内皮细胞向间充质细胞转化在动脉粥样硬化病变中很常见，并与斑块不稳定有关

EndMT在动脉粥样硬化中引起成纤维细胞样细胞

作为一种基本的EndMT介质，我们试图从末端确认动脉粥样硬化斑块中Tgf-β的表达。SclCreER公司^T型；R26R停止Yfp；阿波（ApoE）^−/−老鼠。与已知的动脉粥样硬化作用一致^23,24，Tgf-β在所有时间点的内膜和发展中的斑块中都被识别出来，并通过CD68表达⁺巨噬细胞和α-平滑肌肌动蛋白（αSma）⁺单元格(补充图3a、b).

为了研究EndMT是否可能在动脉粥样硬化期间出现，胸主动脉斑块来自他莫昔芬诱导的末端。SclCreER公司^T型；R26R停止Yfp；阿波（ApoE）^−/−评估小鼠Yfp和成纤维细胞标记蛋白的细胞共表达。我们最初评估了成纤维细胞特异性标记物成纤维细胞激活蛋白（Fap）的共同表达，Fap由炎症和癌相关基质细胞和成纤维细胞表达²⁸也在动脉粥样硬化斑块中表达¹⁹重要的是，基因标记Fap的最新研究⁺细胞证实内皮细胞缺乏Fap表达²⁹主动脉斑块的免疫荧光共聚焦显微镜显示大量内皮谱系衍生的Yfp⁺共表达Fap的细胞(图2a-c)，表示EndMT。图像重建和z堆栈分析解决了Fap⁺Yfp公司⁺单细胞水平的共阳性细胞，消除了因细胞重叠或重叠而产生的实验伪影(补充电影1)。我们找到了Fap⁺HFD 18或30周后，成纤维细胞占成熟斑块中所有内膜斑块细胞的～25%(图2d)。计算Fap的原油数量后⁺Yfp公司⁺单元格(图2e)然后校正CD31中Yfp表达效率⁺在我们的小鼠模型中，我们确定32.5±8.5%的内膜斑块Fap⁺HFD 8周后细胞为内皮细胞，而内膜Fap为45.5±23.3%⁺HFD 30周后晚期动脉粥样硬化病变小鼠的细胞来源于内皮(图2f)。总的来说，内皮衍生Fap⁺细胞占所有内膜斑块细胞的3-9%(图2g)。这些组之间在图2d–g不显著，表明EndMT衍生细胞对内膜Fap的贡献相对恒定⁺成纤维细胞群。四色免疫荧光共聚焦显微镜显示，尤其是在内膜斑块的深层（靠近斑块“核心”），Yfp⁺法珀⁺内皮细胞系衍生细胞不表达内皮蛋白Ve-Cadherin，提示内皮细胞向更成熟的成纤维细胞样表型转变(图2h)。定量分析表明，在整个内膜Fap中⁺成纤维细胞群，9.8±4.1%的细胞为Yfp⁺内皮衍生细胞失去Ve-Cadherin蛋白表达，而Yfp为9.3±1.9%⁺血管钙粘蛋白⁺双阳性细胞，后者可能表明细胞从内皮细胞表型转变为成纤维细胞样表型(图2i)。相反，在整个Yfp中⁺内皮衍生内膜细胞群中，11.7±4.8%的细胞为Fap⁺但失去了Ve-Cadherin表达，而Fap为11.1±2.2%⁺血管钙粘蛋白⁺双阳性细胞(图2j).

