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干细胞报告。2021年1月12日；16(1): 106–119.
2020年12月30日在线发布。 数字对象标识：2016年10月10日/j.stemcr.202012.002
预防性维修识别码：项目管理委员会7897584
PMID：33382976

维持多功能乳腺干细胞需要AP-2γ

薇薇安·W·顾,1,2,7 爱德华·赵,1,7 达科塔·T·汤普森,1 维多利亚·C·卡萨迪,1 尼古拉斯·博尔切丁,3 凯尔西·E·科赫,1 文森特·T·吴,1 艾利森·洛伦岑（Allison W.Lorenzen）,1 达纳·M·范德海德,1 杰弗里·怀特,1 米哈伊尔·库拉克,1 威廉姆斯,5 张伟洲,6中，∗和罗纳德·魏格尔1,2,4,∗∗
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总结

乳腺导管的形态发生依赖于乳腺干细胞分化为基底和管腔谱系。AP-2γ转录因子，由Tfap2c型在乳腺发育中起着核心作用，但其在乳腺谱系中的作用，特别是在MaSC中的作用尚不清楚。在这里，我们使用了一种诱导的、有条件的淘汰Tfap2c型阐明AP-2γ在骨髓基质干细胞维持和分化中的作用。基底上皮中AP-2γ的缺失严重改变了转录组，并减少了几个乳腺上皮细胞簇中的细胞数量，包括成年MaSC和管腔祖细胞。AP-2γ调节乳腺发育所需基因的表达，包括增强子结合蛋白,Nfkbia公司、和Rspo1号机组因此，AP-2γ缺陷小鼠表现出乳腺导管生长受到抑制和再生能力受到抑制。研究结果表明，AP-2γ可以调节乳腺结构的发育，潜在地调节多能干细胞的维持和分化。

关键词：乳腺，发育，Tfap2c，AP-2γ

亮点

  • •
    AP-2γ缺陷小鼠表现出抑制的导管生长和再生能力
  • •
    乳腺干细胞和管腔祖细胞簇内AP-2γ减少细胞的丢失
  • •
    AP-2γ靶基因，包括增强子结合蛋白,Nfkbia公司、和Rspo1号机组，调节乳房发育
  • •
    AP-2γ可能调节多能干细胞的维持

顾和他的同事使用了一种有条件的淘汰Tfap2c型检测AP-2γ对乳腺发育的转录作用。AP-2γ缺陷小鼠体内含有乳腺干细胞的细胞数量减少，并改变了乳腺发育所需基因的表达，包括增强子结合蛋白,Nfkbia公司、和Rspo1号机组他们证明AP-2γ与多能干细胞的维持有关。

介绍

小鼠乳腺的导管系统是在产后3周内从乳头延伸出的一条残留导管在出生后发育而成的(鲍尔，1998年;Silberstein，2001年). 小鼠在4-5周龄开始进入青春期前，乳腺对生殖激素产生反应，生殖激素启动生长期，末端芽（TEB）结构驱动导管形态发生。TEB是生长导管尖端的棒状结构，由两种细胞类型组成：一种是产生管腔乳腺上皮细胞的体细胞内层，另一种是发育成肌上皮层的未分化帽细胞单层(莫里斯和斯坦，2017年;威廉姆斯和丹尼尔，1983年). 到9周大时，TEB侵入基质会产生一棵乳腺树，填充乳腺脂肪垫，形成成熟处女动物特有的乳腺。

成人组织干细胞的典型特征是未分化的多能干细胞，能够通过细胞分裂再生器官或组织的结构(波斯特和克利夫斯，2019年). 乳腺干细胞（MaSCs）的存在首先通过显示成年乳腺组织在移植到3周龄同基因小鼠的清除脂肪垫中时可以繁殖乳腺来证明(Deome等人。，1959). 在移植试验中，由乳腺再生单位（MRU）定义的MaSC的频率估计约为基底细胞（BCs）的2%(Fu等人。，2019;Shackleton等人。，2006;Stingl等人。，2006). 小鼠MaSC群体具有Lin的表达谱−CD24型+CD29型高的CD49f细胞高的表达细胞角蛋白5和14（由Krt5（Krt5）和Krt14号机组基因）。与多能干细胞存在于基底层的假设相一致，BC-衍生类有机物能够形成由内部立方腔细胞组成的结构，这些细胞能够产奶，周围环绕着形态细长的肌上皮层，而腔细胞衍生类有机质缺乏肌上皮层(Jamieson等人。，2017).

乳腺发育程序的特点是由几个转录因子协调的转录组的变化(Pal等人。，2017;Wuidart等人。，2018). AP-2转录因子家族是神经嵴衍生物、表皮和泌尿生殖组织正常胚胎发生和胚胎发育所必需的(Hilger-Eversheim等人。，2000;Winger等人。，2006). AP-2因子在调节乳腺发育中也起着重要作用。在7周龄的小鼠乳腺中，AP-2α和AP-2γ在基底和管腔乳腺上皮细胞的细胞核中表达，而这两个因子在TEB的体细胞和帽细胞中表达(Jager等人。，2010;Zhang等人。，2003). 研究已经检测了使用MMTV启动子的转基因驱动的AP-2α过度表达的影响(Zhang等人。，2003). 乳腺发育的初始阶段是正常的，成熟的处女8周龄小鼠表达转基因，显示出正常的乳腺树结构；然而，在6个月龄时，表达转基因的小鼠表现出较稀疏的导管网络，肺泡芽减少。在怀孕期间，表达转基因的小鼠小叶肺泡组织的增殖减少，凋亡增加。在过度表达AP-2γ的小鼠中进行的平行研究表明，Ki-67表达增加、溴脱氧尿苷掺入增加以及细胞凋亡增加导致了过度增殖，总体效果导致妊娠期间肺泡上皮发育不良(Jager等人。，2003).

