酮；辉瑞）和6 mg/kg甲苯噻嗪（Rompun vet；KVP Pharma+Veterinär Produke GmbH）或160 mg/kg氯胺（纳克坦；Vétoquinol）和0.4 mg/kg美托咪定（多米托；Orion Pharma）的混合物麻醉小鼠并放入立体定向装置中。做一个中线皮肤切口，露出颅骨，用牙钻将颅骨变薄，侧钻约2 mm，尾钻至前角2.5 mm。4 mg/ml A488-OVA（O-34781；分子探针）或20µM 20-kD PEG-IRDye（由P.Luciani和J.-C.Leroux提供，瑞士苏黎世苏黎世ETH；Proulx等人，2013年)用34-G Hamilton针头以0.1µl/min的速率，用注射泵（哈佛仪器）在5分钟内，以0.5µl的浓度从前缘向2-mm深处注射。在指定的时间后，用致死剂量的麻醉将小鼠处死。为了可视化PEG-IRDye，立即对组织进行体外成像。为了观察A488-OVA，对小鼠进行灌注固定，将带有颈部LN的整个头部和颈部浸泡在4%冰镇PFA中，并在4°C下持续摇晃，再进一步固定过夜。然后在PBS中清洗固定组织，并如上所述进行成像或染色。

为了评估PEG-IRDye从蛛网膜下腔的清除率，用160 mg/kg氯胺酮（Narketan）和0.4 mg/kg美托咪定（Domitor）的混合物麻醉小鼠，并将其置于立体定向框架中。通过一个小的中线切口直接解剖颈部肌肉，露出枕大池上方的硬脑膜。用34-G Hamilton针以2µl/min的速度，在5分钟内用注射泵将20µM的20-kD PEG-IRDye以10µl的浓度注入蛛网膜下腔。

用LSM 780显微镜以高分辨率获得荧光标记样品的激光扫描共聚焦显微照片（卡尔蔡司；空气物镜10×Plan-Apochromat，NA 0.45；20×Plan-Apochromat（NA 0.80）；油物镜40×Plan-Neofluar，NA 1.3，油物镜63×Plan-Adochromat和NA 1.4）在帧中使用多通道扫描。ZEN 2010软件（卡尔蔡司）用于图像采集。

使用Axio Zoom获得标记样品的荧光立体显微照片。V16荧光立体变焦显微镜（卡尔蔡司）配备ORCA-Flash 4.0数字sCMOS相机（哈马松光电公司）或OptiMOS sCMOS照相机（QImaging）。ZEN 2012软件（卡尔蔡司）用于图像采集。使用配备XFO-6（Dolan-Jenner Fiber-Lite PL-900照明器；石英卤素灯）的Caliper IVIS动力学成像系统（PerkinElmer）获得脑外荧光图像，用于荧光成像和iXon⁺888 EMCCD摄像头（Andor Technology）。使用Living Image 3.2软件处理图像并计算感兴趣区域效率。使用ImageJ（美国国立卫生研究院）或Photoshop（Adobe）软件调整图像亮度和对比度。使用ImageJ软件对显微照片进行定量分析。

用二氧化碳处死小鼠。大脑从头骨中取出，放在预先称重的铝箔上，立即称重以获得湿重。在80°C烘箱中脱水5天后记录干重。水分计算为（湿重-干重）/干重。文本中显示的数据代表了两个独立的实验。

用120 mg/kg氯胺酮（Ketalar）和0.24 mg/kg美托咪定（Domitor）的混合物麻醉小鼠，并将其置于立体定向装置中。使用牙钻（外径2 mm），在前角尾侧和外侧2 mm处将颅骨变薄。如前所述，用尖端直径为2-4µm的微量移液管测量脑ISF压力(维格和里德，1983年). 将移液管插入完整的硬脑膜，并记录脑组织内150–300µm的压力。文本中显示的数据代表了三个独立的实验。

所有值均表示为平均值±标准偏差。通过双样本（非配对学生）双尾比较不同组之间的定量数据t吨假设方差相等的检验。采用双向方差分析（ANOVA）和什亚克的事后检验进行多重比较。差异被认为具有统计学意义（P<0.05）。

视频1显示颅骨内部侧面的硬脑膜淋巴管在Prox1-GFP传感器鼠标。

我们感谢Paola Luciani博士和Jean-Christophe Leroux为PEG-IRDye提供的服务；Dontscho Kerjaschki博士检测PDPN抗体；Kirsi Lintula、Riitta Kauppinen、Jarmo Koponen和Tapio Tainola（芬兰赫尔辛基赫尔辛基大学）提供技术援助；生物医学成像装置，用于帮助成像；以及赫尔辛基大学实验动物中心的工作人员，为老鼠工作提供技术援助。

本研究得到了芬兰科学院、Sigrid Juselius基金会、欧洲研究委员会（ERC-2010-AdG-268804）、瑞士国家科学基金会（310030B_147087）、VESSEL-Marie Curie多伙伴血管生物学初始培训网络（EU FP7-PEOPLE-2012-ITN）的资助，Leducq大西洋肥胖症和心血管疾病淋巴管卓越网络（11CVD03；致K.Alitalo和M.Detmar）和挪威研究委员会（222278/F20）。

作者声明没有相互竞争的经济利益。