RNA。 2020年10月； 26(10): 1414–1430.
消除 校准1 CRISPR-Cas9基因编辑的长3′-UTR mRNA亚型损伤小鼠背根神经节发育和海马神经元激活 ， 1, 三 ， 1, 三 ， 1 ， 1 ， 1 ， 2 ， 1 ， 1, 2 ， 1 和 1
Bongmin Bae公司 1 美国内华达州里诺市内华达大学生物系，邮编89557
汉娜·格鲁纳 1 美国内华达州里诺市内华达大学生物系，邮编89557
梅布·林奇 1 美国内华达州里诺市内华达大学生物系，邮编89557
丁峰 1 美国内华达州里诺市内华达大学生物系，邮编89557
Kevin So（凯文·索） 1 美国内华达州里诺市内华达大学生物系，邮编89557
丹尼尔·奥利弗 2 美国内华达州里诺市内华达大学里诺医学院生理与细胞生物学系，邮编89557
格兰特·马斯蒂克 1 美国内华达州里诺市内华达大学生物系，邮编89557
魏岩 1 美国内华达州里诺市内华达大学生物系，邮编89557
2 美国内华达州里诺市内华达大学里诺医学院生理与细胞生物学系，邮编89557
西蒙·皮耶罗 1 美国内华达州里诺市内华达大学生物系，邮编89557
佩德罗·三浦 1 美国内华达州里诺市内华达大学生物系，邮编89557
1 美国内华达州里诺内华达大学生物系，邮编89557
2 美国内华达州里诺市内华达大学里诺医学院生理与细胞生物学系，邮编89557
三 这些作者为这项工作做出了同等贡献。
2020年5月15日收到； 2020年6月6日验收。
摘要 大多数小鼠和人类基因受到选择性切割和多聚腺苷酸化（APA）的影响，这通常导致两种或多种选择性长度3′非翻译区（3′-UTR）mRNA亚型的表达。 在神经组织中，APA亚型的表达在全球范围内增强，3′-UTR更长，但这些替代的3′-UTR亚型的生理相关性尚不清楚。 钙调蛋白1 ( 校准1） 是钙信号的关键集成商，产生短( 校准1-S )和long( 校准1-L )通过APA检测3′-UTR mRNA亚型。 我们发现 校准1-L 表达主要局限于小鼠的神经组织，包括背根神经节（DRG）和海马，而 校准1-S 表达得更为广泛。 smFISH透露 卡尔m1-S 和 校准1-L 定位于初级海马神经元的神经突起。 相反，培养的DRG表现出对 校准1-L 去索马里。 研究 校准1-L ，我们实施了CRISPR–Cas9基因编辑策略，以删除包含 校准1 远端poly（A）位点。 这消除了 校准1-L 表达式，同时保持表达式 校准1-S .小鼠缺乏 校准1-L ( 校准1 ΔL/ΔL )胚胎中DRG迁移紊乱，成年海马中经验诱导的神经元激活减少。 这些数据表明 校准1-L 在中枢和外周神经系统中发挥功能性作用。
关键词： 3′-UTR、钙调素、选择性聚腺苷化、mRNA定位、轴突、背根神经节、海马
结果 校准1-L 神经元表达丰富 确定短和长的相对表达 校准1 在小鼠组织中的3′-UTR亚型中，我们进行了northern blot分析，这是一种特别适合报告选择性3′-UTRs表达的方法( Miura等人，2014年 ). 使用检测长短的通用探针（uni）进行Northern杂交 校准1 3′-UTR亚型显示两者都存在 卡尔m1-L 和 校准1-S 穿过一系列成人组织。 大脑皮层显示出更丰富的 校准1-L 与 校准1-S 与非脑组织相比( A、 B），如之前所观察到的( Ikeshima等人，1993年 ; Miura等人，2013年 ). 长亚型与长亚型和短亚型之和的比率（总 校准1 )在皮层中为0.46，而在检查的其他组织（腓肠肌、骨骼肌、心脏、睾丸、肾脏和肝脏）中，该值在0.12-0.28之间。 最近的研究表明，一些3′-UTR可以被切割以生成稳定的3′-UTR转录物，这些转录物从mRNA的蛋白质编码部分分离出来( Kocabas等人，2015年 ; Malka等人，2017年 ; Sudmant等人2018 ). 为了测试这种情况是否适用于 校准1 ，并确认长3′-UTR区域与其余区域的连通性 校准1 mRNA，剥离印迹并用一个针对 校准1-L （外接）。 一个带与大小一致 校准1-L 已观察到( C） ●●●●。 因此，长3′-UTR区域与全长mRNA相连，在所检查的组织中没有观察到分裂的3′-URT。
校准1-L 神经元表达丰富。 ( 一个 )显示northern blot和DIG原位探针检测两种亚型（uni）或特别是长3′-UTR亚型（ext）的图表。 ( B )用uni探针探测从成年小鼠收集的一系列组织的Northern印迹显示 校准1-S ( 底部 箭头）和 校准1-L ( 顶部 箭头）。 比率 校准1-L 归一化为总数 校准1 （总计 校准1-S 波段强度和 校准1-L )如图所示。 ( C类 )用ext-probe进行Northern杂交。 相同的印迹被剥离并重新复制用于看家基因 磅/平方米4 作为加载控件。 ( 天 )用单探针对E13.5胚胎和8w大脑进行DIG原位杂交，结果显示 校准1 在前脑（FB）、中脑（MB）、后脑（HB）、脊髓（SC）、背根神经节（DRG）、皮层和海马（Hpc）等神经系统显示强信号。 ( E类 )用ext探针原位DIG显示神经组织特异性表达模式 校准1-L DRG和Hpc中的信号特别强。 ( F类 )来自纯化神经元、小胶质细胞、星形胶质细胞、新形成的少突胶质细胞和内皮细胞的RNA-seq轨迹被可视化。 校准1-L 基因模型如注释和 校准1-S 根据测序读取覆盖率对基因模型进行了说明。 长3′-UTR的阅读覆盖率在神经元中尤其高。 ( G公司 )QAPA用于估计 校准1-S 和 校准1-L 在每个RNA-seq数据集中找到。 poly（A）的用法表明 校准1-L 确实富含神经元。 每种细胞类型重复两次。 ( H（H） )显示RNAscope smFISH探针位置的图表。 ( I、 J )总共执行了smFISH 校准1 （uni）或 校准1-L （ext）原代DRG培养物中的转录物与β3 Tubulin（Tubb3）神经元标记物共标记。 大多数细胞显示出强大的单一信号，而外显信号在Tubb3阳性细胞中受到限制。 使用 t吨 -测试，（****） P（P） < =0.0001. n个 =58个Tubb3-pos电池， n个 =23个Tubb3-阴性细胞。 ( K（K） ， L（左） )smFISH在原代海马培养中表现出相同的趋势。 显著性使用 t吨 -测试，（****） P（P） < =0.0001. n个 =17个Tubb3-pos电池， n个 =9个Tubb3-阴性细胞。
接下来我们确定了 校准1 小鼠组织中的3′-UTR亚型。 使用地高辛标记探针在胚胎第13.5天（E13.5）小鼠和8周龄大脑中进行原位杂交（ISH）。 使用 校准1 通用探针（uni； A） 在胚胎矢状旁切片中，在大脑（包括前脑[FB]、中脑[MB]和后脑[HB]）、脊髓（SC）和背根神经节（DRG）中观察到强信号。 Uni信号在成人大脑的整个冠状面也很强，包括杏仁核、纹状体、下丘脑、皮层和海马（Hpc）( D） ●●●●。 鼻上皮（N）、肺（L）和肠上皮（I）也有表达。 相反，ISH使用探针对长3′-UTR（ext； A） 在胚胎的矢状旁切片中，染色主要局限于大脑、脊髓和DRG，与其他脑区相比，成人Hpc中的信号更强( E） ●●●●。 这些实验证明 校准1-L 富含神经组织。
