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.2017年5月；20(5):681-689.
doi:10.1038/nn.4529。 Epub 2017年3月13日。

α-突触核蛋白促进细胞外融合孔的扩张

托德·洛根 1 2, 雅各布·本多 1, 香塔尔·图宾 1, 库尔特·索恩 三, 罗伯特·爱德华兹 1 2
附属公司

α-突触核蛋白促进细胞外融合孔的扩张

托德·洛根等人。 自然神经科学. 2017年5月.

摘要

蛋白α-突触核蛋白在帕金森病的发病机制中起着核心作用。然而，与神经退行性疾病中积累的其他蛋白质一样，α-突触核蛋白的功能尚不清楚。神经末梢的定位表明其在神经递质释放中发挥作用，过表达抑制调节的胞吐作用，但先前的工作未能在缺乏所有三种突触核蛋白亚型的小鼠中发现明显的生理缺陷。利用肾上腺嗜铬细胞和神经元，我们现在发现，过表达和内源性突触核蛋白都会加速单个细胞外事件的动力学，促进货物排泄并减少孔隙闭合（kiss-and-run）。因此，突触核蛋白对细胞外融合孔的扩张具有剂量依赖性作用。值得注意的是，导致帕金森氏病的突变消除了α-突触核蛋白的这一特性，而不会损害其在过度表达时抑制胞吐的能力，这表明正常功能存在选择性缺陷。