的基因敲除（KO）Tfap2c型胚胎外膜AP-2γ表达缺失导致早期胚胎死亡(Auman等人。，2002). 的条件淘汰（CKO）Tfap2c型使用Sox2系统促进者驱动Cre公司重组酶显示AP-2γ的缺失在青春期前损害了乳腺的分支(Jager等人。，2010). AP-2γ的缺失导致分支点数量和最大导管长度的减少，但不影响TEBs的产生。到8个月时，处女的乳腺导管已经完全填满了脂肪垫Tfap2c型CKO小鼠；然而，分枝程度降低，表明AP-2γ控制着导管伸长的速度以及第三级分枝和侧芽的发育。在另一项研究中Tfap2c型使用MMTV启动程序驱动Cre公司导致仅管腔上皮细胞中AP-2γ表达缺失(Cyr等人。，2015). 年乳腺分支延迟Tfap2c型与管腔细胞相比，CKO小鼠的分支点减少，BCs的相对比例增加。

以前的实验模型对AP-2γ在基础和MaSC人群中的作用得出结论的能力有限，并且无法确定乳腺发育所必需的AP-2γ靶基因。为了进一步了解AP-2γ在乳腺发育中的作用，我们使用了一种转基因，该转基因使用了Krt5（Krt5）启动子驱动他莫昔芬诱导物的表达Cre-ER公司，允许控制Tfap2c型KO并将AP-2γ的损失导向包括MaSC在内的BC人群。

结果

AP-2γ受损乳腺导管生长缺失

控制Tfap2c型在小鼠MaSC的KO中，我们利用表达三苯氧胺诱导的FVB小鼠Cre公司重组酶与雌激素受体融合并在牛角蛋白5启动子驱动下表达(Indra等人。，1999) (图1A） ●●●●。我们证实，CRE的定位仅限于基底层的细胞质，核定位是由暴露于4-羟基-三苯氧胺（4OHT）引起的(图1B） ●●●●。被鞭打的Tfap2c型等位基因被设计为删除第6外显子，该外显子干扰功能性AP-2γ蛋白的表达。自由现金流/Tfap2c型飞行/飞行/Krt5-Cre-ER公司T2段小鼠用玉米油（CO）或4OHT脉冲，其剂量先前显示不会干扰形态发生(Scheele等人。，2017). 从4周大的青春期早期开始，对基因完全相同的同窝雌鼠进行为期5天的治疗，并用免疫组织化学方法分析AP-2γ的表达，在6周、9周、12周和16周时用整只羊评估乳腺分支(图1C和1D）。在6周、9周和12周时，BCs中AP-2γ的表达显著降低，仅在6周时管腔细胞中的表达略有降低。16周后，AP-2γ表达差异消失。外显子6在Tfap2c型4OHT治疗1周内，在基底乳腺上皮细胞（MMEC）中检测到mRNA，但在管腔细胞中未检测到(图S1A） ●●●●。CKO显示乳腺导管延长延迟Tfap2c型第6、9和12周。然而，与4OHT和CO处理的小鼠相比，在16周时未发现乳腺导管结构的显著差异。在FVB中进行了一组并行实验/Krt5-Cre-ER公司T2段小鼠证明使用相同方案的三苯氧胺治疗对乳腺导管形态发生没有影响(图S1B和S1C）。研究结果表明，CKOTfap2c型要么是镶嵌的，要么是未能针对前体细胞群体，因此野生型细胞可以战胜突变细胞，最终导致导管外生长的恢复。总之，研究结果表明AP-2γ在乳腺导管伸长中起着关键作用。

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AP-2γ缺失抑制乳腺导管生长

（A）Krt5（Krt5）启动子用于驱动Cre公司重组酶通过Lox位点消除AP-2γ的表达，Lox位点设计用于去除Tfap2c型基因。

（B） 自由现金流/Tfap2c型飞行/飞行/Krt5-Cre-ER公司T2段用玉米油（CO）或4-羟基-三苯氧胺（4OHT）和Cre公司免疫组化检测其表达；4OHT诱导的核CRE表达治疗。

（C） 示意图显示了从4周龄开始用CO或4OHT治疗小鼠5天；在6周、9周、12周和16周时进行分析。

（D） 蛋白质表达和总量分析。免疫组织化学（左侧）用于检测CKO为Tfap2c型KRT5和KRT8的表达分别显示基底和管腔MMEC。在6周、9周和12周时，（BC）室中的AP-2γ表达显著降低。在6周时，发现肠壁细胞的AP-2γ表达显著降低，但在9周和12周时，这种降低并未持续。每只动物至少量化三个具有代表性的显微镜视野（40倍放大）。通过比较染色细胞和总上皮细胞来计算百分比。结果表示为平均值±SEM;CO/4OHT的数量：n=5/5（6周），n=4/5（9周），n=4/4（12周），n-4/5（16周）。∗p<0.05，∗∗p<0.01；n.s.，不重要；Mann-Whitney U检验的统计显著性。6周、9周、12周和16周龄小鼠的代表性完整乳腺（右侧）；黑色箭头表示测量的距离。相应的图表显示了从淋巴结到最远处乳腺分支测量的乳腺树的生长情况，表明CKO使乳腺树的增长显著减少Tfap2c型，在16周内解决。结果表示为平均值±SEM；CO/4OHT小鼠数量：n=4/5（6周），n=5/5（9周），n=8/9（12周），n=14/14（16周）；∗p<0.05，**p<0.01；n.s.，不重要；Mann-Whitney U检验的统计显著性。