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图2

EndMT在内膜斑块中产生成纤维细胞样细胞。

(a–c)三苯氧胺诱导端胸主动脉切片的免疫荧光共聚焦显微镜。SclCreER公司^T型；R26R停止Yfp；阿波（ApoE）^−/−之后的老鼠(一) 8, (b条) 18, (c（c）)30周HFD显示Yfp⁺内膜斑块内共表达成纤维细胞特异性标记Fap的细胞。L=流明；比例尺，100 微米。如图所示，以较高放大倍数插入。箭头表示共阳性细胞。(天)内膜斑块中的细胞定量显示，HFD 8周、18周和30周后，分别有10.2±2.1%、25.7±9.0%和25.6±6.3%的细胞表达Fap，表明存在成纤维细胞表型。(e（电子）)定量分析（不考虑表达Yfp的内皮细胞比例）表明，在相同的时间点，内膜Fap分别为10.0±2.6%、6.4±3.9%和14.0±7.2%⁺细胞共表达Yfp。(（f）)在计算了内皮细胞系追踪系统的效率（表达Yfp的内皮细胞的%）后，在相同的时间点，我们确定内膜Fap的32.5±8.5%、20.7±12.6%和45.5±23.3%⁺细胞来源于内皮细胞系。(克)再次考虑到我们的内皮谱系跟踪系统的效率，在同一时间点，我们分别确定3.1±1.0%、3.0±1.4%和8.8±4.7%的内膜细胞是内皮谱系衍生的Fap⁺细胞。对于图1e–h对每只小鼠至少三个空间分离的胸主动脉切片中的每一个进行至少四张图像的染色评估(n个=5只小鼠，持续8周和18周；n个=4只小鼠，持续30周）。对每只动物的数据进行平均，然后用于统计分析（单向方差分析）。NS，不显著。(小时)三苯氧胺诱导端胸主动脉切片的四色免疫荧光共聚焦显微镜。SclCreER公司^T型；R26R停止Yfp；阿波（ApoE）^−/−18周HFD后显示Yfp的小鼠⁺法珀⁺血管钙粘蛋白⁺（箭头）和Yfp⁺法珀⁺血管钙粘蛋白^负极单元格（箭头）。L=流明；比例尺，100 微米。Yfp定量⁺，传真⁺和Ve-Cadherin⁺内膜斑块中的（VeCad）细胞，如小时已执行(n个=5只小鼠）进行评估(我)所有Fap中Yfp和Ve-Cadherin的相对共表达⁺单元格(j)所有Yfp中Fap和Ve-Cadherin的相对共表达⁺细胞。(k个)在Yfp中评估Fap的表达⁺细胞FACS显示，在对照组非动脉粥样硬化结束。SclCreER公司^T型；R26R停止Yfp喂食日粮的小鼠，Yfp的21.5±0.2%⁺细胞表达Fap，而在他莫昔芬诱导的末端。SclCreER公司^T型；R26R停止Yfp；阿波（ApoE）^−/−HFD 18周后的小鼠，Yfp的36.2±3.6%⁺细胞表达Fap。在小组中研究的所有小鼠k个他们的总体年龄相同（24周）*对<0.05,n个=每组3个。

因为在培养基中很少见到成纤维细胞(图2；补充图4)，我们接下来调查了Yfp⁺法珀⁺动脉粥样硬化时血管外膜中也存在内皮细胞衍生的成纤维细胞样细胞(补充图4a–c)。外膜中Fap⁺在所有时间点，成纤维细胞占细胞的约30–35%(补充图4d)。计算Yfp原油数后⁺法珀⁺单元格(补充图4e)，Yfp表达效率修正显示，7–16%的Fap⁺外膜成纤维细胞样细胞来源于内皮细胞系(补充图4f)，含内皮血统衍生Fap⁺细胞占所有外膜细胞的2-5%(补充图4g).

我们进一步证实了内皮系衍生细胞对Fap的作用⁺FACS检测Yfp中Fap表达的成纤维细胞⁺细胞。有趣的是，我们发现24周大的非动脉粥样硬化性终末。SclCreER公司^T型；R26R停止Yfp喂食日粮的小鼠，Yfp的21.5±0.2%⁺细胞表达Fap，而在年龄匹配的他莫昔芬诱导的末端。SclCreER公司^T型；R26R停止Yfp；阿波（ApoE）^−/−接受18周HFD的小鼠，Yfp的36.2±3.6%⁺表达Fap的细胞(图2k)。与我们迄今为止的结果不同(图2a-g；补充图4)我们评估了Fap的比例⁺这些数据反映了所有可能经历或已经经历EndMT并表达Fap的内皮细胞和内皮衍生细胞的比例。

这些数据表明，动脉粥样硬化病变中大量内膜和外膜成纤维细胞样细胞是通过EndMT来源的。使用另一种标记物，成纤维细胞特异性蛋白-1（Fsp-1或S100a4）证实了这些发现。虽然最近的数据表明Fsp-1对成纤维细胞并不完全特异³⁰，通过免疫荧光共聚焦显微镜，与Fap染色相比，我们鉴定了数量相似的Fsp-1⁺共同表达Yfp的细胞(补充图5；补充电影2)支持EndMT在动脉粥样硬化中的发生。作为成纤维细胞和间充质细胞的第三个标记物，使用抗波形蛋白抗体进行的免疫荧光共聚焦显微镜再次证实了大量内皮细胞系衍生的Yfp⁺动脉粥样硬化斑块中共同表达此额外标记的细胞(补充图6).