神经系统中长3′-UTR亚型表达增强的总体偏向通常归因于神经元的表达( Guvenek和Tian 2018 ). 测试是否是这种情况 校准1 ，我们分析了 校准1 来自先前发表的RNA-seq数据集的不同脑细胞类型中的3′-UTR亚型( Zhang等人，2014年 ). 我们使用QAPA对这些数据进行了重新分析，这允许从RNA-seq读取中估计相对聚（A）位点使用量（PAU）( Ha等人，2018年 ). 我们分析了 校准1-S 和 校准1-L 在纯化的神经元、小胶质细胞、星形胶质细胞、新形成的少突胶质细胞和内皮细胞中。 这些数据的覆盖轨迹显示，与其他细胞类型相比，神经元中与长3′-UTR相关的读数富集度最高( F） ●●●●。 使用QAPA进行量化显示，神经元对 校准1-L (32%) ( G） ●●●●。
为了确定 校准1 在我们感兴趣的组织中，我们对DRG和海马的原代培养物进行了基于分支寡核苷酸的单分子荧光原位杂交（RNAscope smFISH）( H–L）。 与抗β3管蛋白（Tubb3）结合用于区分神经元与其他细胞类型。 在培养的DRG中，大多数细胞显示出强大的单一信号，但只有在Tubb3阳性细胞中，ext信号才显著( 一） ●●●●。 uni和extpunta的计数表明 校准1-L 主要富集于DRG中的Tubb3阳性神经元( J） ●●●●。 对原代海马培养物的分析同样表明 校准1 ext信号在Tubb3阳性神经元中显著富集( K、 L）。 结合对分离脑细胞的RNA-seq分析，这些数据表明 校准1-L 神经元表达丰富。
亚细胞定位 校准1-L 校准1 mRNA，不区分 校准1-S 或- L（左） ，在多项研究中已显示定位于轴突和树突( Zivraj等人，2010年 ; Gumy等人，2011年 ; Kobayashi等人，2015年 ; Wang等人，2015年 ; Preitner等人，2016年 ; Zappulo等人2017 ; Tushev等人，2018年 ). 之前的研究表明，importinβ1和 英帕拉 参与轴突的mRNA定位( Andreassi等人，2010年 ; Perry等人，2012年 )，我们假设 校准1-L 可能特异性定位于轴突。 为了验证这一假设，我们在分隔室或玻璃盖玻片上培养分离的胚胎DRG神经元，并进行smFISH。 DRG神经元是单极性细胞，其单个轴突干分叉为外周和中央分支，使用胚胎DRG可以高效分离神经元( 梅利和霍克2009 ). 以前的研究表明 校准1 通过多种方法在感觉神经元轴突中表达，包括FISH、微阵列和轴突转录体的RNA-seq分析( Zivraj等人，2010年 ; Gumy等人，2011年 ; Wang等人，2015年 ; Preitner等人，2016年 ). 与这些研究一致，我们发现针对这两者的探针 校准1 亚型（uni）在体细胞和轴突中显示信号( A、 B）。 卡尔m1-L 在这些实验中，由于uni（青色）和ext（洋红）信号的共定位，用白点表示表达( A） ●●●●。 我们发现了 校准1-L DRG轴突几乎没有信号( B′，B〃）。 为了证实这种表达模式，我们重新分析了从分离的DRG/脊髓轴突获得的公共RNA-seq数据( Minis等人，2014年 ). QAPA分析显示长3′-UTR在整个DRG中的相对表达为23%。 在分离的轴突中，长3′-UTR的相对表达较少（11%）( 补充图1a ). 该结果与我们的FISH数据一致，该数据显示 校准1-L 在轴突中( C） ●●●●。
亚细胞定位 校准1-L . ( 一个 )显示RNAscope smFISH探针位置的图表。 合并uni和ext图像时， 校准1-L 异构体显示为共定位（白色）斑点。 ( B )smFISH显示了强健的轴突定位 校准1-S （uni），但 卡尔m1-L （文本/品红色 B '或白色蓬塔 B 〃）在DRG轴突中观察到。 ( C类 )当计算轴突uni或extpuncta的数量时，在DRG神经元的轴突中强烈地发现uni信号，但在相同的区域几乎没有发现ext信号。 显著性使用 t吨 -测试，（****） P（P） < =0.0001. n个 =30个神经元。 ( 天 )在初级海马神经元中 校准1-S 和 校准1-L 在体细胞和神经元突起中观察到。 ( E类 )对应于的punta数 校准1-S 和 校准1-L 海马突起中的转录物没有发现显著差异。 显著性使用 t吨 -测试，ns： P（P） > 0.05. n个 =15个神经元。 ( F类 )分析所有 校准1-S 和 校准1-L 信号显示两种mRNA亚型的总体分布不同。 分析完成于 n个 =15个神经元( 校准1-L 684点， 校准1-S 907点）。 显著性通过Wilcoxon检验确定，（***） P（P） <=0.001。
最近一项使用3′端序列全局分析的研究发现 校准1-L 被浓缩过 校准1-S 大鼠海马神经膜的表达( Tushev等人，2018年 )，是一个包括轴突、树突、突触、中间神经元和神经胶质的区域( Cajigas等人，2012年 ). 为了评估 校准1 在小鼠海马神经元中，我们培养出生后第0天（P0）小鼠海马神经元并进行smFISH。 用β3管蛋白标记物鉴定神经元。 我们无法通过荧光显微镜同时监测短亚型和长亚型以及多种细胞标记物（例如，β3Tubulin和Tau都可以区分轴突和树突），因此我们将所有神经元延伸称为本分析的“过程”。 短的3′-UTR亚型在体细胞和突起中都有发现（ D〃）。 与在DRG神经元中观察到的结果相反， 校准1-L 被发现位于海马神经元突起( 用箭头表示的D′，D′白色信号）。 量化每个神经元的局部点状突起数量和每个亚型的最大移动距离显示两者之间没有显著差异 校准1 异构体( E； 补充图1b ). 然而，从躯体中心到突起的移动距离在 校准1-S 和 校准1-L 主要是由于浓缩 校准1-S 体细胞内的分布( F） ●●●●。 总的来说，这些结果表明 校准1-L 在DRG的胞体外不表达，但在海马神经元的胞体和突起中表达。
的生成 校准1 使用CRISPR–Cas9的长3′-UTR缺失小鼠 研究富含神经元的功能作用 卡尔m1-L 在体内，我们使用CRISPR–Cas9基因编辑来生成一系列缺乏 校准1-L 我们的目的是生成一个不含任何外源DNA序列的突变株系，以促进近端poly（a）位点在远端poly（a）位点上的使用。 我们设计了6个单导向RNA（gRNAs），靶向 校准1 我们预期的基因座将导致三种不同的缺失( A） ●●●●。
的生成 校准1 使用CRISPR–Cas9的长3′-UTR缺失小鼠。 ( 一个 )用于消除成熟long生产的策略示意图 校准1 3′-UTR转录本。 同时注射6个gRNAs（g1–g6）以产生各种缺失（缺失1–3）。 ( B ) 校准1 三个缺失菌株和对照同窝雌鼠成年皮层的northern印迹显示long基因的成功缺失 校准1 3′-UTR亚型。 注意，由于保留了远端PAS，删除2行产生了一个新的亚型，其长3′-UTR被截断。 来自 校准2 和 校准m3 发现基因没有改变。 磅/平方米4 用作加载控件。 ( C类 )完全失去 校准1-L 在中 校准1 ΔL/ΔL （缺失3）海马神经元已被缺乏的smFISH信号所证实，这些信号代表 校准1-L . ( 天 )现场DIG 校准1 ΔL/ΔL （删除3）胚胎也没有表达 校准1-L .