的CKOTfap2c型改变MMEC聚类和基因表达模式

单细胞RNA测序（scRNA-seq）用于检测AP-2γ缺失的MMEC转录组的变化。四周FVB/Tfap2c型飞行/飞行/Krt5-Cre-ER公司T2段用4OHT或CO对小鼠进行类似的脉冲处理，并在9周龄时采集乳腺(图S1D） 。生成单个细胞并对其进行流分类，以丰富内腔和基底乳腺上皮细胞群，这些细胞按1:1组合，并用scRNA-seq进行分析(图2). 值得注意的是，与CO和4OHT处理的FVB相比，我们没有发现基底细胞和管腔细胞总数的统计显著性差异/Tfap2c型飞行/飞行/Krt5 Cre急诊室T2段动物。使用统一流形近似和投影（UMAP）分析了来自CO处理动物的7866个MMEC和来自4OHT处理动物的10350个MMEC组合群体的RNA-seq数据，其中确定了13个不同的MMEC簇，称为簇0-12(图2A） ●●●●。表达模式用于识别主要MMEC组，即管腔成熟细胞、管腔前体细胞（LPC）、BCs和蛋白C受体（PROCR）+)干细胞（PSC）(Wang等人。，2015;Sun等人。，2018) (图2B和S2系列A） ●●●●。PSC簇的基因表达模式与Procr公司+报告的多能干细胞数量Wang等人。(2015)(图S2B） ●●●●。的CKOTfap2c型显著降低了分别属于基底和管腔簇的簇4和簇8内细胞的相对比例(图2C–2E）。在其他几个集群中，包括集群10（BC集群）和集群12（PSC集群），降幅较小。此外，属于PSC亚组的第11簇细胞的相对比例显著增加(图2D和2E）。这个Tfap2c型该基因在基底隔室中表达最高Tfap2c型-在簇2中表达细胞(图2F） ●●●●。LPC簇0、7、8和9中分散的细胞也被证明具有相对较高的Tfap2c型表达式。尽管CKO消除了基底层AP-2γ蛋白的表达(图1)，与预期一样，第6外显子缺失的mRNA表达(图2F） ●●●●。

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scRNA-Seq分析

（A） 实验在两个独立的重复中进行，在每个实验中，两个CO和两个4OHT处理的小鼠用于乳腺收获，每个条件下总共有4只小鼠。UMAP聚类分析鉴定出13个乳腺细胞簇；转录组定义了密切相关的簇，包括BC、管腔前体簇（LPC）、成熟管腔簇（LMC）和Procr公司+干细胞簇（PSC）。

（B） 用于分类乳腺细胞簇主要组的基因表达示例。

（C） 分别显示CO处理（橙色）和4OHT处理（青色）动物的UMAP簇。

（D） CO和4OHT处理的动物每簇中乳腺细胞的相对比例，其中0.50表示细胞的相对数量没有变化；∗p<0.05。

（E） CO和4OHT处理小鼠的细胞频率由集群中细胞的相对数量显示。

（F） 的表达式模式Tfap2c型CO和4OHT处理的小鼠。

对数据进行分析，以确定AP-2γ缺失时表达发生显著变化的基因，然后对该基因列表进行Ingenuity Pathway Analysis（IPA）分析。IPA表明许多因AP-2γ缺失而改变的基因参与了细胞周期、迁移和分化(表S1). 共有644个基因在CKO的表达中表现出显著变化Tfap2c型(表S2). 使用基于±0.5的对数变化和p<0.05的显著性的差异，与CKO诱导的基因相比，受抑制的基因数量更多Tfap2c型(图3A） ●●●●。当局限于绝对百分比差异为集群中5%细胞的基因时，有30个基因被抑制，4个基因被AP-2γ缺失诱导(图3B和第3章). 当按聚类分析时，除聚类11外，每个聚类中都发现了基因表达的变化(图3C和S4系列). 当考虑在四个或更多簇中表现出显著变化的基因时，Cdk2ap1型,增强子结合蛋白,通信1,Hspa1a型,Krt15,Lgals7号机组,普林2,血小板8、和Sp140型被压抑和安克萨3,加德45b、，Krt18（Krt18）,Nfkbia公司,Odc1号机组、和Tm4sf1型由CKO诱导Tfap2c型(表S2). 对于所有这些基因，表达的变化总是包括基础簇（1、2、3、4、5和10），而对于L加仑7和Krt15，表达的变化仅限于基底簇。对5周龄时分离的大腔和基底MMEC的选定基因的表达分析证实了AP-2γ的调节作用(图S5).

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CKO引起的基因表达变化Tfap2c型

（A） 垂直轴显示−log的火山图10所有MMEC中AP-2γ缺失基因的p值和水平轴平均对数倍变化；彩色点代表p<0.05和平均对数变化>±0.5的基因；蓝色用于抑制基因，红色用于KO诱导的基因Tfap2c型。

（B） 如（A）所示的相同数据绘制了平均对数倍变化与显示基因表达的细胞百分比差异。标记的基因具有调整后的p值<0.05和±5%的差异。

（C） 第4、8、10和11簇基因表达变化的火山图如（A）所示。

的CKOTfap2c型MaSCs的抑制多能性

以前的研究(Fu等人。，2019;维斯瓦德和斯廷格尔，2014年)已经通过标记Lin的表达定义了MaSC−韩元5+，CD49高的，CD29高的和CD24+LGR5已被报道为另一个潜在的MaSC标记，但研究显示LGR5的重新填充活性并不一致+和LGR5−子集(维斯瓦德和斯廷格尔，2014年). 使用scRNA-seq对小鼠乳腺进行的检查没有发现代表MaSC的单个独特簇，这与以前的报告一致，即功能性MaSC状态可能由具有不同转录特征的细胞生成(Giraddi等人。，2018). 目前使用scRNA-seq对乳腺转录组的分析没有明确定义MaSC簇(图2和​和4）；4); 然而，根据MaSC标记的表达模式，簇4和簇10中的一小部分细胞可能代表MaSC群体。在基础簇中，簇10的G细胞百分比最高1/G公司0S期细胞百分比最低(图4A） ●●●●。的CKOTfap2c型减少了基底簇4和10内的细胞数量(图2D和2E），表达模式与具有MaSC表型的细胞群体一致；集群4和集群10中的细胞伊特加6/CD49f细胞+,Itgb1号机组/CD29型高,Cd24a公司/CD24型+、和Lgr5级低(图4B） ●●●●。具有MaSC标记表达的细胞随着KOTfap2c型AP-2γ缺乏对MaSC特征和乳腺导管生长的影响表明CKOTfap2c型可能降低MaSC的频率和/或功能。