接下来，我们试图确定内皮谱系衍生细胞是否也可能产生肌成纤维细胞或血管平滑肌细胞（VSMC）。可检测时，Yfp⁺与成纤维细胞相比，表达αSma、Sm22α或平滑肌肌球蛋白重链（Smmhc）蛋白的细胞较少被观察到，内皮细胞衍生的细胞对αSma的比例贡献⁺和Sm22α⁺比成纤维细胞样细胞低约10倍(补充图7).

氧化应激促进EndMT

接下来，我们研究了EndMT期间成纤维细胞样细胞内皮谱系规范的分子机制。虽然其在EndMT中的作用基本上是未知的，但先前的研究已经证明氧化应激是EMT相关过程中的一个重要因素^31,32我们推测这可能与动脉粥样硬化斑块EndMT期间的相关。我们首先从末端发现内膜斑块。SclCreER公司^T型；R26R停止Yfp；阿波（ApoE）^−/−小鼠表现出明显的氧化应激，在较严重的病变中，氧化应激明显加重(图3a)。虽然在外膜中也观察到了氧化应激，但在患有晚期动脉粥样硬化的小鼠的血管中，外膜中观察到的氧化应激明显低于内膜斑块中的氧化应激(图3a)。我们还进行了TUNEL染色以评估细胞凋亡，并发现大量内膜Yfp⁺早期斑块中的细胞凋亡，在较晚期的内膜斑块中明显增加(图3b)。非动脉粥样硬化小鼠的对照血管未表现出明显的氧化应激或细胞凋亡(补充图8)。我们继续评估TGF-β（已知的EndMT介质）和/或过氧化氢（H₂O（运行）₂)（氧化应激诱导剂）对人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的作用。暴露于TGF-β或H₂O（运行）₂导致形态发生剂量反应性变化，HUVEC逐渐失去鹅卵石样外观，采用分散的纺锤状形态，当TGF-β和H₂O（运行）₂一起应用(图3c)。当单独应用TGF-β时，在诱导EndMT的剂量下，细胞计数、增殖、凋亡或死亡没有变化。然而，与细胞应激的诱导相一致，H₂O（运行）₂导致细胞数量的剂量反应性减少，细胞增殖减少，细胞凋亡和死亡增加(补充图9；补充表1)。全球转录组分析表明，仅在HUVEC中应用TGF-β就导致了1363个基因/转录因子的上调和1295个转录因子的下调 微米高₂O（运行）₂上调3366个基因/转录因子和下调2934个（基于微阵列的差异表达的显著性分析^33,34; 全部的对多重比较校正后<0.05）。其中，一系列EndMT/EMT相关和间充质基因仅通过TGF-β上调(图3d；补充表2)。然而，TGF-β+H的联合应用₂O（运行）₂产生更大的EndMT附加诱导，同时内皮基因表达下调(图3d；补充表2)。这些发现通过定量实时PCR（qRT-PCR）和蛋白质印迹进行了验证₂O（运行）₂以递增和剂量反应的方式激活HUVEC中的EndMT，其效果显著优于单独TGF-β(图3e–h；补充表3和4；补充图10a、b)。与向间充质表型转化一致，用TGF-β+H处理的HUVEC₂O（运行）₂与未刺激的对照HUVEC相比，显示出更强的迁移和侵袭能力(图3i，j).