通过注射所有六种gRNAs以及编码Cas9内切酶的mRNA生成缺失小鼠菌株。 从11只创始小鼠中，我们分离出了三个品系，每个品系都有不同的缺失，我们使用Sanger测序证实了这一点。 删除1删除了包含长3′-UTR的序列，包括远端poly（A）位点。 删除2删除了包含长3′-UTR的大部分序列，但不包括远端poly（A）位点。 这种策略使近端和远端poly（A）位点彼此相邻，我们推测这可能会确保该区域的分裂，并阻止选择更下游的隐秘poly（A）位点。 删除3旨在删除远端poly（A）位点，预期尽管长3′-UTR会被转录，但它不会被裂解和聚腺苷化，从而阻止成熟的生物发生 校准1-L mRNA。
预防的有效性 校准1-L 利用uni探针通过northern杂交分析确定了这三个品系的生物发生( A） ●●●●。 我们选择分析皮层样本而不是较小的组织，因为要进行这些mRNA北部印迹需要大量的起始RNA。 值得注意的是，每个删除策略都有预期的结果。 我们发现删除1和3显示完全丢失 冷静-L 成绩单( B） ●●●●。 正如预期的那样，对缺失2行的北部分析显示，一条带的迁移率略高于 卡尔m1-S 带，表明异位转录物的生物成因略长于 校准1-S 由于第二个poly（A）信号（PAS）( B） ●●●●。 来自 校准2 和 校准m3 基因也通过northern杂交进行监测，发现没有改变( B类； 有关完整印迹，请参阅 补充图2 )。
在决定对哪一行进行表型分析时，我们推测缺失2是最令人困惑的，因为产生了异位转录物。 删除1和3策略都对 校准1-L 未改变总额的损失 校准1 水平。 我们对缺失3等位基因进行表型分析，因为它的基因组序列缺失量最小（164 bp），因此我们推断，它最不可能发生基因组元件的改变，例如可能存在于长3′-UTR编码区的未知增强子元件。 此鼠标删除行3已重命名 校准1 ΔL/ΔL .
我们进一步核实了 校准1-L 在中 校准1 ΔL/ΔL 海马使用繁缕smFISH，DRG使用ISH。 来自 校准1 ΔL/ΔL 小鼠完全缺乏信号代表 校准1-L ( C） ●●●●。 ISH用于 校准1-L 在E13.5胚胎切片中进行的研究也显示没有表达( D） ●●●●。 我们通过Sanger测序证实 校准1 ΔL/ΔL 在预测的gRNA远离靶点处，该序列并没有出现意外突变( 补充图3 )。
校准1 ΔL/ΔL 小鼠表现出DRG发育缺陷 给出以下发音 校准1-L 在DRG中( E） 我们检查了 校准1 ΔL/ΔL DRG发育缺陷的胚胎。 DRG是外周神经系统中源自神经嵴细胞的一系列神经节，在胚胎早期E10.5，神经嵴细胞已经开始在后脑尾部的脊神经管附近形成不同的神经节( A； Le Douarin和Smith 1988年 ; Marmigere和Ernfors 2007 ). 在发育的这个阶段，DRG的细胞体发出与神经发生同时发生的背外侧轴突投射( Marmigere和Ernfors 2007 ). 与形成成人结构的DRG不同，第一个颈部（C1）DRG是一个暂时的胚胎群体，失去其背外侧轴突投射，并从E10.5到～E12.5逐渐经历程序性细胞死亡( Fanarraga等人，1997年 ; van den Akker等人，1999年 )。
校准1 ΔL/ΔL 小鼠表现出DRG轴突发育缺陷。 发展中的C1 DRG显示轴突和细胞体迁移紊乱 校准1 ΔL/ΔL E10.5胚胎。 ( 一个 )的示意图 校准1 +/+ E10.5胚胎突出C1和C2 DRG轴突和细胞体的形态。 ( B ， C类 )整个底座 校准1 +/+ 和 校准1 ΔL/ΔL 通过抗Tubb3标记可视化DRG形态。 ( B )中C1 DRG（箭头）的胞体 校准1 +/+ 胚胎被捆绑在一起形成一个独特的神经节。 可以看到C2 DRG的神经突起在有组织的束中向腹侧突出。 ( C类 )中的C1 DRG 校准1 ΔL/ΔL 动物是杂乱无章的，由延伸轴突束的细胞体簇（箭头）组成。 缺失动物的C1 DRG细胞相对于 校准1 +/+ 与西北地区相邻( B ′, C类 ′). 同一Z堆叠的单个光学部分的放大视图 B 和 C类 聚焦于神经节细胞体形态紊乱的突变体，相对于对照组，其异常迁移更多的吻侧。 ( 天 – F类 )为了在胚胎之间的相同相对位置开始测量，使用n.xii作为解剖学标志来设置测量的开始，如中的灰色虚线所示 B ″, C类 ″. ( 天 )为发育DRG而观察到的异位细胞体面积的量化。 ( E类 )中异常聚集细胞体的距离 校准1 +/+ 和 校准1 ΔL/ΔL . ( F类 )C1神经节外投射轴突束数量的量化。 重要性由 t吨 -测试； n个 =4 C1图纸 校准1 +/+ ; n个 =5 C1图纸 校准1 ΔL/ΔL n.xi=副神经，n.xii=舌下神经。 ( G公司 )毛细管western分析 校准1 +/+ 和 校准1 ΔL/ΔL 胚胎DRG总体蛋白水平无变化。 显著性使用 t吨 -测试， P（P） =0.802； n个 = 3.
