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Oncotarget公司。2016年11月22日；7(47): 77468–77481.
2016年10月15日在线发布。 数字对象标识：10.18632/目标12684
预防性维修识别码：PMC5363598型
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MicroRNA-7通过ERK/MAPK信号通路靶向FAK抑制人非小细胞肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭

齐曹,#1 郑道茂,#1 于佳诗,1 易晨,1 孙云（音）,1 钱章,1 雷松,1和李平鹏1
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

目的

通过ERK/MAPK信号通路靶向FAK，研究microRNA-7（miR-7）对非小细胞肺癌NSCLC细胞增殖、迁移和侵袭的影响。

方法

从160例非小细胞肺癌患者手术后获得非小细胞癌组织及邻近正常组织。获得了NSCLC细胞系（A549、H1299和H1355）和正常人胎肺成纤维细胞系（MRC-5）。将NSCLC细胞分为miR-7抑制剂、miR-7模拟物、空白、miR-7模拟物对照、miR-7抑制剂对照、FAK siRNA和miR-7抑制剂+FAK siRNA组。用qRT-PCR和Western-Blotting检测miR-7和FAK mRNA在组织和细胞系中的表达。MTT法、划痕法和Transwell法检测细胞增殖、迁移和侵袭。

结果

与邻近正常组织相比，miR-7表达下调，而FAK、ERK和MAPK的mRNA和蛋白表达上调。与空白组和模拟对照组相比，miR-7模拟组和FAK-siRNA组的miR-7显著增加，但FAK、ERK和MAPK表达降低。miR-7模拟物和FAK siRNA组的细胞增殖、迁移和侵袭受到抑制，而miR-7抑制剂组则相反。

结论

miR-7可以通过下调FAK的表达来抑制ERK/MAPK信号通路的激活，从而抑制NSCLC细胞的增殖、迁移和侵袭。miR-7及其靶基因FAK可能是非小细胞肺癌诊断和治疗的新靶点。

关键词：非小细胞肺癌、microRNA-7、FAK、ERK/MAPK信号通路、细胞增殖

简介

肺癌仍然是一个世界性的重大健康问题，占新发癌症病例总数的17%，占癌症死亡总数的23%，烟草流行、二手烟和环境污染增加了发病率和死亡率负担[1,2]. 重要的是，非小细胞肺癌（NSCLC）占肺癌的80-85%，5年生存率保持在15%左右，并且在过去30年中仍未增加[三,4]. 由于70%以上的NSCLC患者被诊断为晚期疾病，因此迫切需要研究NSCLC的分子机制以及治疗晚期NSCLC新的靶向治疗[5]. 目前，破译信号通路的研究为理解非小细胞肺癌的发病机制提供了新的进展，而在非小细胞肝癌中差异表达的microRNAs（miRs）可能以参与致癌的分子通路为靶点[6–8]。

微小核糖核酸-7（miR-7）位于人类染色体9q21上，是miRNA家族的重要成员，其成熟体由23个核苷酸组成[9]. 研究表明，miR-7在各种组织和器官中高度表达，参与组织和器官的发育，参与肺癌、乳腺癌、肝癌和结肠癌等多种肿瘤的细胞增殖、迁移和侵袭[10–13]. 黏着斑激酶（FAK）是肿瘤微环境中细胞信号的多功能调节器，通过其激酶依赖和独立的功能控制细胞运动、侵袭和存活[14]. 细胞外信号调节激酶（extracellular signal regulated kinase）和丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，ERK/MAPK）信号通路也参与了多种细胞过程，如增殖、迁移和凋亡，ERK磷酸化受FAK调控[15–17]. 据报道，miR-7可抑制癌细胞信号通路的关键数量，包括EGFR/Ras/Raf/MEK/ERK1/2、EGFR/PI3K/Akt/mTOR、IGF1R/IRS、整合素/FAK、Rac1/Pak1和Ack1介导的信号转导，这些信号转导可能与肿瘤的发生、进展和转移有关[18]. 基于先前的研究结果，miR-7以配对盒6（Pax6）为靶点，通过负调控Pax6蛋白表达，激活ERK/MAPK信号通路，促进NSCLC细胞增殖和侵袭[19]. 此外，miR-7部分靶向FAK，并在整合素β（1）-FAK信号轴中发挥关键作用，这已被证明可控制肺部播散的微转移癌细胞的增殖[20,21]. 因此，我们假设miR-7可能通过ERK/MAPK信号通路影响NSCLC细胞的增殖、迁移和侵袭。本研究旨在探讨ERK/MAPK信号通路介导的miR-7及其靶基因FAK在NSCLC细胞增殖、迁移和侵袭调控中的潜在作用。