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图3

氧化应激促进EndMT并对TGF-β有加性作用。

(一)三苯氧胺诱导端胸主动脉切片的代表性二氢乙锭（DHE）显微图像。SclCreER公司^T型；R26R停止Yfp；阿波（ApoE）^−/−8周和18周HFD演示后的小鼠就地超氧化物生成。单因素方差分析；总体的对<0.0001. (b条)三苯氧胺诱导端动脉粥样硬化病变的TUNEL分析。SclCreER公司^T型；R26R停止Yfp；阿波（ApoE）^−/−8周和18周HFD后的小鼠显示Yfp凋亡⁺细胞。对于一和b条：L=流明；比例尺，100 微米。如图所示，以较高放大倍数插入。箭头表示共阳性细胞。对每只小鼠至少三个空间分离的胸主动脉切片进行染色(n个=每组5只小鼠）。非动脉粥样硬化小鼠的对照实验补充图8. (c（c）)生长在基础培养基（ctrl）中或暴露于TGF-β和/或H后的HUVEC的相差显微镜₂O（运行）₂持续5天。比例尺，100 微米。(天)热图显示内皮基因的表达（顶部），非内皮基因在EndMT/EMT中也下调，已知在EndMT/EMT中上调的基因和HUVEC暴露于对照条件下（基础培养基未刺激）的间充质基因（底部），TGF-β或TGF- 微米高₂O（运行）₂。由于GO、KEGG、Reactome或MSigDB等数据库中没有“EndMT”或“成纤维细胞”的基因集，该基因列表是通过广泛的文献搜索汇编的(补充表2)。(e（电子）)通过western blot定量检测暴露于对照（ctrl）条件（未刺激）或TGF-β、有或无H的HUVEC中FAP蛋白的表达₂O（运行）₂在100或200 微米。FAP梯形图（L）代表100 kDa（上部）和75 kDa（低强度带）。FAP预期分子量/大小为90 千帕。GAPDH阶梯代表37 千帕。GAPDH预期分子量/大小为37 千帕。(（f）)FAP公司在相同条件下通过qRT-PCR评估RNA水平。(克)CD31蛋白经western blot定量。CD31梯形图（L）代表150 kDa（上）和100 kDa（低强度带）。CD31预期分子量/大小为130 千帕。GAPDH阶梯代表37 千帕。GAPDH预期分子量/大小为37 千帕。(小时)CD31型在相同条件下，用qRT-PCR评估HUVEC的RNA水平。中的数据e（电子）——小时用双向方差分析法进行分析，结果完整补充表3. (我)未刺激HUVEC的细胞迁移与仅用TGF-β或TGF- 微米高₂O（运行）₂持续5天。单因素方差分析；总体的对=0.015. (j)未刺激HUVEC的细胞侵袭与仅用TGF-β或TGF- 微米高₂O（运行）₂持续5天。单因素方差分析；总体的对<0.0001.n个qRT-PCR为6-9，western blots为3-6。迁移和入侵由三个独立的实验确定，每个实验都有n个=3.NS，不显著*对<0.05,^**对<0.01,^***对<0.001,^****对<0.0001.

然后，我们进一步研究了血管系统中调节EndMT的信号通路的表达和激活¹⁷支持我们的假设，即氧化应激促进动脉粥样硬化斑块中的EndMT，TGF-β+H₂O（运行）₂导致TGF-β信号通路成员和EndMT介体的RNA表达水平显著增加SNAI2公司(补充图10c)。另一方面，SNAI1公司仅TGF-β增加，而座椅模块组件2TGF-β或H均不影响其水平₂O（运行）₂.的表达式座椅模块组件3增加了H₂O（运行）₂但TGF-β意外降低(补充图10d–f)。Western blot分析证实H₂O（运行）₂对HUVEC中SMAD3蛋白水平有独立影响，而对TGF-β的反应SMAD3蛋白质水平没有变化。此外，H₂O（运行）₂TGF-β导致SMAD3磷酸化增加(补充图10g；补充表4).

对富含上调基因的通路的分析表明，在用于EndMT诱导的剂量下，TGF-β单独并不激活HUVEC中的任何特定通路(补充图11a)。然而，TGF-β+H₂O（运行）₂导致许多途径的上调(补充图11b)。与我们的发现一致，氧化应激介导EndMT，TGF-β+H上调了许多途径₂O（运行）₂与纤维化（例如，肝纤维化/肝星状细胞激活）、炎症（例如，白细胞外渗信号）或氧化应激本身（例如，NRF2介导的氧化应激反应）有关。有趣的是，我们发现一些干扰素相关途径上调，而最显著上调的途径是蛋白质泛素化途径(补充图11b)。虽然我们不知道在EndMT期间研究了泛素化或干扰素信号，但两者都与EMT有关^35,36,37.

由于动脉粥样硬化背景下的EndMT需要动脉（而非静脉）内皮细胞过渡到间充质状态，因此我们评估了人类冠状动脉内皮细胞（HCAECs）经历EndMT的能力。通过HUVEC反映我们的结果，H₂O（运行）₂有或无TGF-β对HCAECs中EndMT诱导的增量效应(补充图12).