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数字

图1
图1。α-突触核蛋白调节肽释放动力学
（a）用编码BDNF-pHfluorin和人α-突触核蛋白（SYN）或空载体（wt）的慢病毒转导wt小鼠的嗜铬细胞。α-突触核蛋白的过度表达减少了45 mM K去极化在50 s内诱发的细胞外事件的数量+。来自TKO突触核的细胞与wt细胞没有差异。*，通过单因素方差分析，p=0.01（F（2,54）=4.991）。n=每组19个细胞，来自3个独立的培养物（b）突触核蛋白影响细胞外事件的上升时间。对于每个细胞外事件，确定达到90%最大荧光的时间。插图显示了每组单个代表性单元格的平均上升时间（wt，n=46个事件；SYN，n=34个事件；TKO，n=30个事件）。直方图表示50 ms bin中上升时间的事件频率（Kolmogorov-Smirnov检验p<0.0001）。wt，n=473个事件；SYN，n=256个事件；TKO，n=518个事件（c）细胞外事件分为四类（左图）。在完全衰减时，荧光立即衰减到基线。在高原衰退期，荧光衰减在可变潜伏期后开始。在衰变闭合状态下，荧光衰变无潜伏期，但衰变停止后才恢复到基线。高原衰变闭合包括衰变前的潜伏期和不完全衰变。图（右上角）说明了我们对痕迹的解释。所有三组之间的事件类型比例存在差异（以成对的Chi-square和所有三组的比较，p<0.0001）。（d）突触核蛋白影响BDNF的释放速率。对于所有全衰减事件，荧光衰减（τ衰减）的时间常数通过拟合一个指数来确定。直方图表示具有不同τ衰减的事件分布（通过Kolmogorov-Smirnov检验，WT与SYN以及TKO与SYM的p<0.0001；WT与TKO的p<0001）。wt，n=266个事件；SYN，n=167个事件；TKO，n=237个事件（e）对于所有具有非零衰减潜伏期的事件，确定从达到90%最大荧光到开始衰减的时间（wt，n=134个事件；SYN，n=66个事件；TKO，n=218个事件）。***，经Kruskal-Wallis单因素方差分析和Dunn事后检验，p<0.0001；H=55.22（d）和39.45（e）
图2
图2。VMAT2氟的分析揭示了α-突触核蛋白对融合孔的影响
（a）用编码VMAT2-pHfluorin的慢病毒和人类α-突触核蛋白或空载体转导野生型嗜铬细胞，3-5天后用45 mM K+在H存在的情况下+泵抑制剂巴非霉素抑制囊泡再酸化。两次细胞外事件的波形图显示了荧光时间过程和扩散的观察变化。用45 mM K去极化后+.Bar表示0.5秒。（b）α-Synuclein过度表达可减少VMAT2-pHfluorin细胞外排事件的数量（通过非配对双尾t检验，p=0.0154；t（32）=2.560）。con，n=16个细胞；SYN，n=来自3个独立培养物的18个细胞（c）突触核蛋白过度表达也降低了荧光衰减的潜伏期（Mann-Whitney的p=0.0347；U=42.00）。con，n=153个事件；SYN，n=128个事件（d）显示VMAT2-pHfluorin事件在pH 5.5下猝灭（左）和未猝灭（右）的代表性痕迹。（e）在45 mM K中去极化30 s后+，嗜铬细胞在pH 5.5下受到攻击。α-突触核蛋白的过度表达降低了在低pH值下免受猝灭的事件比例（通过非配对t检验，p=0.005；t（30）=3.863）。con，n=222个来自15个细胞的事件；SYN，n=来自17个细胞的133个事件（f）荧光衰减的时间常数随着α-突触核蛋白的过度表达而缩短（Mann-Whitney的p=0.0012；U=44.00）。con，n=348个事件；SYN，n=267个事件。*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001
图3
图3。α-突触核蛋白影响神经元融合孔闭合
（a）用BDNF-pHfluorin转染啮齿动物海马神经元，14-20天后成像，在50 Hz下刺激5 s，然后在pH 5.5下立即熄灭细胞表面荧光。箭头表示可在低pH值下淬火的事件，箭头表示耐淬火的事件。比例尺，5μm。（b）样品BDNF-pH氟痕迹表明，在虚线（左侧）和耐淬性（右侧）之间施加pH 5.5时，对淬灭敏感。（c）与α-突触核蛋白（SYN）或空载体（con）共转染并如（a）（上文）所述进行刺激的表达BDNF-pHfluorin的大鼠海马神经元的每份盖玻片的平均事件频率（平均值±SEM）（通过非配对双尾t检验，p=0.13；t（16）=1.582）。n=来自2个独立培养物的9个细胞（d）将事件归类为酸暴露时已经腐烂的事件，如果不是，则归类为未被低pH值抑制或猝灭的事件，α-突触核蛋白过度表达会降低未被抑制事件的比例（Chi-square检验p<0.0001）（左面板）。n=281个事件（con），158个事件（α-syn）。突触核蛋白过度表达也增加了每个盖玻片中可淬灭事件的比例，与那些已经衰变的事件无关（右面板）。*，未配对t检验p<0.05（t（15）=2.145）（e）将转染BDNF-pHfluorin的小鼠神经元在50 Hz下刺激5 s，并在pH 7.8和6.4下用快速振荡（1.33 Hz）的Tyrode溶液过度灌注。顶部轨迹显示具有振荡的胞外分泌事件，该振荡持续到荧光衰减，表明融合孔保持开放直到肽释放。中间的轨迹显示了一个没有完全衰减但始终振荡的事件，这表明熔合孔没有闭合。底部轨迹显示在肽释放之前振荡停止的事件（箭头），表明孔隙关闭。（f）TKO神经元中wt和synuclein的事件类型比例不同（按Chi-square计算p=0.01）。n=7（wt）和9（TKO）盖玻片中的100起事件（g）在孔隙闭合事件中，wt和同核TKO神经元在孔隙闭合时间上的累积频率分布没有显著差异（Kolmogorov-Smirnov的p=0.63）。插图显示平均值±SEM（不另作说明，不显著）。n=wt的44个事件和TKO的63个事件