结果

非小细胞肺癌患者临床病理特征与miR-7表达、FAK和ERK/MAPK信号通路相关蛋白mRNA和蛋白表达的相关性

如图所示​图1，1miR-7在邻近正常组织中的表达高于非小细胞肺癌组织(P（P）< 0.05). 与邻近正常组织相比，非小细胞肺癌组织中FAK的mRNA和蛋白表达更高（两者均为P（P）< 0.05). 同样，非小细胞肺癌组织中ERK和MAPK的mRNA和蛋白表达高于邻近正常组织（均为P（P）< 0.05). 如表所示​表1，1，miR-7、FAK、ERK和MAPK的表达与NSCLC患者的性别、年龄、肿瘤位置、肿瘤大小或组织学类型无关（均P（P）> 0.05). 然而，miR-7、FAK、ERK和MAPK的表达与非小细胞肺癌患者的LNM和TNM分期相关（均P（P）< 0.05).

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非小细胞肺癌组织及邻近正常组织中miR-7的表达及FAK、ERK和MAPK的相对mRNA和蛋白表达；

答：。转移性非小细胞肺癌组织、非转移性非大细胞肺癌组织和邻近正常组织中miR-7的表达及FAK、ERK和MAPK的相对mRNA表达；B。FAK、ERK和MAPK在转移性非小细胞肺癌组织、非转移性非大细胞肺癌组织和邻近正常组织中的蛋白表达。注：*，与邻近正常组织相比，P（P）< 0.05; #, 与非转移性非小细胞肺癌组织相比，P（P）<0.05。非小细胞肺癌；FAK，粘着斑激酶；ERK，细胞外调节蛋白激酶；MAPK，丝裂原活化蛋白激酶。

表1

非小细胞肺癌临床病理因素及miR-7及其下游蛋白的表达
临床病理因素N个MiR-7型FAK mRNAERK mRNAMAPK mRNAFAK蛋白表达ERK蛋白表达MAPK蛋白表达
性别
男性1071.206 ± 0.391.370 ± 0.3140.939 ± 0.2770.696±0.2941.276 ± 0.2310.637 ± 0.2330.628 ± 0.166
女性531.220 ± 0.3941.423 ± 0.3320.939 ± 0.2730.738 ± 0.2651.255 ± 0.2540.665 ± 0.1490.651 ± 0.154
P（P）0.8330.32510.3960.6120.4130.397
年龄（岁）
< 50451.189 ± 0.3981.350±0.3400.937 ± 0.2950.747 ± 0.3011.282 ± 0.2210.659 ± 0.1970.641 ± 0.169
≥ 501151.219 ± 0.3891.402 ± 0.3130.940 ± 0.2680.697 ± 0.2781.264 ± 0.2450.641±0.2130.633 ± 0.160
P（P）0.6710.3610.9360.3330.6740.6290.801
LNM公司
积极的931.035 ± 0.2061.579 ± 0.2291.121 ± 0.1620.886 ± 0.2381.427 ± 0.1600.755 ± 0.1500.721 ± 0.157
否定671.456±0.4501.122 ± 0.2240.688 ± 0.1860.467±0.1121.049 ± 0.1300.496 ± 0.1850.516 ± 0.064
P（P）<0.0001<0.0001<0.0001<0.0001<0.0001<0.0001<0.0001
TNM阶段
一/二811.361 ± 0.4701.203 ± 0.2820.773 ± 0.2560.535 ± 0.2081.106 ± 0.1770.544 ± 0.2040.544 ± 0.106
三/四791.057 ± 0.1911.578±0.2351.110 ± 0.1670.890 ± 0.2371.436 ± 0.1670.751 ± 0.1550.729 ± 0.157
P（P）<0.0001<0.0001<0.0001<0.0001<0.0001<0.0001<0.0001
肿瘤位置
左侧611.248 ± 0.3751.363 ± 0.3080.942 ± 0.2920.729 ± 0.3141.276 ± 0.2430.670±0.1780.657 ± 0.159
赖特991.188 ± 0.4001.403 ± 0.3270.938 ± 0.2650.699 ± 0.2661.264 ± 0.2370.632 ± 0.2250.622 ± 0.163
P（P）0.3470.4440.9200.4900.7630.2670.185
肿瘤大小
<5厘米931.176±0.3571.326 ± 0.2750.884 ± 0.2750.659 ± 0.3201.199 ± 0.2580.599 ± 0.2140.596 ± 0.147
≥5厘米671.259 ± 0.431.426 ± 0.340.973 ± 0.270.742 ± 0.2571.312 ± 0.2160.675±0.2010.659 ± 0.167
P（P）0.1890.5200.9430.9930.7990.7780.619
组织学类型
鳞状细胞癌801.209 ± 0.4001.407 ± 0.3020.952 ± 0.2550.711 ± 0.2901.261 ± 0.2420.653 ± 0.2230.628±0.168
腺癌621.201 ± 0.3681.376 ± 0.3310.932 ± 0.2870.710 ± 0.2831.274 ± 0.2370.642 ± 0.2000.640 ± 0.159*
其他181.254 ± 0.4381.381 ± 0.3210.944 ± 0.2990.672 ± 0.2651.236 ± 0.2220.632±0.1740.664 ± 0.191
P（P）0.8790.2640.5870.5740.8190.3870.662