严重缺氧促进EndMT

作为氧化应激的另一种介质，缺氧是动脉粥样硬化生物学的一个基本方面。虽然众所周知可以促进EMT³⁸，尚未广泛评估低氧对EndMT的影响。我们最初证实HFD喂养端的动脉粥样硬化斑块中存在缺氧。SclCreER公司^T型；R26R停止Yfp；阿波（ApoE）^−/−小鼠，发现随着动脉粥样硬化的进行，内膜斑块中缺氧细胞的百分比显著增加(图4a)。此外，我们发现在成熟斑块中，内膜斑块中的缺氧细胞比外膜中的多(图4a)。接下来，我们继续评估低氧对EndMT的影响。暴露于缺氧、TGF-β或同时暴露于缺氧和TGF-(图4b)。RNA表达评估表明，缺氧导致一系列成纤维细胞和间充质标志物的表达增加3-6倍(图4c–f)。有趣的是，缺氧对某些内皮基因表达的影响是临界的(图4g–j)在一次事件中，朝着一个意想不到的方向前进(图4h)我们预计这可能是因为适度缺氧可以促进内皮细胞基因表达³⁹因此，如本例中所应用的以及与动脉粥样硬化相关的严重缺氧似乎促进了间充质基因的表达，同时对内皮基因产生了混合效应。然而，与EndMT一致SNAI2公司和SNAI1公司HCAEC中缺氧上调(图4k，l)。蛋白质印迹分析进一步证实了这些观察结果(图4m，n).

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图4

低氧增加EndMT，并增加TGF-β的作用。

(一)代表性的吡莫尼唑染色显示了三苯氧胺诱导末端主动脉切片缺氧的程度。SclCreER公司^T型；R26R停止Yfp；阿波（ApoE）^−/−喂食8周和18周HFD的小鼠。红色表示pO缺氧₂<10 毫米 汞。使用吡莫硝唑（红色）和DAPI（蓝色）进行特定染色。L=流明；比例尺，100 微米。对每只小鼠至少三个空间分离的胸主动脉切片进行染色(n个=每组5只小鼠）。单因素方差分析；总体的对<0.0001. (b条)暴露于缺氧和/或TGF-β5天的HCAECs的免疫染色在体外.比例尺，100 微米。(c（c）——（f）)间充质基因的相对RNA表达FAP公司,SM22αqRT-PCR评估，HCAEC中Calponin和Versican（分别）因缺氧而增加。(克——j)内皮基因的相对RNA表达CD31型、Ve-Cadherin、，电子NOS和韩国存托凭证经qRT-PCR评估，缺氧反应呈现混合效应。(k个——我)相对RNA表达SNAI2公司和SNAI1公司HCAECs中的含量因缺氧而增加。(米)通过western blot评估HCAECs中SM22α蛋白的表达，结果表明缺氧会增加SM22α的表达。SM22α梯形图（L）代表25 kDa（上部），20 kDa（中间）和15 kDa（较低）。SM22α预期分子量/大小为23 千帕。GAPDH阶梯代表37 千帕。GAPDH预期分子量/大小为37 千帕。(n个)通过western blot评估HCAECs中CD31蛋白的表达。CD31梯形图（L）代表150 千帕。CD31预期分子量/大小为130 千帕。GAPDH阶梯代表37 千帕。GAPDH预期分子量/大小为37 千帕。由于我们的目的是评估缺氧的具体影响，而不是与TGF-β的相互作用（作为参考），t吨在这种情况下进行了测试。n个在所有实验中均为3。所有实验重复3次以上。NS不显著*对<0.05,^**对<0.01,^***对<0.001,^****对<0.0001.

EndMT出现在人类动脉粥样硬化斑块中

体内目前无法在人类中追踪EndMT的血统。然而，正如我们观察到的在体外在我们这边。SclCreER公司^T型；R26R停止Yfp；阿波（ApoE）^−/−模型中，进行EndMT的细胞可以在不同的转化阶段被识别，包括同时表达内皮和间充质标志物的细胞(图2h–j)。因此，为了确定EndMT在人类动脉粥样硬化中是否有效，我们评估并比较了分类为V型（纤维钙化病变，包括纤维动脉粥样硬化瘤）和VI型（具有脆弱/不稳定特征的复杂病变）的斑块⁴⁰从人主动脉尸检标本中检测共表达内皮和间充质蛋白的细胞。使用各种标记物组合，我们确定了同时表达内皮和成纤维细胞蛋白的细胞，表明细胞正在经历EndMT。定量表达FAP/vWF、FSP-1/vWF，FAP/CD31或FSP-1/CD31组合的细胞显示，V型病变内膜细胞共表达内皮细胞和成纤维细胞蛋白的比例约为4-10%，而VI型病变的内膜细胞共有10-18%(图5a–d)。重要的是，V型和VI型斑块之间的差异对于每种测试的内皮-成纤维细胞标记物组合都是显著的，这表明在复杂和不稳定的人类动脉粥样硬化斑块中，有更大比例的细胞正在积极接受EndMT(图5a–d)。我们进一步发现，FAP的比例增加⁺vWF（vWF）⁺破裂斑块与未破裂斑块中存在共阳性细胞(图5e)支持这一观察，发现斑块纤维帽厚度与共阳性FAP百分比成反比⁺vWF（vWF）⁺斑块内的细胞(图5f)。斑块纤维帽厚度与%共阳性FAP的反向关系⁺vWF（vWF）⁺当分析仅限于帽厚度<100的斑块时，细胞持续存在 微米(补充图13)。该观察结果表明，接受EndMT的人类斑块中的细胞比例与纤维帽薄的破裂型斑块表型之间存在直接关系⁴¹.