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随着AP-2γ的丢失MaSCs的变化

（A） 细胞周期显示为G中细胞的比例1、S和G2/M通过CO和4OHT处理的小鼠的乳腺细胞簇。

（B） 的表达式模式伊特加6,Itgb1号机组,Cd24a公司、和Lgr5级来自CO和4OHT处理小鼠的基因。中间面板：放大框状区域的视图，聚焦于基底簇4和10；右侧面板：显示相对表达式的热图伊特加6,Itgb1号机组,Cd24a公司、和Lgr5级在CO和4OHT处理的小鼠的基础MMEC簇中。

为了检查从FVB中分离出来的MMEC和MaSCs功能特性的变化/Tfap2c型飞行/飞行/Krt5 Cre急诊室T2段用一氧化碳和4OHT处理的小鼠进行了乳房球形成能力的检测。与CO处理小鼠相比，从4OHT处理小鼠中分离出的MMEC表现出形成乳房球的能力显著降低，这是通过乳房球形成效率来衡量的(图5A和5B）。二次乳房球的形成被认为是评估MaSC活动自我更新的更可靠方法(Shaw等人。，2012). 从4OHT处理的动物和CO处理的动物中回收的初级乳房球生成次级乳房球；4OHT处理过的小鼠的初级乳房球显示其形成次级乳房球的能力降低(图5C） ●●●●。从CKO为Tfap2c型与对照组相比，它们也较小。为了避免4OHT的潜在混淆效应，FVB的基础MMEC/Tfap2c型飞行/飞行用表达绿色荧光蛋白（Ad-GFP）或GFP和Cre重组酶（Ad-Cre）的腺病毒载体转导小鼠，进行荧光激活细胞分选（FACS）以恢复GFP+用于形成乳房球的细胞；而Ad-GFP转导的细胞形成了乳房球，而Ad-Cre-Transfered细胞未能形成乳房球(图5D） 与KOTfap2c型导致乳腺球形成能力的丧失。

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AP-2γ缺失减少哺乳动物球和乳腺重建

从9周龄FVB收获的MMEC形成的哺乳动物球/Tfap2c型飞行/飞行/Krt5-Cre-ER公司T2段从4周开始用CO和4OHT治疗的小鼠。

（A） 培养14天后的原始乳房样本。

（B） 乳房球形成效率（MFE）和乳房球大小的数据；n=每种条件下重复12次4000个细胞的电镀；∗p<0.05；n.s.，不显著，学生t检验。

（C） 由（A和B）中所述的初级乳房球形成的次级乳房球，以及MFE和尺寸数据；n=每种条件下重复12次4000个细胞的电镀*p<0.05，∗∗p<0.01，学生t检验。

（D） GFP示例+Ad5CMVeGFP转导MMEC中的乳房球培养14天，MFE转导Ad5CMVeGFP和Ad5CMVCre-eGFP；**p<0.01，学生t检验。

（E） 顶部面板显示了CO处理动物再造乳腺分支的示例；数据表明，移植来自经CO处理但未经4OHT处理的小鼠的乳腺组织，发现乳腺树重建，7/13与0/13，p<0.01，Fisher精确检验；填充百分比结果图为平均值±SEM，∗p<0.05，Mann-Whitney U检验。

（F） 顶部面板显示了Ad-GFP转导细胞的再造乳腺分支示例；数据显示，经Ad-GFP转导但未经Ad-Cre转导的细胞重建乳腺树，4/7对0/8，p<0.05，Fisher精确检验；填充率结果图为平均值±SEM；∗p<0.05，Mann-Whitney U检验。

乳腺移植被用于进一步证明CKO对Tfap2c型功能性MaSC。从9周龄小鼠中分离出乳腺组织，这些小鼠从4周龄开始用CO或4OHT处理5天。从CO处理的动物中分离的乳腺组织在移植到3周大的同基因FVB小鼠的清除脂肪垫中时能够重建乳腺，而从4OHT处理的动物中收获的乳腺组织不能在清除脂肪垫中再生乳腺结构(图5E） ●●●●。为了进一步研究AP-2γ对乳腺再生能力的影响，从FVB中采集MMEC BCs/Tfap2c型飞行/飞行小鼠，并用Ad-Cre或Ad-GFP转导。用Ad-GFP转导的基底MMEC显示出再生乳腺树的能力；然而，用Ad-Cre转导的细胞未能证明其再生乳腺结构的能力(图5F） ●●●●。这些数据表明AP-2γ在维持多潜能、功能性MaSC中起着关键作用。

伪时间分析

scRNA-seq数据的伪时间分析用于在以下背景下生成乳腺发育模型Tfap2c型表达式(图6). 最早的MMEC前驱体由Procr代表+细胞簇（11和12）。Procr中的基因表达+细胞包括已知MaSC标记物的表达，包括Zeb2公司,Gng11号机组,等电位5、和加拿大存托凭证5，但具有低表达的基础谱系标记Krt5（Krt5）(图2)与早期研究一致，研究表明+细胞群是一个多能干细胞胚胎群(Wang等人。，2015). 我们的数据表明Krt5（Krt5）低的/Procr公司+胚胎MaSC在青春期持续存在于成人乳腺，但不受Tfap2c型CKO公司(图3C） ●●●●。从Procr开始的伪时间轨迹+集群11/12与集群4不同，并为包含KRT5的集群提供了额外证据+MaSC(图6). 从簇4开始，分化途径分化为管腔和基底谱系，终止于成熟管腔或成熟BC种群。使用p-Creode进行的无监督伪时间轨迹分析进一步支持了干细胞在PSC簇中的作用以及与簇4中细胞的密切发育关系(图S6).