非小细胞肺癌；miR-7，microRNA-7；FAK，粘着斑激酶；ERK，细胞外信号调节激酶；丝裂原活化蛋白激酶；淋巴结转移；TNM，肿瘤淋巴结转移；

MiR-7在A549、H1299、H1355和MRC5细胞系中的表达

qRT-PCR结果显示，miR-7在A549、H1299和H1355细胞系中的表达低于MRC5细胞系（均P（P）< 0.05). 因此，miR-7在NSCLC组织和细胞系中低表达。如图所示​图2，2，miR-7在A549和H1299细胞中低表达，因此A549和H1299细胞系用于以下研究。

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miR-7在A549、H1299、H1355和MRC5细胞系中的表达；*，与MRC5细胞系相比，P（P）< 0.05.

转染A549和H1299细胞后MiR-7和FAK mRNA的表达

qRT-PCR结果显示，在A549和H1299细胞系中，miR-7和伪造模拟物对照组、抑制剂对照组、miR-7抑制剂+FAK siRNA组和空白组（均为P（P）> 0.05). 与模拟物对照组相比，miR-7模拟物组的miR-7表达显著增加，FAK mRNA表达降低（两者均为P（P）< 0.05). 在FAK siRNA组和miR-7模拟物组之间，miR-7和FAK mRNA的表达没有发现显著差异（全部P（P）< 0.05). 此外，与miR-7抑制剂对照组相比，miR-7抑制组显著降低了miR-7的表达，增加了FAK mRNA的表达（两者均P（P）<0.05）（图​（图3三).

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miR-7的表达

答：。和伪造信使核糖核酸B。qRT-PCR检测空白组、miR-7模拟对照组、miR-7模拟组、抑制剂对照组、miR-7抑制剂组、FAK siRNA组和miR-7抑制剂+FAK siRNA组A549和H1299细胞；*，与模拟对照组相比，P（P）< 0.05; #, 与抑制剂对照组相比，P（P）<0.05。FAK，粘着斑激酶；miR-7，microRNA-7。

miR-7和FAK之间的靶向关系

生物预测网站(网址：www.microRNA.org)表明miR-7能够靶向伪造（图​（图4A）。第4页). 为了确认伪造是miR-7的直接靶基因，荧光素酶报告载体重组质粒pFAK-Wt和pFAK-Mut的构建基于伪造mRNA 3′-UTR。双荧光素酶报告基因检测表明，与其他组相比，miR-7 mimics+pFAK-Wt组的A549细胞荧光素素酶活性降低了约42%（均P（P）< 0.05). 在H1299细胞中，与其他组相比，miR-7 mimics+pFAK-Wt组的荧光素酶活性下降了约53%（均为P（P）<0.05）（图​（图4B）。4B类). 虽然各组的荧光素酶活性没有发现显著差异伪造mut-3′-UTR（全部P>（P）0.05). 因此，伪造是miR-7的潜在靶基因。

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微小RNAorg预测FAK/PTK2型是miR-7的靶基因答：。双荧光素酶报告基因检测证实传真/PTK2是A549细胞和H1299细胞中miR-7的靶基因B。注：*，与miR-7模拟NC组相比，P（P）<0.05。FAK，黏着斑激酶1；蛋白酪氨酸激酶2；NC，阴性对照；miR-7，microRNA-7