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图5

EndMT发生于人类动脉粥样硬化，常见于复杂斑块。

根据标准标准，尸检时从腹主动脉获得的人体样本中发现的斑块被归类为AHA V型或VI型⁴⁰使用不同的内皮-间充质标记物组合进行染色，如图所示。每个×20场共阳性细胞的百分比表示为DAPI总数的函数⁺单元格（每个字段）如下：(一)FAP/vWF(b条)FSP-1/vWF(c（c）)FAP/CD31(天)FSP-1/CD31。比例尺，100 微米。如图所示，插图以更高的放大率显示，箭头表示共阳性细胞。(e（电子）)FAP百分比⁺vWF（vWF）⁺共阳性细胞根据破裂与未破裂斑块形态呈现*对<0.05,^**对<0.01,^***对<0.001. (（f）)主动脉斑块帽厚度与%FAP的散点图和回归线⁺vWF（vWF）⁺共阳性细胞。第页=0.6902,对=0.0002. 对于FAP/vWF，从16名患者中随机选择24个斑块进行评估（11个V型，13个VI型），而对于其他组合，每个分析中至少随机包括来自6名不同患者的10个斑块。

我们还对AHA V型斑块进行了联合染色（与VI型病变相比，这些斑块通常炎症较少，VSMC较多）²²内皮细胞和VSMC标记物。与我们的小鼠数据类似，虽然与共表达内皮和成纤维细胞标记的细胞相比，共表达内皮标记和VSMC标记的细胞的出现率低10倍，但我们发现，共表达血管内皮和VSMC标志的细胞占AHA V型人类斑块中所有内膜斑块细胞的～1%(补充图14).

小鼠组织固定和免疫组织化学

在HFD 8周、18周或30周后（14周、24周或36周龄）从小鼠身上获取胸主动脉。人道安乐死后，胸腔被插入，心脏迅速暴露。在右中庭创造了丰厚的租金。左心室用20号针穿刺，20号针 4毫升1×PBS °C注入至～2.5 毫升 最小值⁻¹.然后修复组织就地通过给心脏灌注20 在PBS中加入0.1%戊二醛和1.5%多聚甲醛的冰镇溶液ml。在4 °C，然后嵌入Tissue-Tek OCT包埋介质（#62550-01；电子显微镜科学，宾夕法尼亚州哈特菲尔德）。组织块保持在-80 °C，然后在徕卡低温恒温器（CM3050S，徕卡，阿伦代尔，新泽西）上以10-μm的厚度进行切片，并放置在玻璃载玻片上⁵⁶为了避免实验底物的不均一性，只采集并分析了胸主动脉（包括下面的FACS分析）。

为了在冰冻切片上进行免疫染色，在PBS中清洗解冻的载玻片，并使用20%的驴血清和5%的牛血清和0.1%Triton-100的PBS中的牛血清进行封闭。稀释后的一级抗体在第4天应用过夜 °C如下：抗CD31（#550274；BD Biosciences，San Jose，CA，1:100），抗Ve-Cadherin（sc-6458；Santa Cruz，Dallas，TX，1:50），抗Fap（ab53066；Abcam，Cambridge，MA，1:100，抗Smmhc（BT-562；生物医学技术，马萨诸塞州斯托顿，1:200），FITC-共轭抗Gfp/Yfp（ab6662；Abcam，1:150），抗Gfp/Wfp（ab13970；Abcan，1:500），抗CD68（MCA1957；Abd-Serotec，北卡罗来纳州罗利，1:200，），抗-CD45（#550539，BD Biosciences，1:200。用PBS洗涤三次后，将稀释的二级抗体（驴Alexa Fluor 488、546或594（Invitrogen，Grand Island，NY，1:750）或山羊Alexa Fuor 488,546,633（Invit罗gen，1:750 室温下h。使用含DAPI的介质（加利福尼亚州伯林盖姆Vector Laboratories）安装幻灯片。对照玻片常规平行染色，用来自同一物种的IgG或特定IgG同型替代相同最终浓度的一级抗体。使用共焦显微镜（SP5 DM；徕卡或LSM 510 Meta；德国耶拿蔡司）对载玻片进行成像。主动脉内侧层的动脉弹性层可见绿色，由于自身荧光，偶尔可见红色。对于细胞计数，图像被独立编码，然后由我们实验室的一位经验丰富的成员以盲法进行分析。为了定量EndMT的范围，在每个时间点进行染色，从每个小鼠至少三个空间分离的胸主动脉切片中评估至少四个图像。对每只动物的数据进行平均，然后用于统计分析。