C1 DRG的轴突和细胞体 校准1 ΔL/ΔL E10.5的胚胎被发现相对于 校准1 +/+ 胚胎( B、 C）。 突变胚胎中C1 DRG的大量细胞体移位到邻近副神经（n.xi）通路的后脑嘴侧( C–C〃）。 在中的同一位置 校准1 +/+ 胚胎中，易位的C1 DRG小体较少，呈嘴侧型且无组织( B–B〃）。 C1 DRG细胞体 校准1 ΔL/ΔL 聚集在较小的神经节中( C–C〃）。 从这些细胞体分支出来的轴突异常投射并紧密束状( C′，见箭头）。 一些 校准1 ΔL/ΔL 轴突纵向投射，与非C1 DRG的背外侧投射形成对比（见材料和方法）。 与对照组相比，突变体中的C1 DRG细胞体沿嘴迁移显著增多( D、 E）。 最后，我们量化了从C1神经节投射出来的束簇的数量，发现从 校准1 ΔL/ΔL DRG与 校准1 +/+ ( F） ●●●●。 这些数据表明 校准1-L 损害C1 DRG轴突发育并限制吻侧细胞迁移。
我们推断 校准1 ΔL/ΔL 是修改翻译的结果 校准1 由于长3′-UTR亚型的丢失。 因此，我们对野生型和突变型E13.5 DRG中的CaM进行了Western分析。 注意，三个基因编码相同的CaM蛋白，因此该分析不能唯一报道由 校准1 由于解剖中回收的DRG材料数量较少，因此使用毛细管免疫分析法进行西方分析。 西方分析未能发现CaM水平在 校准1 +/+ 和 校准1 ΔL/ΔL 胚胎DRG( G） ●●●●。
亚细胞定位 校准1 和CaM水平在 校准1 ΔL/ΔL 海马 接下来，我们检查了 校准1 ΔL/ΔL 突变体的中枢神经系统存在神经缺陷。 我们将注意力集中在海马体上，因为 校准1-L 在这个组织里( E） ●●●●。 首先，我们表征了 校准1-L 成绩单改变了总数 校准1 海马体中的转录物或CaM蛋白。 qRT-PCR和western blot分析显示总的 校准1 RNA或CaM蛋白水平介于 校准1 +/+ 和 校准1 ΔL/ΔL ( A、 B）。 此外，我们评估了 校准1 mRNA在海马神经元突起中的定位。 两者的smFISH分析 校准1 +/+ 和 校准1 ΔL/ΔL 海马神经元显示 卡尔m1-L 没有显著损害 校准1 海马神经元中的mRNA( C、 D）。 因此，我们的结果表明 校准1 mRNA水平，亚细胞定位 校准1 mRNA或CaM蛋白水平在 校准1 ΔL/ΔL 海马体与 校准1 +/+ .
的特征 校准1 海马体中的异构体。 ( 一个 )qRT-PCR分析显示总的来说没有变化 校准1 （uni）RNA水平介于 校准1 +/+ 和 校准1 ΔL/ΔL ，而 校准1-L 表达在年被废除 校准1 ΔL/ΔL 海马体。 显著性使用 t吨 -测试，ns： P（P） > 0.05, (**) P（P） < =0.01, n个 =4只小鼠。 ( B )蛋白质印迹分析 校准1 +/+ 和 校准1 ΔL/ΔL 成年海马体整体蛋白水平无变化。 显著性使用 t吨 -测试， P（P） =0.287； n个 =3只小鼠。 ( C类 ， 天 )两者的smFISH分析 校准1 +/+ 和 校准1 ΔL/ΔL 海马神经元显示 校准1-L 没有明显损害 校准1 海马神经元中的mRNA。 采用Wilcoxon检验确定显著性，ns： P（P） > 0.05; n个 = 19 校准1 +/+ 神经元（739点）， n个 =26 校准1 ΔL/ΔL 神经元（802个点）。
校准1 ΔL/ΔL 小鼠表现出海马IEG表达减少，以应对丰富的环境暴露 CaM是参与突触传递和可塑性的CaMK、Calcineurin和MAPK信号通路的组成部分( 夏与风暴2005 ; Pang等人，2010年 ; 哈根斯顿和巴丁2011 ; Sethna等人，2016年 ). 钙 2+ 信号通过翻译后改变和启动导致从头转录的信号级联介导突触可塑性( Greer和Greenberg 2008 ; 哈根斯顿和巴丁2011 ). 考虑到这一点，我们假设 校准1-L 可能影响CaM依赖性突触传递和/或可塑性。 作为原理证明，我们使用了一种丰富的环境（EE）范式来诱导即刻早期基因（IEG）的经验驱动表达 校准1 ΔL/ΔL hippocampi并将其与 校准1 +/+ IEG的表达，尤其是cFos诱导的典型例子，是神经元激活的标志，被认为是学习和突触可塑性所必需的( Yap和Greenberg 2018 )。
暴露于环境新奇性导致大鼠角氨1（CA1）区cFos选择性增加( VanElzakker等人，2008年 )新的物体和位置诱导大鼠CA1中cFos的表达( 伊藤和舒曼2012 ). 将小鼠暴露于EE 1.5小时后，立即处死动物，收集大脑。 比较EE-诱导的cFos表达 校准1 +/+ 和 校准1 ΔL/ΔL CA1公司( A–C）。 在家庭对照组中，CA1中<2%的细胞为cFos阳性。 这与之前的报告一致，该报告显示，在家庭笼子条件下，cFos的表达极低，许多部分不含阳性神经元( Drew等人，2011年 ). 正如预期的那样，EE诱导CA1中cFos的表达达到31.9±12.5% 校准1 +/+ 老鼠( B、 C）。 EE诱导cFos表达 校准1 ΔL/ΔL 与野生型对照组相比，小鼠数量显著减少（19.8±9.1%）( B、 C类； 补充图4a ). Npas4的分析，这是另一种IEG，也被激活以响应神经元活动( 孙和林2016 )，在 校准1 ΔL/ΔL 海马( 补充图4b )。
校准1-L 随着环境暴露的增加，海马IEG表达减少。 ( 一个 )本研究中使用的富集环境和CA1区域的图解 B . ( B )显示EE-诱导cFos表达的典型图像 校准1 +/+ 和 校准1 ΔL/ΔL CA1( C类 )FIJI/ImageJ对整个CA1区cFos阳性细胞的百分比进行了量化。 显著性使用 t吨 -测试，（***） P（P） < =0.001. n个 =6只小鼠（每只小鼠的两个大脑半球分为两部分）。 ( 天 )总行驶距离、平均速度、在周边和勘探区域花费的时间水平 校准1 +/+ 和 校准1 ΔL/ΔL 采用旷野试验对小鼠进行比较。 显著性使用 t吨 -在中测试 n个 =5只小鼠； 纳秒： P（P） > 0.05.