转染A549和H1299细胞后FAK、ERK和MAPK的蛋白表达

Western-Blotting结果显示，在A549和H1299细胞系中，模拟NC组、抑制剂NC组、空白组或miR-7抑制剂+FAK siRNA组（均为阴性）中FAK和ERK/MAPK的蛋白表达无明显差异P（P）> 0.05). 与空白组相比，miR-7模拟组在miR-7过度表达的情况下，FAK、ERK和MAPK的蛋白表达显著降低（所有P（P）< 0.05). 在miR-7模拟物组和FAK siRNA组之间，FAK、ERK和MAPK的蛋白表达没有显著差异（均P（P）> 0.05). 然而，与空白组相比，miR-7抑制剂组FAK、ERK和MAPK的蛋白表达显著增加（所有P（P）<0.05）（图​（图55).

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Western-Blotting检测A549和H1299细胞中FAK、ERK和MAPK蛋白表达的比较

(答：。A549细胞中FAK、ERK和MAPK的蛋白表达；B。Western-Blotting导致A549细胞；C、。H1299细胞中FAK、ERK和MAPK的蛋白表达；D。Western-Blotting生成H1299单元格）；*，miR-7模拟组与模拟对照组相比，P（P）< 0.05; #, miR-7抑制剂组与抑制剂对照组比较，P（P）<0.05。粘着斑激酶；ERK，细胞外调节蛋白激酶；丝裂原活化蛋白激酶；miR-7，microRNA-7

miR-7对A549细胞和H1299细胞增殖的影响

转染后A549细胞和H1299细胞的OD值如图所示​图6：。6结果表明，转染miR-7模拟物的A549细胞和H1299细胞的生长速度显著低于模拟对照组的细胞（两者均为P（P）< 0.05). miR-7模拟物组和FAK siRNA组的生长速度无显著差异(P（P）> 0.05); 空白组、模拟对照组、抑制剂对照组和miR-7抑制剂+FAK siRNA组的生长速度无显著差异（均为P（P）> 0.05). 而miR-7抑制剂组的生长速度快于miR-7抑制对照组(P（P）< 0.05).

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MTT法检测miR-7对A549和H1299细胞增殖的影响；

注：*与同一时间点的模拟对照组相比，P（P）< 0.05; #, 与同一时间点的抑制剂对照组相比，P（P）<0.05。MiR-7，microRNA-7；MTT，甲基噻唑四氮唑。

miR-7对A549细胞和H1299细胞迁移的影响

如图所示​图7，7miR-7模拟物组A549细胞的迁移距离为（435.22±23.83）μm，空白组为（625.45±14.41）μm微米。这些结果表明，空白组与模拟对照组、抑制剂对照组和miR-7抑制剂+FAK siRNA组之间A549细胞迁移距离无显著差异（均P（P）> 0.05). 与模拟对照组相比，miR-7模拟组的细胞迁移能力显著降低(P（P）与抑制剂对照组相比，miR-7抑制剂组的细胞迁移能力显著增强(P（P）< 0.05). FAK siRNA组和miR-7模拟物组之间未观察到显著差异(P（P）> 0.05). 在H1299细胞中，miR-7模拟物组的迁移距离为（488.26±22.65）μm，空白组为（683.74±19.52）μm，miR-7抑制剂组为（789.41±8.90）μm，模拟物对照组为（675.83±22.78）μm，抑制剂对照组为（662.76±19.30）μm，FAK siRNA组为（476.52±26.63）μm，miR-7抑制剂+FAK siRNA组为（677.72±27.56）微米。各组H1299细胞的迁移距离与A549细胞相似。

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A549和H1299细胞迁移的结果

答：。各组A549细胞划痕宽度的比较；B。光镜下A549细胞划痕实验结果；C、。各组H1299细胞划痕宽度的比较；D。H1299细胞在光学显微镜下的伤口划痕试验结果；*，miR-7模拟组与模拟对照组相比，P（P）< 0.05; #, miR-7抑制剂组与抑制剂对照组比较，P（P）<0.05。MiR-7、微小RNA-7；MTT，甲基噻唑四氮唑。