动脉粥样硬化斑块缺氧的检测

使用盐酸吡莫硝唑检测缺氧（Hypoxyprobe，Hypoxysprobe Inc.，马萨诸塞州伯灵顿）。小鼠腹腔注射60 毫克 千克⁻¹吡莫尼唑制剂的体重。一小时后，处死小鼠，灌入20只 4毫升1×PBS °C，如上所述。然后按照上述方法采集并安装主动脉。解冻后，将10-μm切片在冷丙酮中固定10 分钟，清洗并在4点孵育过夜 °C，用1:20稀释在含有3%BSA的PBS中的兔抗吡莫尼唑抗血清。进一步清洗后，用DAPI标记切片，并按所述通过共焦显微镜成像。

小鼠动脉粥样硬化斑块中氧化应激和细胞凋亡的检测

通过评估血管超氧物生成来测定小鼠动脉粥样硬化斑块中的氧化应激就地使用二氢乙硫酸氢钠（DHE）荧光显微镜。DHE为蓝色荧光灯（吸收/发射：355/420 nm），而氧化态乙炔呈红色荧光（吸收/发射：518/605 nm）。主动脉在不固定的情况下采集，然后按照上述方法进行安装和切片。接下来，10 μ摩尔 我⁻¹DHE公司({“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“D23107”，“term_id”：“427031”，“term_text”：“D13107”}}D23107型; Invitrogen），应用于每个组织切片，并在37℃的黑暗湿化室中培养切片 30°C 分钟。由于染色方案，只能使用DHE（红色）和DAPI（蓝色）进行特定染色。使用共焦显微镜（SP5 DM；徕卡）对切片进行成像。

为了检测凋亡，如上所述对小鼠胸主动脉进行灌注，并用免疫荧光法检测凋亡细胞现场细胞死亡检测试剂盒（TUNEL分析；#12156792910910，罗氏，印第安纳波利斯，IN）。使用共焦显微镜（LSM 510 Meta；Zeiss）扫描载玻片。

流式细胞术和分类

为了基于FACS对循环细胞进行表征，从末端采集外周血。SclCreER公司^T型；R26R停止Yfp，结束。SclCreER公司^T型；R26R停止Yfp；阿波（ApoE）^−/−和Tie2Core；R26R停止Yfp老鼠。使用ACK裂解缓冲液（Invitrogen）进行红细胞裂解。然后用含有0.1%BSA的RPMI 1640培养基（Fischer Scientific，Pittsburgh，PA）洗涤细胞，并用CD45-APC（#5559864；BD Biosciences，1:100）或同种型对照（#5553991；BD Biosciences，1:100）染色。在RPMI 1640培养基中用0.1%BSA洗涤后，使用FACS LSRII流式细胞仪（BD Biosciences）分析细胞。

对于小鼠主动脉细胞的FACS，从最后获得消化的胸主动脉组织。SclCreER公司^T型；R26R停止Yfp；阿波（ApoE）^−/−小鼠和末端。SclCreER公司^T型；R26R停止Yfp小鼠如图所示。主动脉用2 毫克 毫升⁻¹胶原酶（C5138；Sigma）和0.4 毫克 毫升⁻¹37时RPMI 1640培养基中的弹性蛋白酶（E7885；Sigma） 1°C h.加入20%胎牛血清（FBS）（按消化液体积计），停止消化反应。然后用含有10%FBS的PBS过滤和清洗细胞。从这一点开始，由于Yfp蛋白在固定和渗透后会消散，因此使用不同的方案检测细胞表面和细胞内蛋白以及Yfp。对于带有Fap的Yfp的FACS，在含有10%FBS的PBS中重新悬浮细胞后，添加7-AAD（Beckman Coulter，Brea，CA）并存活，使用BD-InfluxTM细胞分选仪（BD-Biosciences）将活细胞分为Yfp阳性和Yfp阴性细胞群。分选后，将细胞固定在冰镇4%多聚甲醛中10 分钟，用PBS清洗并用鼠标BD Fc BlockTM（#553141；BD Biosciences）堵塞15分钟 然后在含有0.5%皂苷的PBS中用抗Fap-Alexa Fluor 647（bs-5760R-A647；Bios，Woburn，MA）对细胞进行染色 h在冰上。在BD-LSR II流式细胞仪上进行流式细胞术分析之前，用PBS清洗细胞。对于具有细胞表面表达CD31的Yfp的FACS，活细胞培养30 Hoechst 33342在冰上的最小值({“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“H21492”，“term_id”：“890187”，“term_text”：“H21492”}}H21492型; Invitrogen）和抗CD31-PECy7（#25-0311-82；eBiosciences）。清洗后，添加7-AAD（Beckman Coulter，Brea，CA），并使用BD-InfluxTM细胞分选仪（BD Biosciences）对Yfp和CD31阳性的活细胞进行定量。