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乳腺细胞发育的假时间和模型分析

（A） scRNA-seq的伪时间分析弹弓; 第一个面板显示伪时间覆盖tSNE图，与前面的图具有相同的聚类，其余面板显示从中推断出的每个个体谱系弹弓。

（B） CKO结果支持的乳腺发育模型Tfap2c型; 括号中的数字表示集群编号。

讨论

这项研究为AP-2γ在乳腺发育的青春期前阶段的作用提供了重要的见解。的CKOTfap2c型在KRT5内+BC室抑制乳腺导管的生长，抑制乳腺上皮细胞形成乳房球和再生乳腺结构的能力。在可以进行比较的地方，目前的研究结果与以前研究AP-2γ在小鼠乳腺中作用的报告一致(Cyr等人。，2015;Jager等人。，2010). 如前所述，免疫球蛋白5被鉴定为乳腺中的AP-2γ靶基因(Jager等人。，2003)我们注意到对免疫球蛋白5基底簇4和管腔簇7的表达(表S2). 目前的研究结果通过阐明AP-2γ在基底/MaSC室中的作用以及确定调节乳腺发育的AP-2γ靶基因，扩展了先前的报道。

关于多能KRT5的潜在作用，存在相当大的争议+乳腺基底室中的MaSC在青春期生长(Lee等人。，2019). 线性追踪实验使用Krt5-CreER公司/4周龄时用三苯氧胺治疗的Rosa-YFP小鼠表现出仅标记基底室(Van Keymeulen等人。，2011). 类似地，设计用于标记KRT14的谱系追踪实验+基底干细胞对青春期后小鼠单能性骨髓基质干细胞的支持作用(Wuidart等人。，2016). 其他研究提供了证据，证明乳腺胚胎的大部分生长来自胚胎第15.5天之后的受谱系限制的单能细胞(Lilja等人。，2018). 另一方面，移植实验表明CD29高的CD24型+BCs能够产生正常的乳腺结构。线性追踪实验报告人Rios等人。(2014)使用高分辨率3D成像，显示了导管树管腔和基底部的标记Krt5（Krt5）启动子，支持多能KRT5模型+MaSC在青春期乳腺发育期间产生成熟的基底细胞和管腔细胞。结果中的关键差异可能受到用于处理组织的技术以及使用3D与2D成像可视化标记细胞的影响(Rios等人。，2016).

发现某些管腔细胞转录组改变的一种可能性是Tfap2c型单位：KRT5+在AP-2γ蛋白丢失之前，MaSC产生管腔细胞；然而，一旦AP-2γ蛋白功能丧失Tfap2c型基因失去了它们的多能能力。先前对管腔型乳腺癌的研究表明TFAP2C型抑制管腔基因表达和诱导基础基因表达诱导上皮-间质转化(Bogachek等人。，2016;Cyr等人。，2015). 一种可能的假设是AP-2γ是多能MaSC产生管腔祖细胞所必需的，这可以解释乳腺发育和管腔乳腺癌模型中的发现(图6B） ●●●●。如果CKO为Tfap2c型在MaSC中，阻止其产生管腔前体细胞的能力，那么所有随后的管腔上皮细胞都必须来源于完整的MaSCTfap2c型这将解释为什么在以后的时间点没有检测到AP-2γ表达降低(图1). 或者，AP-2γ的缺失可能会降低基底细胞的生存能力，这可能是对乳腺增生形成和乳腺导管重建的影响。此外，组织分离和AP-2γ丢失可能会降低BCs的活性或增殖，这可能是实验结果的原因。基础簇4和10相对减少，但KRT5相对增加+基生簇1、2、3和5；因此，对BC活性的影响可能是集群4和集群10中细胞特有的，其中可能包括MaSC群体。关于AP-2γ的丢失是否会导致BC的增殖停滞、侵袭细胞外基质的能力降低、影响BC特性的基因表达的改变或基底细胞和激素反应性管腔细胞之间的信号缺陷，还有更多的问题。AP-2γ的缺失是否会影响MaSC的活性或改变其转录组从而导致功能或特性的改变，这是一个复杂的问题，尚不容易确定。

集群11，由PROCR组成+韩元5−细胞，是唯一一个CKO基因表达模式没有显著变化的簇Tfap2c型，表明集群11代表处于发育层次顶部的多能干细胞胚胎群体；我们还证实了PROCR中的表达模式+细胞簇与下面描述的特征曲线相匹配Wang等人。(2015)(图S2). 簇11中AP-2γ靶基因的表达缺乏变化与PROCR的假设一致+簇11中的细胞先于Krt5（Krt5）因此有一个完整的Tfap2c型基因。其他研究人员已确定PROCR+乳腺上皮细胞群，尽管他们没有得出结论，该人群代表MRU(巴赫等人。，2017). 伪时间分析表明，PROCR+细胞导致集群4，其中可能包括KRT5+MaSC(图6和S9). 数据表明，在4OHT脉冲后，PROCR+细胞产生KRT5+完整的MaSCTfap2c型该基因具有多潜能，可在16周内实现正常的乳腺形态发生。