miR-7对A549细胞和H1299细胞侵袭的影响

如图所示​图8，8miR-7模拟物组A549细胞的侵袭性细胞数为（89.08±12.56）、空白组（223.51±11.89）、miR-7抑制剂组（364.83±12.24）、模拟物对照组（225.53±14.08）、抑制剂对照组（227.02±13.92）、FAK siRNA组（81.16±9.64）和miR-7抑制物+FAK siRNA组（218.41±18.65）。空白组与模拟对照组、抑制剂对照组和miR-7抑制剂+FAK siRNA组（均P（P）> 0.05). 与模拟物对照组相比，miR-7模拟物组的细胞侵袭能力显著降低，而miR-7抑制剂组的细胞侵入能力与抑制剂对照组相比显著增强（两者均为P（P）< 0.05). FAK siRNA组和miR-7模拟物组之间的侵袭细胞数量没有明显差异(P（P）> 0.05). 在miR-7模拟物组中，由于细胞侵袭能力减弱，侵袭细胞数量减少，并且细胞间距很大；相反，miR-7抑制剂组细胞分布紧密，侵袭性细胞数量较多。在H1299细胞中，miR-7mimics组的侵袭细胞数为（168.27±15.71）、空白组（316.56±19.41）、mimics对照组（309.64±20.67）、抑制剂对照组（305.85±19.72）、miR-7抑制剂组（437.70±22.33）、FAK siRNA组（158.43±19.79）和miR-7抑制物+FAK siRNA组（301.17±22.54）。各组中H1299细胞的侵袭性细胞数与A549细胞相似。

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Transwell法检测A549和H1299细胞侵袭能力

答：。各组A549细胞浸润细胞数的比较；B。光镜下A549细胞的Transwell分析结果；C、。各组H1299细胞侵袭细胞数的比较；D。光镜下H1299细胞的Transwell分析结果；*，miR-7模拟物组与模拟物对照组相比，P<0.05；#，miR-7抑制剂组与抑制剂对照组比较，P<0.05。

讨论

MiR-7参与肿瘤的发展和进展，并能抑制许多肿瘤的发生和转移。在本研究中，我们通过一系列抑制ERK/MAPK表达调节FAK通路的实验，探讨miR-7在NSCLC细胞和FAK介导的ERK/MAPPK信号通路中的潜在作用。我们发现miR-7在NSCLC组织和细胞系中表达较低，但FAK、ERK和MAPK的表达水平上调。双荧光素酶报告基因检测结果也表明伪造是miR-7的直接靶基因。此外，在NSCLC患者中，miR-7、FAK、ERK和MAPK的表达与LNM和TNM分期相关。这些结果表明，miR-7的下调表达可能通过上调FAK介导的ERK/MAPK信号通路的表达而参与非小细胞肺癌的发生发展。

MiR-7是各种实体肿瘤中的一种假定抑癌基因，据报道在非小细胞肺癌中下调，可能通过靶向一些重要的原癌基因和抑制EGFR/AKT通路的激活来抑制肿瘤的发生[22,23]. 据报道，非小细胞肺癌中miR-7的下调表达可能与促进癌细胞进展有关，从而导致非小细胞肝癌的生长[19,24]，这与我们的研究结果一致。此外，miR-7是一种直接参与非小细胞肺癌的组织特异性miR[25]. 宫颈癌患者miR-7的低表达水平与LNM显著相关[26]. 我们发现，在非小细胞肺癌患者中，miR-7、FAK、ERK和MAPK的表达与LNM和TNM分期相关，表明miR-7及其下游通路作为非侵袭性生物标志物在评估非小细胞肝癌临床结局中的潜在作用。

为了更好地了解miR-7在非小细胞肺癌发展中的潜在分子机制，我们进行了在体外基于A549和H1299非小细胞肺癌细胞系的研究。在目前的研究中，我们发现miR-7可以抑制FAK蛋白的表达，而FAK的表达与ERK和MAPK的表达正相关，表明miR-7通过靶向FAK抑制ERK/MAPK信号通路。此外，miR-7可以抑制非小细胞肺癌细胞的迁移和侵袭，miR-7表达升高可能会增强其抑制能力，从而降低非小细胞肝癌细胞的迁移侵袭能力。我们怀疑这种迁移和侵袭能力可能与靶向FAK对miR-7 ERK/MAPK信号通路的负调控有关。

