Protective role of phosphorylation in turnover of glial fibrillary acidic protein in mice

doi:10.1523/JNEUROSCI.22-16-06972.2002

。2002年8月15日；22(16):6972-9.

doi:10.1523/JNEUROSCI.22-16-06972.2002。

磷酸化对小鼠胶质纤维酸性蛋白周转的保护作用

竹村正木¹, Hiroshi Gomi公司, 艾玛·科鲁奇·古永, Shigeyoshi Itohara公司

附属公司

PMID： 12177195
预防性维修识别码：项目经理6757867
内政部： 10.1523/JNEUROSCI.22-16-06972.2002

磷酸化对小鼠胶质纤维酸性蛋白周转的保护作用

竹村正木等。神经科学。 2002。

。2002年8月15日；22(16):6972-9.

doi:10.1523/JNEUROSCI.22-16-06972.2002。

作者

竹村正木¹, Hiroshi Gomi公司, 艾玛·科鲁奇·古永, Shigeyoshi Itohara公司

附属

¹行为遗传学实验室，RIKEN脑科学研究所，Wako 351-0198，日本。

PMID： 12177195
预防性维修识别码：项目经理6757867
内政部： 10.1523/JNEUROSCI.22-16-06972.2002

摘要

胶质纤维酸性蛋白（GFAP）是中枢神经系统中成熟星形胶质细胞的主要中间丝蛋白，在星形胶质细胞功能中发挥特殊作用。GFAP在其N末端头部结构域有多个磷酸化位点。为了检测这些位点的磷酸化作用，我们制作了一系列替换突变小鼠，其中磷酸化位点（Ser/Thr）以不同组合被Ala取代。在所有五个磷酸化位点携带替代物的Gfap（hm3/hm3）小鼠的纤维丝形成和Gfap数量均显著减少。Gfap（hm1/hm1）和Gfap鼠（hm2/hm2）在五个位点中的三个位点以不同组合携带替换，表现出不同的表型。虽然Gfap（hm3/hm3）小鼠在小脑的Bergmann胶质细胞中保留了Gfap丝状物，但（Gfap，hm3/hm3:Vim（-/-））小鼠缺少Gfap丝样物。培养星形胶质细胞的脉冲期实验表明，GFAP（Hm3）编码的Hm3-GFAP不稳定，尤其是在缺乏波形蛋白（另一种IF蛋白）的情况下。这些结果揭示了磷酸化在GFAP周转中的作用，以及GFAP和波形蛋白在神经胶质丝动力学中的协同作用。数据进一步表明，每个磷酸化位点对GFAP的动力学都有不同的影响。

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数字

**图1。**
的生成*Gfap公司*替代突变小鼠。一个，显示GFAP磷酸化位点和GFAP突变形式的方案。对人、小鼠和嵌合GFAP（Hwt-GFAP）的N端氨基酸序列进行了比对。GFAP磷酸化位点和替代突变的组合如下所示。仅指明了替代位点。星号指出已识别的磷酸化位点。B类，将人头域序列敲入小鼠的策略*Gfap公司*轨迹。*打开箱子*表示外显子1-9。这个*灰色线条*外显子1代表人类磷酸化位点突变序列。*实心三角形*表示*液氧磷*地点。这个*pgk-neo公司*盒式磁带(新)被Cre删除-*液氧磷*系统产生*Gfap公司*^嗯x等位基因。嗯x代表公顷，公顷，或*hm3年*，阿帕一、。C类，来自成年野生型的总脑RNA的Northern印迹分析(重量),*Gfap公司^hm1/hm1*(公顷),*Gfap公司^hm2/hm2*(公顷),*Gfap公司^hm3/hm3*(公顷),*维姆^−/−*(v−)、和*Gfap公司^hm3/hm3：维姆^−/−*(*hm3:v−*)使用0.8kb小鼠片段的小鼠大脑*Gfap公司*cDNA作为探针与β-肌动蛋白mRNA进行比较。

**图2。**
突变小鼠脑中GFAP和S100B的免疫组织化学检测。成年动物脑海马和小脑切片用抗GFAP或抗S100B抗体染色。一个，B类，D类，E类，*G公司*，*H（H）*，J型、和*K（K）*用稀释苏木精复染。请注意，GFAP免疫反应在海马体中显著降低，但在小脑中没有降低*Gfap公司*^hm3/hm3老鼠。箭头显示血管周围的GFAP信号。所有基因型的海马中S100B免疫反应均未改变(C类，F类，我，*L（左）*)。第页，金字塔细胞层；克颗粒细胞层；毫升，分子层。比例尺，200μm。