一些已知的调节乳腺发育的基因被CKO改变Tfap2c型.小鼠缺乏增强子结合蛋白显示乳腺形态发生中断，导管生长减少，二次分支减少，妊娠期间分泌细胞丢失(Robinson等人。，1998;Seagroves等人。，1998). C/EBPβ缺陷小鼠也缺乏β-酪蛋白的表达，此外增强子结合蛋白在几个集群中受到压制通讯录2管腔簇0、7和8中编码β-酪蛋白的基因（CKO为Tfap2c型(表S2). IκBα由Nfkbia公司该基因是核因子κB（NF-κB）转录因子的主要抑制剂(Henkel等人。，1993). 将IκBα缺陷的哺乳动物上皮细胞移植到同基因动物体内后，导管外侧分支和导管内增生增加(Brantley等人。，2001). 的CKOTfap2c型增加的表达Nfkbia公司在几个基础簇中，这与AP-2γ的缺失通过抑制NF-κB抑制导管生长一致。损失Rspo1号机组表达导致妊娠期间乳腺无侧支和肺泡发育缺失(Chadi等人。，2009)和的CKOTfap2c型导致镇压Rspo1号机组在一些管腔上皮细胞簇中表达。综上所述，我们的研究结果表明，AP-2γ的缺失导致乳腺分支和正常肺泡发育受到抑制，至少部分是通过调节增强子结合蛋白,Nfkbia公司、和Rspo1号机组。

总之，AP-2γ在青春期前乳腺导管的生长中起着重要作用。我们假设AP-2γ的缺失减少了功能性MaSC的数量，并显著抑制了MaSC再生乳腺结构的能力。AP-2γ调节乳腺发育所必需的几个基因的表达，包括增强子结合蛋白,Nfkbia公司、和Rspo1号机组所述模型系统将进一步检查AP-2γ在乳腺发育和哺乳的其他阶段的影响。

实验程序

老鼠

所有动物研究均符合机构动物护理和使用委员会（IACUC）办公室制定的指南，并经IACUC批准进行。FVB/NJ和KRT5-Cre-ERT2段（FVB.Cg-Tg(Krt5-cre/ER公司T2段)2Ipc/JeldJ）小鼠购自Jackson实验室（库存编号001800和018394）。这个Tfap2c型飞行/飞行我小鼠菌株如前所述(Auman等人。，2002)在FVB/NJ背景下回交15代以上，以限制遗传变异。敲除小鼠是通过杂交产生的Tfap2c型飞行/飞行具有Krt5-Cre-ER公司T2段小鼠，后代与Tfap2c型飞行/飞行生成FVB/Tfap2c型飞行/飞行/Krt5-Cre-ER公司T2段。从4周龄开始，以30 mg/kg/天的剂量腹腔注射4OHT，持续5天。所有实验分析均在雌性小鼠中进行。基因型分析采用Transnetyx（Cordova，TN）对尾部DNA进行qPCR分析。

乳腺细胞制备、标记和流式细胞术

经一氧化碳（媒剂）治疗和4OHT治疗的8至9周龄处女胎仔雌性FVB的乳腺/Tfap2c型飞行/飞行/Krt5-Cre-ER公司T2段将小鼠在温和胶原酶/透明质酸酶（STEMCELL，目录号07919）与5%胎牛血清（FBS）的混合物中在完全EpiCult-B（STEMCELL，目录号05611）培养基中消化15  37°C时为h。红细胞在NH中溶解4Cl.细胞悬浮液在0.25%胰蛋白酶-EDTA中进一步消化1分钟，然后消化5分钟 U/mL偏差（STEMCELL，目录号07913）加0.1 mg/mL DNA酶I（STEMCELL，目录号07900）1分钟，然后通过40μm细胞滤网过滤。在Hank的平衡盐溶液中洗涤后，用台盼蓝评估细胞活力。如前所述执行单细胞隔离程序(Borcherding等人。，2015). FACS使用FACS Aria（Becton Dickinson）进行。林先生–人口被定义为TER119–，CD31−和CD45–使用FlowJo软件（v.10.1r7，Tree Star）分析FACS数据。使用了以下抗体：CD31-Biotin（BioLegend，102404，1:250）、TER-119-Boitin（bioLegeng，116204，1:250。

乳腺分支的整体分析

如前所述，收集乳腺，并在第4对乳腺上进行整体坐骑(Plante等人。，2011). 为了分析分支的形态发生，在灯箱上拍摄了全乳腺图像，并测量了从淋巴结到最远TEB的分支距离。在乳腺移植实验中，测量了分支区域。所有图像均通过ImageJ进行量化。

免疫组织化学

对来自第四乳腺的福尔马林固定、石蜡包埋的样本进行免疫组织化学分析。使用以下抗体进行分析：抗AP-2γ，1:100（圣克鲁斯生物技术公司，编号sc-12762）；抗CRE，1:50（细胞信号技术，编号15036）；抗CK5，1:100（Abcam，ab5235）；和抗CK8/18，1:500（Abcam，ab53280）。遵循标准方案，使用Vector ABC试剂盒进行扩增。在奥林巴斯BX-51显微镜上采集了亮场图像。

定量实时RNA分析

使用RNeasy Mini Kit（QIAGEN，目录号74104）从流式细胞术回收的基底细胞和管腔细胞中分离RNA。使用随机六聚体方法（Thermo Fisher Scientific），通过实时定量PCR将mRNA转化为cDNA。第2/3外显子的相对表达Tfap2c型（TFS，分类号4351372；ID:Mm00493470_g1），第6外显子Tfap2c型（TFS，目录号4351372；ID:Mm00493474_m1），增强子结合蛋白（TFS，Mm00843434_s1），L加仑7（TFS，Mm00456135_m1），Rspo1号机组（TFS，Mm00507077_m1），以及通讯录2（TFS，Mm04207885_m1）使用TaqMan引物和ΔΔC类吨qPCR方法，并使用CO和4OHT处理的小鼠进行比较。放大Gapdh公司（TFS，目录号4331182；ID:Mm99999915_g1）用作内源性对照。