据报道，miR-7通过靶向多种致癌信号通路在调节癌细胞的启动、增殖、迁移、侵袭、存活和死亡方面发挥着广泛的作用[27,28]. 部分与miR-7在下调FAK和抑制ERK/MAPK信号通路中的作用一致，miR-7过度表达与抑制NSCLC细胞增殖、细胞迁移和致瘤性以及诱导细胞凋亡有关[29]. 此外，Hao等人[21]，Kong等人[30]和Wu等人[31]还表明，miR-7通过靶向FAK表达，能够抑制宫颈癌的转移和侵袭，抑制乳腺癌细胞的上皮-间充质转化（EMT）和转移，调节胶质母细胞瘤细胞的侵袭。我们研究的重要发现还表明，miR-7模拟组中miR-7显著增加，FAK mRNA表达降低，FAK、ERK和MAPK蛋白表达降低，细胞增殖、迁移和侵袭受到抑制；而miR-7抑制剂组则相反。结合研究中的这些重要结果，我们支持miR-7可能通过下调靶向FAK来抑制ERK/MAPK信号通路的假设，FAK可以抑制NSCLC细胞的增殖、迁移和侵袭。最近的一项研究进一步证实，miR-7在非小细胞肺癌中具有生物学功能，在抑制非小细胞癌细胞生长和诱导凋亡中起到有用的中介作用[32]. 一项宝贵的研究表明，miR-7被鉴定为直接下调FAK表达，并且miR-7通过靶向FAK抑制EMT和癌细胞转移[30]. FAK可能在肿瘤的发生发展中介导细胞信号转导，进而诱导细胞粘附、分化、增殖和迁移，这可能与肿瘤的形成、侵袭、转移和癌症患者的临床预后有关[33]. Han等人已经证明，FAK在NSCLC组织中的表达上调，并且与肿瘤细胞的增殖和转移密切相关[34]. 此外，Luo和他的同事揭示了在miR-7过度表达的NSCLC A549细胞中ERK/MAPK信号通路下调[19]。

总之，miR-7在非小细胞肺癌组织和细胞系中的表达较低，并且与非小细胞肝癌患者的LNM和TNM分期相关，表明miR-7的表达下调可能与NSCLC的发生发展有关。对于潜在的分子机制，miR-7可以通过下调FAK的表达来抑制ERK/MAPK信号通路的激活，从而抑制NSCLC细胞的增殖、迁移和侵袭。miR-7及其靶基因FAK可能是非小细胞肺癌诊断和治疗的新靶点。

材料和方法

研究对象

2012年8月至2015年11月，收集了常州市第二人民医院手术治疗的非小细胞肺癌患者（n=160；平均年龄57.5±14.2岁；男性107；女性53）的组织标本。所有患者术前均未接受放疗或化疗。手术中切除非小细胞肺癌组织和邻近正常组织，立即将部分组织标本置于液氮中冷冻，并保存在-80°C；另一部分组织标本用福尔马林固定，标记良好。所有标本均经病理诊断证实。NSCLC TNM分期[35]：I/II期（n=81）和III/IV期（n=79）。淋巴结转移（LNM）：阳性（n=93），阴性（n=67）。肿瘤部位：左肺61例，右肺99例。肿瘤大小：>5cm（n=67）和<5cm（n=93）。组织学类型：鳞癌（n=80）、腺癌（n=22）和其他（n=18）。本研究方案经常州市第二人民医院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。采用定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）和Western-Blotting检测miR-7的表达以及FAK和ERK/MAPK信号通路相关蛋白的mRNA和蛋白表达。

细胞培养、转染和分组

非小细胞肺癌细胞系（包括A549、H1299和H1355）和正常人胎肺成纤维细胞系（MRC-5）来自中国科学院上海细胞库。所有细胞系均在含有10%胎牛血清（FBS）（Hyclone，Logan，UT，USA）的RPMI 1640培养基（美国纽约州格兰德岛Gibco）中培养，并在5%的CO中培养237°C的培养箱。收集对数期细胞进行转染。使用miR-7表达最低的NSCLC细胞系进行进一步研究。对数生长期NSCLC细胞分为7组：空白组（未转染组）；miR-7 mimics组（转染miR-7 simics）；miR-7模仿对照组（转染miR-7模拟阴性对照[NC]序列）；miR-7抑制剂组（转染miR-7抑制因子）；miR-7抑制剂对照组（转染miR-7抑制物NC序列）；FAK siRNA组（转染FAK-siRNA质粒）；miR-7抑制剂+FAK siRNA组（与miR-7抑制物和FAK siRNA质粒共同转染）。所有miR-7模拟物、miR-7仿NC序列、miR-7inhibitors、miR-7-inhibitor NC序列和FAK-siRNA均购自上海基因制药有限公司（中国上海）。细胞转染24 h后，提取总RNA进行qRT-PCR，检测转染细胞中miR-7的相对表达；细胞转染72h后，提取总蛋白，Western-Blotting检测FAK、MAPK和ERK的蛋白表达（表​（表22).