**图3。**
小鼠大脑中波形蛋白依赖性Hm3-GFAP丝的形成。用抗GFAP、抗波形蛋白或抗S100B抗体对来自指定基因型的成年动物大脑的海马和小脑切片进行染色。*B–D类*，*F–H（飞行高度）*，*J–L型*、和*N–P型*用稀释苏木精复染。请注意，如果没有波形蛋白，Hm3-GFAP不会在小脑皮层形成丝状物。第页，金字塔细胞层；克颗粒细胞层；毫升，分子层。比例尺：一个，B类，E类，F类，我，J型，*M（M）*，N个，200微米；C类，D类，*G公司*，*H（H）*，*K（K）*，*L（左）*，*O（运行）*，*P（P）*，100微米。

**图4。**
突变对大脑中GFAP数量的影响。一个、使用成人野生型全脑总蛋白用抗GFAP或肌动蛋白抗体进行免疫印迹(重量),*Gfap公司*^hm1/hm1(公顷),*Gfap公司^hm2/hm2*(公顷),*Gfap公司^hm3/hm3*(公顷),*维姆^−/−*(v−)、和*Gfap公司^hm3/hm3：维姆^−/−*(*hm3:v−*)老鼠。B类，突变小鼠大脑中GFAP的数量。用肌动蛋白作为内标物，通过密度分析定量GFAP。*正常开放*和*实心钢筋*分别代表GFAP的总量，包括较低分子量的产物和仅完整产物的总量。所示为平均值±SEM（野生型，n个=9；其他基因型，n个= 3). *第页< 0.05; **第页< 0.001;*NS公司*，不显著；与野生型相比t吨测试。）

**图5。**
波形蛋白缺乏星形胶质细胞中Hm3-GFAP异常聚集形成。原代培养的星形胶质细胞由野生型制备(一个),*Gfap公司*^hm3/hm3(B类),*维姆^−/−*(C类)、和*Gfap公司^hm3/hm3：维姆^−/−*(D类)胚胎。用抗GFAP抗体对胶质纤维进行免疫染色。在缺乏波形蛋白的情况下，丝状结构稀疏且排列不规则(星号在里面C类和D类). 在*Gfap公司^hm3/hm3：维姆^−/−*星形胶质细胞(箭头在里面D类). 比例尺，50μm。

**图6。**
GFAP的脉冲相位实验。从野生型制备的原代培养星形胶质细胞(一个，F类),*Gfap公司*^{硬件/硬件}(B类，*G公司*),*Gfap公司^hm3/hm3*(C类，*H（H）*),*维姆^−/−*(D类，我)、和*Gfap公司^hm3/hm3：维姆^−/−*(E类，J型)胚胎标记15分钟³⁵S-Met/Cys，然后立即采集或追踪1、24或48小时。Triton X-100不溶性细胞骨架部分和Triton X-100-可溶性细胞溶质部分与抗GFAP抗体的免疫沉淀物的放射自显影见*A–E*和*F–J。K（K）*，GFAP抗体检测到的低分子量产物(星号)未使用头部区域特异性抗体检测到。免疫沉淀物来自*Gfap公司^hm3/hm3*用放射自显影术分析星形胶质细胞(*车道1*)，带有GFAP头部结构域抗体的免疫印迹(*车道2*)或用GF 12.24作为pan-GFAP抗体进行免疫印迹(*车道3*)。

**图7。**
在缺乏波形蛋白的情况下，Hm3-GFAP的快速周转。使用原代培养的对照星形胶质细胞进行脉冲相实验的数据(钻石;n个= 10),*Gfap公司*^hm3/hm3(*正方形*;n个= 6),*维姆^−/−*(*三角形*;n个=6），或*Gfap公司^hm3/hm3：维姆^−/−*(圈子;n个=6）绘制基因型。细胞骨架组分中GFAP的相对放射性(*开放式符号*)和胞质部分(*填充符号*)当面(左边)或缺席(*正确的*)波形蛋白的一个。通过免疫印迹法估计的放射性GFAP与总GFAP的比率在*维姆^−/−*和*Gfap公司^hm3/hm3：维姆^−/−*在细胞溶质中(B类，左边)和细胞骨架(B类，*正确的*)分数。误差条代表SEM。*NS公司*，不显著*第页< 0.02; **第页< 0.0001; 重复测量方差分析

**图8。**
GFAP磷酸化作用的拟议模型。GFAP磷酸化可能发挥双重作用。磷酸化保护GFAP免受蛋白水解，并有助于将可溶性纤维平衡向左移动。受磷酸化保护的更大的可溶性亚基库和由磷酸化触发的丝状亚基的部分解聚将协同加速胶质丝的结构可塑性。

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1. Eliasson C、Sahlgren C、Berthold CH、Stageberg J、Celis JE、Betsholtz C、Eriksson JE、Pekny M.星形胶质细胞中的中间丝蛋白伙伴关系。生物化学杂志。1999;274:23996–24006.-公共医学
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