EE范式受到多种因素的影响，这些因素调节神经反应，包括社会互动、感官刺激、学习和运动活动( 2014年阿尔维斯和拉詹 ). 为了排除运动功能受损的可能性 校准1 ΔL/ΔL 小鼠可能影响了EE诱导的IEG表达，我们进行了一项旷野试验。 两者都有 校准1 +/+ 和 校准1 ΔL/ΔL 基因型显示总行走距离、平均速度、在外围停留的时间和在勘探区停留的时间水平相似( D） ●●●●。 因此，运动功能和探索行为不会因失去 校准1-L 在这些条件下。
我们还对来自 校准1 +/+ 和 校准1 ΔL/ΔL 暴露于富集环境中的小鼠( 补充图4c )发现总CaM蛋白水平没有变化。 这一结果与Jones等人所观察到的结果类似，在Jones等人的研究中，海马体中的总CaM水平在新环境暴露下保持不变( Jones等人，2018年 ). 我们的结果再次表明，总CaM水平没有因删除 校准1-L 或通过经验依赖性神经元激活。
校准1-L 稳定性低于 校准1-S 无法确定DRG和海马表型的确切分子缺陷 校准1-L 失去了，我们将注意力转向了mRNA的稳定性 校准1 3′-UTR亚型。 一种常用的估计mRNA半衰期的技术是在阻断转录后的一段时间内通过qRT-PCR追踪转录物。 由于 校准1-S 和 校准1-L 亚型共享一个共同的短3′-UTR区域，我们无法量化 校准1-S 仅在野生型组织中使用qRT-PCR方法。 为了克服这个问题，我们使用了 校准1 ΔL/ΔL 小鼠的稳定性测定 校准1-S .使用扩展qRT-PCR引物（ext）检测 校准1-L 从 校准1 +/+ 样品和通用qRT-PCR引物（uni）用于唯一检测 校准1-S 从 校准1 ΔL/ΔL 样品( 补充图5 )。 Hprt（小时） 被量化为正常化基因( La Fata等人，2014年 ). 用放线菌素D处理初级皮层神经元，并在处理后3、6和8小时立即采集样本。 将指数回归方程拟合为各时间点上每种异构体的相对丰度，即相对量=e −kdecay*时间 并且估计了每个转录本的半衰期。 校准1-S 发现半衰期更长( t吨 1/2 =5.9±1.4小时） 校准1-L ( t吨 1/2 =2.6±0.6小时）( 补充图5a ). 什么时候？ 校准1 转录水平标准化到稳定水平 Hprt（小时） 抄本， 校准1-S 一直被发现比 校准1-L ( 补充图5b ). 放弃以下可能性 校准1 ΔL/ΔL 由于基因组操作，可能会影响到整个RNA衰变/稳定途径，我们还测量了 校准1 使用uni引物的水平 校准1 +/+ 样品。 这再次表明 校准1 在里面 校准1 +/+ 与 校准1-L ( 补充图5c ). 因此，我们得出结论： 校准1-S 异构体的半衰期比 校准1-L 亚型。
由于增强的RNA二级结构影响哺乳动物系统中mRNA的半衰期( Sun等人2019年 )，我们检查了长与短3′-UTR中预测的二级结构( Bellaousov等人，2013年 ). 我们计算了预测RNA结构的长度规范化最小热力学自由能（−ΔG/nt），并估计了3′-UTR的结构复杂性 校准1-S 和 卡尔m1-L ( 补充图6 ). 该分析表明，在 校准1-L 与 校准1-S 3′-UTR（−ΔG/nt=−0.248）。 因此，不同的RNA结构可以解释 校准1-S 和 校准1-L .
讨论 在这里，我们成功地在小鼠中实现了CRISPR–Cas9基因编辑，以消除长3′-UTR亚型的表达，同时不改变其相应的短3′-UTR亚型表达。 据我们所知，这是第一次成功实现这种方法，专门用于体内长3′-UTR亚型。 我们发现 校准1 长3′-UTR亚型损害了胚胎DRG的发育和成年海马神经元的激活，从而确立了其在胚胎发育中的功能作用 校准1-L 在外周和中枢神经系统中。 我们使用CRISPR–Cas9进行长3′-UTR缺失的方法为APA生成的长3′-UTR转录亚型的表征增加了一个重要的新工具。
尽管后生动物基因组中普遍存在替代长度3′-UTR亚型，但使用功能丧失遗传学方法确定这些转录物的生理作用很少。 在之前的一项研究中 Bdnf公司 长3′-UTR亚型是通过产生一个转基因小鼠来鉴定的，该转基因小鼠在近端poly（a）信号下游插入串联SV40 poly（a）位点，以阻止长3′-UTR的生物生成( An等人，2008年 ). 我们产生长3′-UTR亚型缺失的策略比较容易混淆，因为人工调控序列没有插入基因组。 包括这些强调控序列会产生嵌合的短3′-UTR转录物，它可以以意想不到的方式影响切割和多腺苷酸化动力学。
我们使用多个gRNAs进行CRISPR–Cas9基因编辑，因为尚不清楚我们的删除策略中哪种（如果有的话）可以有效防止 校准1 长3′-UTR生物成因。 一个担忧是，去除远端poly（A）位点可能导致下游隐匿poly（A）位点的激活。 值得注意的是，单次注射这种gRNA鸡尾酒会导致三种不同的缺失，所有这些都可以阻止 校准1-L 表达式。 我们使用删除策略#3生成的小鼠进行分析，因为这完全消除了 校准1-L 表达，仅删除包含远端poly（A）位点的164 bp序列。 然而，其他两种删除策略可能值得考虑，以删除其他基因的长3′-UTR亚型。 例如，删除#1策略的一个优点[消除了大多数长3′-UTR和远端poly（A）位点]是它不可能产生长3′-UTR亚型。 然而，实施CRISPR以消除极端长度（>10 kb）的3′-UTR可能效率很低。 删除策略#2删除近端和远端多聚（A）位点之间的序列。 该策略的主要混淆因素是，由于远端poly（A）位点保持完整，产生了一个略长于短亚型的异位截断mRNA。 尽管如此，这种方法可能是有用的，因为将两个相邻的聚（A）位点靠近可能会阻止下游隐蔽聚（A）位点的使用。
全基因组分析一致发现 校准1 定位于神经元的亚细胞( Gumy等人，2011年 ; Tushev等人，2018年 ). 根据这些数据，我们的smFISH实验表明 校准1 DRG和海马突起的mRNA亚细胞定位。 具有3′-UTR亚型不同亚细胞定位的基因的一个特征良好的例子是 Bdnf公司 . Bdnf-L公司 与限制的胞体相比，树突显著富集 Bdnf-S公司 发现去除长3′-UTR亚型可以阻止mRNA定位到树突( An等人，2008年 ). 我们假设 校准1 然而，smFISH实验表明，短和长3′-UTR亚型均在海马神经元的突起中表达，而在DRG轴突中仅发现短3′-UTRA亚型( ). 因此， 顺式 -在长3′-UTR中唯一发现的元素 校准1 不要驱动轴突/树突定位 校准1 mRNA。 根据这些线索，最近对胞体和神经磷脂转录物亚型定位的全基因组分析同样没有发现较长的3′-UTR APA亚型特别定位于神经磷脂的偏差( Tushev等人，2018年 )。
神经发育需要执行精确的基因调控程序来响应细胞外信号，从而导致细胞骨架重排，从而形成神经回路( Tessier-Lavigne和Goodman，1996年 ). 近年来，转录后水平的基因调控已成为轴突生长和引导的一个重要方面( 霍尔特和舒曼2013 ; Zhang等人2019a ， b条 ). 特别是，在发育中的生长锥中，有许多局部翻译的例子是对细胞外信号的反应( 坎贝尔和霍尔特2001 ; 林和霍尔特2007 ; Zivraj等人，2010年 ; Shigeoka等人，2013年 ). 我们的数据表明 校准1-L 对C1 DRG细胞体的迁移和发育过程中轴突的延伸很重要。 这一点从体内实验中可以明显看出，实验显示DRG的C1群体中细胞体严重紊乱，轴突异常延伸 校准1 ΔL/ΔL 胚胎( ). 需要进一步研究以确定如何 校准1-L 参与DRG细胞体定位和轴突生长，因为我们没有观察到CaM蛋白改变或轴突定位改变的作用 校准1-L .