表2

与实验相关的miR序列
序列
MiR-7模拟5′-UGGAAGACUAGUAUUUUGUUGU-3′
模拟控制5′-UGGAAGACUUGUGUUUUGU—3′
MiR-7抑制剂5′-ACACAAAAAUCACUGUCCA-3′
抑制剂控制5′-ACAACAAAAUCACAAAGUCUCA-3′

微RNA

伪造siRNA质粒的构建

根据伪造在GeneBank中的mRNA（GI:439874），根据siRNA的设计规则，通过siRNA设计工具（美国Ambion公司）设计了一对用于阻断FAK mRNA的特异性siRNA序列。酶限制位点，限制酶和欣德三世，添加到siRNA序列的两端，并在3′-末端限制性位点之前添加TTTT终止信号和引物结构BamH I-Sense-Loop-反义终止信号-Sal I Hind III。阳性链为：5′-GATCCCCACCTGGGCGAGTATTATTCTCAACGAATATACTGCCCAGGTTTTGTCGACA-3′；反义链为：3′-GCGGTGACCCGGTCATAAAAGTTCCTATTATGGACCGCAAAAACAGCTTTCGA-5′。质粒由武汉杰西尔生物科技有限公司（中国武汉）合成。将构建的质粒转化大肠杆菌DH5α，然后用含有卡那霉素的平板进行筛选。阳性菌落经酶消化提取鉴定，由吉林大学传染病分子生物学重点实验室进行测序分析。重组质粒命名为FAK-siRNA。序列分析结果表明，成功构建了质粒。

RNA提取和qRT-PCR

用Trizol试剂从A549、H1299、H1355和MRC5细胞、NSCLC组织及邻近正常组织中提取总RNA。用紫外分光光度计测定RNA的纯度和浓度，用琼脂糖凝胶电泳观察RNA的完整性。Primescript™RT试剂盒（Takara生物技术（大连）有限公司）用于逆转录，SYBR®预混Ex-Taq™qRT-PCR试剂盒用于PCR扩增，扩增的引物序列如表所示​表3。三甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为参考基因。使用Opticon Monitor 3软件（Bio-Rad）分析PCR结果。所有数据均采用2-ΔΔCt方法，带2-ΔΔCt证明病例组与对照组目标基因的相对表达率（ΔΔCT=ΔCT病例组-ΔCt对照组，ΔCt=CtmiR公司-Ct公司间隙)，Ct表示阈值周期。实验共进行了三次。

表3

PCR引物和探针序列
底漆序列
MiR-7型
上游5′-ACGCGGCAAGATGCTGGCA-3′
下游5′-CAGTGCTGGGTCCGAGTGA-3′
探查5′-FAM-TCGTATCCAGTGCGAATGACTC-TAMRA-3′
伪造
上游5′-CAAGGCAGAAGGCAGCTATG-3′
下游5′-ATGGAGGGAGCGTTTGA-3′
ERK公司
上游5′-AGTCGGAGTAGGTTTCG-3′
下游5′-TTTTGCTTCTGGATG-3′
MAPK公司
上游5′-AAGTCACGCTGGAGTGGTTC-3′
下游5′-CCCCGTCATCAGTTCATA-3′
间隙
上游5′-TCCGGTGATGATGCTTCCTAG-3′
下游5′-TTTTGCGGTGGAAAATGTCCTTTTC-3′

MiR-7，microRNA-7；粘着斑激酶；ERK，细胞外信号调节激酶；丝裂原活化蛋白激酶；GAPDH，甘油醛-3-磷酸脱氢酶；聚合酶链反应；

双荧光素酶报告基因检测

MicroRNA.org公司(网址：http://www.microrna.org)用于miR-7目标预测，并验证伪造是miR-7的直接靶基因。的全长3′-未翻译区域（3′-UTR）伪造对该基因进行了扩增、克隆和测序。PCR产物被克隆到PmirGLO（Promega Corp.，Madison，WI，USA）荧光素酶基因下游的多个克隆位点。对miR-7和靶基因的结合位点进行定点突变，以表达Renilla荧光素酶（TaKaRa）的pRL-TK载体作为内部参照物，调整细胞数量和转染效率的差异。MiR-7模拟物和MiR-7模拟NC分别与荧光素酶报告载体共转染到NSCLC细胞中。基于Promega试剂盒检测到双重荧光素酶活性。