用于测序的单细胞捕获和文库准备

按照与上述相同的流式细胞术方案，以1:1的比例提交新分选的基底和管腔上皮细胞，以使用制造商推荐的铬（10×基因组学）和Illumina技术进行测序。向10×Genomics提交了两份由母鼠控制的乳腺上皮细胞的单独提交。在两份提交的材料中，将两个经CO处理的MMEC和两个经4OHT处理的小鼠MMEC合并，然后分别提交进行测序。这导致共有四只经CO处理和四只经4OHT处理的9周龄小鼠用于下游分析。扩增的cDNA被构建到3′表达文库中，并汇集在150-bp、配对的化学流细胞的不同通道中。Illumina HiSeq 4000与安捷伦生物分析仪一起使用，平均文库大小在329到432 bp之间。库的适配器序列长度为124个碱基。爱荷华大学基因组学部使用Illumina bcl2fastq软件将基本调用转换为FASTQ文件。每个样本捕获了3546到5545个细胞，提交测序，每个细胞的平均读数为63842到94776。

scRNA-Seq数据处理和质量控制

使用Cell Ranger v.3.0.1和mm10参考基因组（GRCm38.91）绘制转录本。使用R导入过滤后的基因计数矩阵，并使用Seurat R软件包v.3.1提出的标准工作流程在下游分析之前完成所有样本的质量控制(Butler等人。，2018;Stuart等人。，2019). 所有RNA特征计数<200或线粒体DNA百分比>5%的细胞均被清除。

scRNA-Seq聚类和可视化

使用Seurat完成scRNA-seq数据归一化，以说明每个细胞中相对于总表达值的特征表达测量值，并使用1×10的对数转换数据4因子(Butler等人。，2018;Stuart等人。，2019). 在数据集中确定了显示高细胞间变异性的特征子集。如前所述，使用相互最近邻方法将四个单独的样本组合成一个单一的“集成”修拉对象(Stuart等人。，2019)，允许进一步分析，以识别数据集之间的常见单元格类型，并控制样本之间的批处理效应。进行了线性缩放，并完成了主成分分析计算。UMAP是使用RunUmap（运行Umap）默认设置和主元件输入设置为20的功能(Becht等人。，2018). 这个查找群集Seurat函数使用默认的Louvain算法，分辨率为0.5个聚类单元，识别出13个聚类。的序列Cre公司将转基因连接到mm10参考基因组中，并通过Cell Ranger重新运行所有四个样本。提取转基因的单细胞表达数据，并将其添加到之前的数据中，以便于可视化，同时保持聚类与公认的mm10参考基因组一致。使用Wilcoxon秩和检验计算差异基因表达，假计数为0.01，无对数变化阈值或细胞百分比。使用Bonferroni方法调整差异基因表达的p值，以进行多假设比较。

路径分析

使用IPA（德国希尔登QIAGEN）分析来自scRNA-seq量化的差异基因表达结果。对每个簇分别进行分析，以检查其高度显著上调或下调的基因在CO和4OHT之间的关系。完成分析时，调整后的p<0.05，对数变化≥和≤0.5，以隔离各簇中KO改变的顶层网络Tfap2c型。

细胞周期分析

利用scRNA-seq数据计算CO和4OHT处理小鼠在先前生成的整合物体上的细胞周期阶段。根据之前发布的标记确定分数(Nestorowa等人。，2016). 利用细胞周期评分Seurat中关于四个样本的综合元数据的功能，S和G2/M分数存储在对象元数据中，并根据之前发布的标记将每个细胞分类为G2M、S和G1期。通过使用ggplot2 R包v.3.2.1创建频率表和图形，可以可视化基于集群的细胞周期分布。

哺乳动物试验

从CO和4OHT处理的FVB中新分类的基础MMEC/Tfap2c型飞行/飞行/Krt5 CreER公司T2段以4000个细胞/孔、8000个活细胞/毫升的密度将母鼠对照小鼠培养在低附着板上，置于补充有EpiCult-B增殖补充剂、10 ng/mL表皮生长因子、10 ng/毫升成纤维细胞生长因子β、4μg/mL、10%FBS、，和50μg/mL庆大霉素在37°C的低氧培养箱中培养14天(Dong等人。，2013;Shaw等人。，2012). 上述分拣一式三份。在这两种情况下，每种情况下大约有48000个BC被分类，这使得总共有12个井被电镀。第21天，通过引入胰蛋白酶和通过20G注射针轻轻抽吸机械破坏初级乳房，生成次级乳房。同样，每种条件下采集48000个细胞，将每种条件的12个重复细胞接种在低粘附性平板上。二次乳房球在37°C的低氧培养箱中培养14天。对乳房进行盲法分析和数据收集，以治疗乳房。所有用于对比分析的图像均在第14天拍摄。通过ImageJ软件，利用最小直径40μm和3D结构证据来评估乳房球总数，以区分单个基底细胞、细胞聚集物和其他碎片。乳房球形成效率由每层基底上皮细胞形成的乳房球百分比决定。在乳腺腺病毒检测中，从Tfap2c型飞行/飞行对MMEC进行初步筛选后，立即用腺病毒转导。第二天，重新采集所有BCs，在过滤单细胞后，通过FACS对腺病毒GFP和GFP标记的Cre重组酶进行GFP阳性分选。如前所述，将这些细胞放置在非粘附板中，并在14天时评估其是否形成乳房球。