EE-诱导的IEG表达在我们的海马中受损 校准1 ΔL/ΔL 老鼠。 IEG在突触可塑性、社会和认知功能中发挥关键作用( Coutellier等人，2012年 ; 2015年中 ). 研究表明，阻断CaM活性会抑制长期增强( Malenka等人，1989年 )支持CaM在突触可塑性中的关键作用。 因此 校准1-L 在里面 校准1 ΔL/ΔL 小鼠会损害突触可塑性和/或认知功能。 尽管IEG激活受损，但我们发现海马中CaM水平没有变化 校准1 ΔL/ΔL 老鼠。 有可能 校准1 不受活动诱导的本地翻译的监管。 或者，由于 校准1-L 丢失可能局限于某些亚细胞区域，例如激活的突触。 事实上，活动引发的翻译 校准1 突触神经体多糖体分馏实验支持了这一观点，该实验显示，突触神经体多糖体中的 校准1 NMDAR通过NMDA和谷氨酸活化后重溶酶体部分中的mRNA( Jones等人，2018年 ). 进一步调查 校准1-L 在活动诱导的突触翻译中 校准1 将通过生成一个包含与 校准1 中的编码序列 校准1 +/+ 和 校准1 ΔL/ΔL 背景。 结合使用Puro-PLA等方法进行翻译的时空分析( Tom Dieck等人，2015年 )，这样一个转基因系可以用来确定 校准1-L 3′-UTR损失影响活动导致的CaM转换，具体来自 校准1 体内位点。
最后，值得考虑的是 校准1-L 对于 顺式- 法规 校准1 翻译。 一些长的3′-UTR亚型不是影响其宿主基因的翻译，而是充当组装蛋白质的支架，这些蛋白质随后与被翻译的蛋白质形成复合物( Brigidi等人2019年 ; Lee和Mayr 2019 ). 长3′-UTR具有非编码功能，完全从编码蛋白的功能中去除。 例如 Ube3a1型 作为miRNA海绵在突触-脊髓炎区域发挥作用，与其蛋白编码能力无关，是一种不可翻译的长3′-UTR亚型 Tp53输入2 参与轴突中TrkA受体的内化( Valluy等人，2015年 ; Crerar等人2019年 )。
如何实现的机制 校准1 长3′-UTR亚型缺失损害神经元的发育和功能尚不清楚。 尽管如此，我们的方法已经揭示了PNS和CNS中由于小鼠中长3′-UTR亚型丢失而导致的神经表型。 我们已经证明了通过CRISPR/Cas9基因编辑消除长3′-UTR亚型的有效策略，而不会影响短3′-UCR的表达。 小鼠中记录的数千种长3′-UTR亚型具有未知的生理相关性( Miura等人，2013年 ). 这里描述的CRISPR方法可用于在逐基因基础上生成缺失菌株，以确定哪些长3′-UTR亚型具有体内功能相关性。
材料和方法 动物使用和组织收集 所有小鼠都被安置在一个环境控制设施中，由训练有素的实验室支持人员监督。 动物协议由内华达大学雷诺动物护理和使用机构委员会（IACUC）批准，并符合美国国立卫生研究院实验动物护理与使用指南的标准。
对于胚胎采集，每天监测杂交雌性小鼠的阴道塞，当天中午阳性鉴定为E0.5。 怀孕的老鼠在中午用一氧化碳安乐死 2 窒息，然后颈椎脱位。 E10.5和E13.5胚胎在PBS中提取。胚胎立即用于新鲜组织收集或浸泡在PBS的4%PFA中固定。 出生后第0天（P0）-P1幼崽被斩首处死，并在冷PBS或HBSS中收集组织。 对于成人组织RNA或蛋白质提取，将解剖的组织在液氮中快速冷冻，并在−80°C下储存或立即使用。 为了获得固定组织，7-9周龄的动物被安乐死，方法是过量吸入异氟醚，然后用大量PBS和4%PFA经心灌注PBS。
RT-qPCR与northern分析 使用Cellwrasher组织粉碎机将速冻组织粉碎。 然后使用RNeasy Plus通用迷你试剂盒（Qiagen）或TRIzol（Qiangen）方法提取RNA，并使用NanoDrop分光光度计定量。 对于RT-qPCR，使用SuperScript III逆转录酶（Invitrogen）或Maxima逆转录酶，逆转录1或2µg RNA。 cDNA反应在超纯水中稀释五倍用于RT-qPCR。 使用SYBR Select Master Mix for CFX（Applied Biosystems）进行RT-qPCR。 使用BioRad CFX96实时PCR机进行实时PCR，并使用三角洲CT方法对结果进行分析。 对于北方分析，poly（A） + 使用NucleoTrap mRNA试剂盒（Machery-Nagel）从总RNA中提取RNA。 如前所述进行Northern印迹分析( Miura等人，2013年 ). 简言之，poly（A） + RNA样品（2µg）在乙二醛中变性，并在向下转移之前在BPTE凝胶中运行，然后使用32-P dCTP标记的DNA探针进行northern印迹（用于生成探针的引物序列在 补充表1 ). 在使用台风FLA7000磷光成像仪（GE）检测到所需信号强度之前，将斑点暴露一夜。
地高辛原位杂交 对于与northern blot分析中相同的探针区域，使用DIG RNA标记混合物（Roche）通过体外转录生成核糖体。 将蔗糖冷冻保护的E13.5胚胎或成人大脑嵌入O.C.T化合物中，并在16–18µm处冷冻切片。 切片在抗原回收液中95°C水浴中处理5分钟，并用水冲洗两次。 为了有助于渗透，将载玻片浸泡在冰镇20%（v/v）乙酸中20秒。在用70%–100%乙醇连续洗涤脱水后，载玻片在−20°C下保存，直至使用。 在65°C的温度下，在每次杂交中使用约30 ng核糖探针过夜。 在SSC缓冲液中进行严格清洗（2×SSC和0.5×SSC中50%甲酰胺）。 抗-DIG-AP Fab抗体（Roche）在室温下在2%BSA的MABT溶液中培养1h。 在室温下使用NBT和BCIP（罗氏）进行显色，直到观察到所需的着色（16至20小时）。 使用徕卡DM IL LED显微镜或Keyence BZ-X710一体式荧光显微镜进行成像并自动缝合。
原代神经元培养 在Neurobastic培养基中解剖E13.5小鼠胚胎的DRG。 用0.25%胰蛋白酶分离细胞，并用凝胶加载尖端研磨。 将分离的细胞接种在PDL和层粘连蛋白涂层的分隔室（Xona微流体，XC450）或培养基中的盖玻片上（DMEM补充1×谷氨酰胺、10%FBS、25 ng/mL NGF和1×pen/strep）。 特别是对于分隔室，染色体室仅涂有Poly- d日 -赖氨酸（PDL），并补充含有10 ng/mL NGF而不是25 ng/mL的培养基，以促进轴突通过微槽向轴突室生长。 培养物在37°C和5%CO的条件下保持到DIV2 2 .