图4
图4。过表达和内源性突触核蛋白对肽释放的影响相似
（a）培养的啮齿动物神经元中NPY-pHfluorin的样品荧光痕迹以50 Hz刺激5 s。个别痕迹适合于单指数衰减的平台。未显示荧光衰减的事件（右）被评为无衰减。（b，d）衰减潜伏期与非参数“无衰减”数据相结合，绘制累积频率分布图。（b）与转染空载体（con）的对照组相比，大鼠神经元中α-突触核蛋白（SYN）的过度表达显著降低了衰变潜伏期（Kolmogorov-Smirnov的p<0.0001）。对照组，n=652起事件/5张盖玻片；α-syn，n=586个事件/8个盖玻片/2个培养物（d）与wt对照组相比，同核蛋白TKO小鼠神经元中NPY-pHfluorin事件的衰减延迟增加（p<0.0001）。wt，n=928个事件/10个盖玻片；TKO，n=769个事件/11个盖玻片/3个培养物（c、e）荧光衰减时间常数的累积频率直方图（τ衰退)由NPY-pHfluorin引起，包括没有衰变的事件。（c）大鼠神经元α-synuclein的过度表达降低了衰变潜伏期和τ衰退（Kolmogorov-Smirnov的p＜0.001）。（e）TKO小鼠神经元突触核蛋白缺失增加NPY-pHfluorinτ衰退相对于野生型动物的神经元（p<0.0001）。插入（英寸）（c）和（e）表示衰减潜伏期和τ的平均值±SEM衰退用于大鼠的腐烂事件（c）和鼠标（e）神经元。***，p<0.0001，由Mann-Whitney提供；U=130046（延迟）和149764（τ）in（c）；U=221111（延迟）和227995（τ）in（e）
图5
图5。肾上腺嗜铬细胞分泌颗粒中过表达的内源性突触核蛋白
（a）用编码人α-突触核蛋白（SYN）或空载体的慢病毒转导wt或突触核蛋白TKO小鼠的嗜铬细胞，培养72小时，对α-突触核蛋白（H3C，绿色）和致密核心囊泡蛋白分泌蛋白II（SgII，红色）进行免疫染色这些图像是使用结构照明获得的，此处显示的是位于细胞-罩玻璃界面0.5μm内的120 nm厚切片的重建。尺寸棒，2.5μm。（b）利用Pearson相关系数（R）和Manders重叠系数（M1）量化SgII与突触核蛋白的共定位程度。wt-synuclein与线粒体蛋白TOM20共定位的程度以绿色显示。n=wt为7个细胞，SYN为5个细胞，TKO为6个细胞，TOM20为3个细胞（c）对位于细胞内部0.5–1.0μm深处的切片的类似共定位测量表明，突触核蛋白在分泌囊泡中的定位并不局限于停靠池；n=3个单元。中的值b条和c表示平均值±SEM
图6
图6。融合孔扩张是突触核蛋白的一种保守功能，被PD-相关点突变破坏
用编码BDNF-pHfluorin的慢病毒和突变的人类α-突触核蛋白（A30P，A53T）、人类β-突触核蛋白（β-syn）、人类γ-突触细胞核蛋白（γ-syn。（a）与对照组相比，突变α-、β-或γ-突触核蛋白的过度表达均导致45 mM K去极化50 s以上诱发的细胞外事件数量减少+（**，通过Tukey事后检验的单向方差分析，p=0.0046；F（4,60）=4.027）。con，n=17个细胞；A30P，n=14个细胞；A53T，n=10个电池；β-syn，n=11个细胞；γ-syn，n=13个来自3种独立培养物的细胞（b）β-和γ-突触核蛋白都能加速单个BDNF-pH氟释放事件的动力学。然而，这两个PD相关突变体并不影响释放动力学。累积频率分布包括衰减至基线的所有BDNF-pH氟化物事件的衰减常数。β-或γ-但非突变α-突触核蛋白的表达，将衰变常数相对于对照组的值变短（con对β-syn和con对γ-syn的Kolgomorov-Smirnov检验p<0.0001）。插图显示了衰变常数的10–90百分位箱形和须状图（平均值表示为“+”）。***，经Kruskal-Wallis单因素方差分析和Dunn事后检验（H=76.76），p<0.0001，con与β-syn和con与γ-syn；n=对照组610例，A30P组296例，A53T组172例，β-synuclein组210例，γ-synuclean组265例（c、d）对感染空载体或编码A30P或A53T人α-突触核蛋白慢病毒的野生型小鼠的嗜铬细胞进行α-突触核蛋白（H3C，绿色）和SgII（红色）免疫染色，并通过TIRF显微镜观察（c）.尺寸棒，2.5μm。（d）使用Manders系数评估SgII与突触核蛋白的共定位程度。n.s.，不显著（单向方差分析p=0.6147；F（4,21）=0.6781）；n=3个电池用于TKO，7个用于控制，5个用于A30P，6个用于A53T，4个用于TKO-A30P，4个用来TKO-A53T（e）用syn-1抗体（左）和人α-、β-和γ-突触核蛋白（右）免疫荧光检测野生型和突变型人α-突触核苷的表达。n=6个对照细胞，8个A30P细胞，7个A53T细胞使用syn-1抗体，7个对照细胞、7个β-synuclein细胞和7个γ-synuclean细胞使用pan-synucelin抗体
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    1. Polymeropoulos MH等。帕金森氏病家族中发现的α-同核蛋白基因突变。科学。1997;276:2045–2047.-公共医学
    1. Kruger R等人。帕金森病中编码α-同核蛋白基因的Ala30Pro突变。《Nat Gen.1998》；18:106–108。-公共医学
    1. Zarranz JJ等人。α-同核蛋白的新突变E46K导致帕金森和路易体痴呆。Ann Neurol公司。2004;55:164–173.-公共医学
    1. Appel-Cresswell S等，α-同核蛋白p.H50Q，帕金森病的一种新的致病性突变。移动Dis。2013年；28:811–813.-公共医学