蛋白免疫印迹法

收集转染细胞，在磷酸盐缓冲液（PBS）中洗涤两次，在100μl细胞裂解液中溶解（4°C，30 min）并离心（12000 g，10 min）以获得上清液，用Bradford法测定蛋白质浓度。总蛋白（50μg）在12%SDS-PAGE上运行，并电转移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，用5%脱脂牛奶在室温下封闭膜1h，与多克隆抗体孵育：兔抗人FAK（ab40794；1:1000；Abcam公司）、MAPK（ab197348；1:500；Abcan公司）和ERK（ab17942，1:1000；Abcam Company）和小鼠抗人GAPDH单克隆抗体（ab8245；1:500；Abcam公司）在4°C下过夜，洗涤3次以去除主要抗体，用IRDye™700DX标记的羊抗兔IgG（ab6721，1:2000；Abcam Company；用于检测FAK，MAPK，ERK）进一步孵育和IRDye™800DX标记的羊抗鼠IgG（ab6789，1:2000；Abcam公司；用于检测GAPDH）在室温、黑暗中放置1小时，将薄膜完全清洗，并使用Odyssey红外成像系统（LI-COR Biosciences，Lincoln，NE）进行扫描。计算每个带的积分光密度（IOD）值，并通过目标带的IOD值与相应内部参照物的IOD数值的比值计算目标蛋白的相对表达(β-肌动蛋白）。

甲基噻唑四氮唑（MTT）

转染48 h后，对各组细胞进行计数，并接种在四个96周的平板中（密度为2×102，200μl/孔，8个重复孔）。将MTT溶液（20μl）添加到每个孔中，在37°C下培养4小时，然后终止培养，并丢弃培养上清液。向每个孔中添加二甲基亚砜（DMSO）（150μl）（Sigma，Englewood Cliffs，NJ，USA），并在酶联免疫吸附检测器中轻轻摇晃10分钟。分别在490 nm波长下0 h、24 h、48 h和72 h测定吸光度值（OD）。以时间为X轴，OD值为Y轴绘制细胞活力曲线。

划痕试验

使用伤口划痕试验评估细胞迁移。消化NSCLC细胞，将细胞密度调整为5×105/毫升。将NSCLC细胞接种在Metrigel涂层的96周板中，并进行常规培养以形成细胞单层。将细胞层垂直划伤并冲洗一次，用含有10g/L牛血清白蛋白（BSA）和1%FBS的RPMI 1640培养基代替原培养基。在显微镜下测量划伤面积距离。培养24小时后，用含有10%FBS的RPMI 1640培养基进行额外替换。在额外培养24小时之后，在显微镜下测量细胞迁移到刮伤区域的相对距离。

Transwell分析

转染24 h后，将NSCLC细胞在无血清培养基中培养12 h，消化，用PBS洗涤两次，并悬浮在含有10 g/L BSA的无血清培养液Opti-MEMI（Invitrogen）中4/毫升。实验在24孔8μm Transwell板上进行（美国纽约州康宁市康宁市科宁市康宁市）（每组3个腔室；每个腔室100μl细胞悬液）。添加600μL 10%RPMI1640培养基的下室在5%CO中培养237°C以下。在迁移试验中：24小时后，用4%多聚甲醛固定细胞30分钟，并将小室置于0.2%Triton X-100（西格玛，美国）溶液中15分钟和0.05%龙胆紫染料中5分钟。在侵入试验中：在侵入试验前将50μl Matrigel（西格玛）铺展在小室中，48小时后，用上述方法固定并染色。倒置显微镜下计数染色细胞数。随机选择五个现场计数。进行了三个独立的实验。

统计分析

采用SPSS 19.0软件（美国纽约州IBM公司）进行统计分析。连续变量以平均值±标准偏差（SD）表示，并与t吨-测试、单因素方差分析和最小显著性差异t（LSD-t）（如适用）。分类变量以频率和百分比表示，并用χ2检验进行比较。一条双尾蛇P（P）值<0.05表示具有统计学意义。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（81270077-Q.Z.）的资助，部分来自常州市健康领军人才（至Q.Z）、江苏省“六大人才高峰”项目（WSN092-Q.Z..）和中国博士后科学基金资助项目（2012T50894和2012M521936-Q.Z。）。

脚注

沟通人竞争利益我们声明，我们没有利益冲突。

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