用0.25%胰蛋白酶分离P0–P1小鼠幼崽的皮层或海马，并在电镀介质中进行电镀（MEM补充0.5%w/v葡萄糖，0.2 mg/mL NaHCO 三 ，0.1 mg/mL转铁蛋白，10%FBS，2 mM 我 -谷氨酰胺和0.025mg/mL胰岛素）涂布到PDL涂布的六孔板上。 体外培养1天后（DIV），用生长培养基替换培养基（海马MEM补充0.5%w/v葡萄糖，0.2 mg/mL NaHCO 三 ，0.1 mg/mL转铁蛋白，5%FBS，0.5 mM 我 -谷氨酰胺和2%B-27补充剂； 补充2%B27补充剂和1×谷氨酸最大值的皮质-神经基底介质）。 将4µM AraC（Sigma-Aldrich）添加到DIV1-2的生长培养基中，以抑制非神经元细胞的生长并丰富有丝分裂后神经元。 培养物在37°C和5%CO的条件下保存至DIV7 2 .
单分子荧光原位杂交 根据制造商的指示，使用Stellaris（LGC Biosearch Technologies）或RNAscope多重荧光分析在初级神经元中进行单分子FISH（smFISH）。 简单地说，除了用超纯水中的2×SSC和10%甲酰胺替换洗涤缓冲液A、用2×SSC-甲酰胺、10%甲酰胺、10×右旋糖酐硫酸盐和250 nM探针杂交缓冲液外，星状藻smFISH是根据制造商的粘附细胞方案进行的。 在37°C的黑暗中进行约18–24小时的杂交。 对于RNAscope smFISH，用通透性溶液和蛋白酶溶液预处理细胞，并在40℃下用1×探针溶液（551281-C3或C1用于延伸探针，556541-C2用于在探针稀释剂中稀释的通用探针）培养2 h。 随后，将Amp1-FL与Amp4-FL杂交以放大FISH信号。 为了结合FISH和免疫荧光，在Amp4-FL杂交步骤后进行免疫染色。 分别在37°C和RT下培养抗Tubb3一级和二级抗体1小时。 样品用DAPI复染，并安装在抗褪色缓冲液（10mM Tris pH 8.0，2×SSC和0.4%葡萄糖在水中）或ProLong金刚石抗褪色安装剂（Invitrogen）中。 在图像采集过程中，使用在没有探针的探针稀释剂中培养的控制神经元切片来设置激光强度，以确保在实验条件下不计算背景信号。 不同条件下，激光强度和探测器范围保持不变。 鱼类数量( Mueller等人，2013年 )用FIJI/ImageJ对FISH信号进行点状计数，并用FIJI／ImageJ测量每个FISH讯号到细胞核中心的移动距离。
RNA稳定性分析和结构预测 皮质神经元用1µg/mL放线菌素D DIV6处理。 在处理后0、3、6和8 h，在TRIzol中收集总RNA。 使用Maxima逆转录酶（Invitrogen）逆转录1µg RNA。 如上所述进行RT-qPCR。 比较 校准1-S 和 校准1-L 使用BioRad CFX Manager软件计算相对于0小时每个时间点每个转录物的亚型和表达水平，并将其标准化为 Hprt（小时） （稳定的转录对照）。 为了估计每个转录物的半衰期，计算每个时间点相对于0小时的表达水平，而不将其归一化为 Hprt（小时） 对每个退化图拟合指数回归方程。 使用Excel中的Goal-seek函数计算每个转录本的半衰期，以找到转录本相对量减少到50%的时间点。 每个生物复制的半衰期用于确定每个转录本的平均值和标准偏差。
在RNAstructure Web服务器中进行RNA结构预测( Bellaousov等人，2013年 )使用默认设置，使用分析中给出的能量值和3′-UTR的长度计算出−ΔG/nt( Fischer等人2020 )。
西方分析 对于传统的蛋白质印迹分析，总蛋白在添加蛋白酶抑制剂片（Pierce）的RIPA缓冲液中提取。 蛋白质样品在15%不连续SDS-PAGE凝胶中分离，并转移到0.2µm PVDF膜上（Trans-Blot Turbo，BioRad）。 用5%脱脂牛奶封闭膜，然后在4°C下用一级抗体培养过夜。 抗CaM（Abcam 45689）和抗α-微管蛋白（Sigma T9026）抗体分别以1:500–1000和1:2000的比例使用。 在室温下进行HRP结合二级抗体孵育1h。使用ProSignal Femto试剂（Prometheus）检测HRP信号，并使用ChemiDoc Touch（Biorad）成像。
对于低输入western印迹分析，使用毛细管western系统（Wes，Protein simple）。 每个毛细管总共装载500 ng总蛋白裂解物，以可视化感兴趣的蛋白质。 以1:50的稀释度使用抗CaM和抗α-微管蛋白。 使用Compass for SW软件自动估计波段强度的量化。
CRISPR–Cas9基因编辑 麻省理工学院CRISPR设计工具( http://www.genome-engineering.org/crispr )用于设计针对不同区域的gRNA 校准1 长3′-UTR( 补充表1 ). 将序列克隆到pX330-U6嵌合BB-CBh-hSpCas9质粒（42230；Addgene）的BbsI位点。 使用HiScribe T7 mRNA合成试剂盒（新英格兰生物实验室）体外转录指导RNA，随后使用RNA Clean&Concentrator-5（Zymo Research，Cat R1016）纯化RNA，然后在安捷伦生物分析仪上进行评估，如前所述( Han等人，2015年 )。
超排卵4-6周龄FVB/NJ雌性小鼠与C57BL/6J雄性小鼠交配。 受精后，从输卵管中收集卵子。 如前所述，用Cas9 mRNA（100纳克/µL）和gRNA（各100纳克/µL）将小鼠受精卵显微注射到细胞质中( Han等人，2015年 ; Oliver等人，2015年 ; Halim等人，2017年 ). 注射后，合子在5%CO的KSOM+AA培养基（Millipore）中培养1小时 2 在转移到7至10周龄女性CD1养母之前。