腺病毒转导

增强型腺病毒-GFP（Ad5CMVeGFP）和增强型GFP标记的CRE重组酶腺病毒（Ad5CMVCre-eGFP）均购自爱荷华大学病毒载体核心（爱荷华州爱荷华市），病毒滴度为5×1010每毫升斑块形成单位。Ad5CMVeGFP通过CMV启动子表达增强的GFP，Ad5CMVCre-eGFP在IRES序列的下游具有GFP。所有转导均在无血清Opti-MEM中以200的感染倍数进行1小时。所有下游腺病毒实验均以一式三份的方式进行，其中MMEC是从细胞分选中获得的，如前所述。

小鼠乳腺移植

对3周龄的FVB/NJ受体雌性处女进行麻醉，将右第四乳腺的脂肪垫清除至淋巴结，组织学证实乳腺完全切除。在一组实验中，1-mm3乳腺切片取自9周龄FVB/Tfap2c型飞行/飞行/Krt5-Cre-ER公司T2段之前用4OHT或CO治疗4至5周后有条件地敲除的小鼠Tfap2c型，然后按照上述相同的清除方法移植到清除的脂肪垫中。在另一个一致的实验中，从FVB中获得新鲜的FACS分类MMEC/Tfap2c型飞行/飞行用Ad5CMVeGFP或Ad5CMVCre-eGFP和9000–10000 GFP转导的小鼠乳腺+将MMEC移植到受体小鼠新清除的脂肪垫中。8周后，收集移植的乳腺进行整体染色和分析，由盲法研究者进行。

伪时间分析

Slingshot用于推断和验证细胞谱系(Street等人。，2018). Slingshot对象是使用先前生成的集成scRNA对象生成的。伪时间推断的tSNE图是使用dims=20、max_iter=2000、seed.use=2和其余默认设置生成的。集群按照之前的Seurat集群标记进行标记，以确保一致性，Slingshot使用的tSNE标识符运行缩小尺寸，start.clus设置为集群11，最大迭代次数设置为20。使用Sling伪时间功能。使用p-Creode对先前生成的Seurat综合目标进行无监督轨迹分析(Herring等人。，2018). 根据程序建议使用默认参数，并显示n=200次运行的典型轨迹。为了一致性，从p-Creode推断轨迹的节点根据之前指定的Seurat簇颜色进行着色。

统计分析

对于分支和免疫组化数据的整体分析，对于非正态分布的小样本，使用非参数Mann-Whitney U检验评估统计显著性。对于乳腺移植实验，进行了Mann-Whitney U检验和Fisher精确检验。小于0.05的p值被认为是显著的。由于哺乳动物数量和大小是连续的未配对数据，因此使用Student t检验进行分析。由于每个集群中的细胞计数在CO或4OHT处理下都是可分类的，因此使用裂方检验来确定Seurat的scRNA-seq集群细胞点之间的显著性。所有scRNA-seq统计分析均在R版本3.6.0中进行。所有剩余的统计分析均在GraphPad Prism v.8.0.1中进行。

数据可用性

RNA-seq数据是可用的，并且可以从Gene Expression Omnibus（GEO:GSE143159).

作者贡献

概念化、V.W.G.、E.C.、T.W.、W.Z.和R.J.W。；方法论、V.W.G.、E.C.、D.T.T.、T.W.、W.Z.和R.J.W。；软件、E.C.、D.T.T.、N.B.和M.V.K。；验证、V.W.G.、E.C.、D.T.T.、V.C.C.、N.B.、K.E.K.、V.T.W.、A.W.L.、D.M.V.D.H.、J.R.W.和M.V.K。；形式分析、V.W.G.、E.C.、D.T.T.、V.C.C.、N.B.、V.T.W.、A.W.L.和M.V.K。；调查、V.W.G.、E.C.、D.T.T.、V.C.C.、K.E.K.、V.T.W.、A.W.L.、D.M.V.D.H.和J.R.W。；资源、V.W.G.、E.C.、D.T.T.和K.E.K。；数据处理、E.C.、D.T.T.、N.B.和M.V.K。；写作——原稿，V.W.G.和R.J.W。；写作——评论与编辑、V.W.G.、E.C.、D.T.T.、V.C.C.、N.B.、K.E.K.、V.T.W.、A.W.L.、D.M.V.D.H.、J.R.W.、M.V.K.、T.W.，W.Z.和R.J.W。；可视化、V.W.G.、E.C.、D.T.T.和K.E.K。；监督、V.W.G.、W.Z.和R.J.W。；项目管理局，W.Z.和R.J.W。；融资收购、T.W.、W.Z.和R.J.W。

利益冲突

作者声明没有相互竞争的利益。

致谢

这项工作得到了NIH拨款R01CA183702（PI:R.J.W.）、CA200673（PI:W.Z.）、CA 203834（PI:W-Z.）T32CA14862（P.I.:R.J.W）、DOD/CDMRP拨款BC180227（PI:W/Z.）以及克里斯汀·奥利文乳汁乳腺癌研究基金会（给R.J.W.Kristen Olewine Milke Breast Cancer Research Fund）、J.D.和吉尔·托雷森（给R.JW.）以及博士和夫人的慷慨捐赠。詹姆斯·罗伯特·斯宾塞家族癌症研究基金（W.Z）。国家卫生研究院拨款T32CA148062支持E.C.、D.T.T.、K.E.K.、V.T.W.、A.W.L.和D.M.V.D.H。N.B.得到了F30奖学金CA206255的支持。

笔记

发布日期：2020年12月30日

脚注

补充信息可在网上找到https://doi.org/10.1016/j.stemcr.2020年12月02日。

补充信息

文件S1。图S1–S6和表S1：
单击此处查看。（150万，pdf）
表S2。按簇表达基因的细胞比例的变化：
单击此处查看。（484K，xls）
文件S2。文章及补充信息：
单击此处查看。（5.7M，pdf格式）

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