用过夜蛋白酶K消化法从创始小鼠的尾夹中分离出基因组DNA。 使用缺失区域两侧的两组引物进行PCR基因分型，以使用Taq聚合酶（NEB）检测缺失。 将同父异母的创始人小鼠杂交到一起，产生F1代。 将一只同时携带缺失2和缺失3等位基因的F1雄性小鼠与C57BL/6雌性小鼠杂交，建立单独的缺失2和删除3系。 F1缺失1的动物首先与杂合子同窝（Del1/WT x Del1/WT）杂交。 将F2 Del1杂合子与C57BL/6雌性小鼠杂交，建立缺失1系。 所有PCR产物在1%琼脂糖凝胶中溶解。 为了确认缺失并检查任何插入事件，对凝胶纯化PCR产物进行了Sanger测序（内华达大学内华达基因组中心）。 在本文的实验中，删除3系与C57BL/6回交至少三次以稳定背景，杂合子对进行杂交以获得 校准1 +/+ 和 校准1 ΔL/ΔL 除非另有说明。
免疫荧光 为了进行整体分析，在前脑和后脑顶板的胚胎中制作小撕裂，以促进PFA进入神经管。 在4°C下，将胚胎在4%PFA中隔夜培养固定。 通过执行3×5 min、3×30 min，然后隔夜洗涤PBST（10%FBS和1%Triton X-100 in 1×PBS），封闭并渗透胚胎进行抗体标记。 然后添加初级抗体（Biolegend cat#801201抗β3Tublin；1:1000），并在4°C下摇晃培养两晚。 再次清洗胚胎3×5 min、3×30 min，然后在新鲜PBST中过夜。以1:200的稀释度添加二级抗体，在4°C的黑暗中摇晃两晚。再次清洗二级抗体3×5 min,3×30 min.，然后在新PBST中隔夜。 然后将胚胎浸泡在80%的甘油/PBS中至少2小时，然后安装，然后对整个安装进行成像。 使用徕卡SP8TCS共焦显微镜进行成像。 对于整个安装样品，在1048×1048px、200 Hz扫描速度、3线平均、8位和使用线性- z（z） 补偿。
对于自由漂浮脑切片染色，PFA灌注的脑在1%PFA中固定两晚，然后使用振捣器进行切片。 立即使用80µm厚的切片，或将其储存在−20°C的防冻溶液中（30%w/v蔗糖、1%w/v PVP-40、30%v/v PBS中的乙二醇），直至使用。 切片在RT时在封闭溶液中封闭2小时，一级抗体（cFos SYSY 226003；Npas4活性信号AS-AB18A）在4°C的温度下在黑暗中摇晃培养过夜。在PBS中进行10分钟×3次洗涤，然后在RT下进行荧光标记的二级抗体培养2小时， 用DAPI对细胞核进行复染。 切片安装在ProLong金刚石防褪色安装剂（Invitrogen）中。 切片在RT下固化至少3小时，并在4°C下保存，直到成像。 使用徕卡SP8TCS共焦显微镜在1024×1024px、20倍放大率、三线平均值下成像，并自动缝合图像。
DRG体内迁移分析 用抗β3Tubulin（Biolegend Cat#801201:1000）标记整个E10.5胚胎，然后通过共焦显微镜成像。 使用FIJI/ImageJ（NIH）分析图像。 要量化的细胞体是通过画一条平行于舌下神经最后一个分支的线来定义的，该分支在图像的长度上延伸。 舌下神经被选为解剖学标志，因为它的形态在突变胚胎中不受影响，并且是一个独立的参考点，因此在胚胎之间的测量是一致的。 使用FIJI/ImageJ中的徒手选择工具测量细胞体和轴突嘴侧向舌下支迁移的面积和距离。 在FIJI/ImageJ上使用多点细胞计数工具计算C1 DRG分支轴突束的数量。 一个双面学生的 t吨 -进行了显著性检验。
富集环境诱导神经活化试验 在83.8 cm×51.1 cm×H 34.3 cm的盒子中创造了丰富的环境（EE），底部有足够的铺垫材料。 不同类型的玩具被放在盒子里，盒子的侧面用彩色纸覆盖，如图所示 A.年龄匹配 校准1 +/+ 和 校准1 ΔL/ΔL 在实验之前，将幼稚动物（未用于其他测试）在家中笼子中保持至少3天不受干扰，并在测试当天转移到EE箱中。 在安乐死和组织固定之前，小鼠接触EE 1.5小时。 如上所述，使用自由浮动免疫荧光染色对脑切片进行IEG表达诱导分析。 使用FIJI/ImageJ对整个CA1区域的IEG阳性细胞进行计数。 自动调整图像的级别和颜色平衡，并对像素进行平滑处理。 然后，使用Huang的方法对图像进行阈值分割。 在应用分水岭函数分离紧密定位的细胞后，在CA1区域进行粒子分析，以计数像素单位大于40的细胞。 这些参数是通过重复的视觉检查设置的，可以最准确地检测IEG阳性细胞，并在所有图像中均匀应用。 然后将IEG阳性细胞的数量与同一CA1区域的总DAPI计数进行比较，以估计激活神经元的百分比。
野外测试 评估患者的运动功能和探索行为 校准1 +/+ 和 校准1 ΔL/ΔL 小鼠，采用ANY迷宫视频跟踪系统进行旷场实验。 在试验前一天，将年龄匹配的幼稚动物放在家中笼子的行为室中至少30分钟，并轻轻处理几分钟，以尽量减少试验期间动物的痛苦。 这些动物被送回了饲养室。 在测试日，在开始测试前30分钟，将这些动物放在家中的笼子里，进入行为室。 头顶照明设置用于防止阴影。 将一只动物放在面向墙壁的竞技场外围，记录其行为10分钟。在每次测试之间，用70%乙醇清洁器械并干燥5分钟。 获得每只老鼠的总行程、平均速度、在外围停留的时间和探索区域，以比较它们之间的行为 校准1 +/+ 和 校准1 ΔL/ΔL 使用ANY-maze软件的小鼠。
致谢 我们感谢三浦实验室的成员，特别是Vicente Gapuz III、Kayla Andrada和Zhiping Zhang博士，为该项目提供反馈和技术援助。 我们还感谢Minkyung Kim博士的实验建议，以及Brian Perrino博士和Brad Ferguson博士分享试剂。 国家普通医学科学研究所资助P.M.和W.Y.P30 GM110767； G.S.M.得到了R01 EY025205（国家眼科研究所）的支持；P.M.得到R35 GM138319（国家普通医学科学研究所）支持。 内华达大学雷诺校区的核心设施由NIGMS COBRE P30 GM103650提供支持。
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