人体组织免疫染色

人类腹主动脉粥样硬化免疫染色是使用先前描述过的、最初从尸检样本中提取并用于其他研究的预先存在的组织块进行的⁵⁷并获得西奈山伊坎医学院机构审查委员会的批准（由于严格的样本鉴定，确定为“非人类受试者研究”）。根据H&E染色的标准标准，斑块分为AHA V型或VI型病变（排除其他斑块类型）⁴⁰。纤维帽厚度在显微镜下使用预先校准的目镜测微计测量。为了对福尔马林固定、石蜡包埋的人体样品进行免疫荧光染色，将载玻片通过两次洗涤5次来脱蜡 在二甲苯中清洗2分钟，然后在100%乙醇中清洗2次 每个最小值，以及一系列连续的2 在90、80、70和50%乙醇中各清洗一分钟，然后在PBS中清洗。根据制造商的说明使用蛋白酶K（S3004；丹麦达科）。在10的溶液中进行抗原提取 mM柠檬酸钠，pH 6.0，40 95时最小值 摄氏度。冷却后，样品被堵塞1 在5%牛血清白蛋白和20%驴血清PBS中放置h，然后在4 在3%BSA中的°C如下：抗CD31（ab9498；Abcam，1:50）、抗CD31（M0823；Dako，1:100）、抗FAP（ab28244；Abcam，1:100）、抗FSP-1（ab27957；Abcam，1:100）、抗vWF（A0082；Dako，1:200）、抗vWF（ab68545；Abcam，1:100）、抗αSMA（ab5694；Abcam，1:100）、FITC缀合的抗αSMA（F3777；Sigma，1:200）、抗SM22α（ab14106；Abcam，1:100）。然后清洗载玻片，并按照1所示应用二级抗体 室温下h（与Alexa Fluor 594结合的抗鼠或抗兔或与Alexa-Fluor 488结合的抗兔，Invitrogen，1:750）。使用共聚焦显微镜（SP5 DM；Leica）对载玻片进行成像。为了进行更详细的分析，包括线性回归和增加统计能力，我们使用vWF和FAP的标记组合评估了更多样本（样本数见图例）。对于细胞计数，我们实验室的一名经验丰富的成员以盲法对图像进行编码和分析。

EndMT的细胞培养和诱导

HUVEC（瑞士巴塞尔隆扎）和HCAECs（隆扎）在EGM-2培养基（隆萨）中培养。为了诱导EndMT，六孔板预先涂上31.25 纳克 毫升⁻¹纤维连接蛋白（F2006；Sigma）用于1 h.HUVEC或HCAEC最初接种于5000或7500个细胞 厘米⁻²分别是。将生长培养基更换为含有50 纳克 毫升⁻¹TGF-β2（#100-35；Peprotech，Rocky Hill，NJ），含或不含过氧化氢（H）₂O（运行）₂)100或200时的（H1009；Sigma） μM（如图所示）⁵⁸第二天早上，每隔一天，持续5天。

缺氧条件下的内皮细胞培养是通过在密闭树脂玻璃室（Billups-Rothenberg模块化室；Del-Mar，CA）和5%CO的气氛中培养细胞来完成的₂/95%牛顿₂在37 °C，如上所述⁵⁹。在5天的实验中，为了尽量减少细胞暴露于氧气中，培养基只更换了一次，而不是每隔一天更换一次培养基。在非缺氧条件下生长的对照（对照）细胞的5天实验中，培养基也只更换一次。

定量实时PCR

使用基于三唑的方法（Invitrogen）从人类培养细胞中分离RNA。简言之，1 将ml三唑添加到六孔板的每个孔中。在氯仿中通过相分离提取RNA。RNA通过与异丙醇混合沉淀，并通过增量乙醇洗涤纯化。RNA在RNase和DNase游离水中稀释并储存在−80 °C直到使用。使用纳米滴NP-1000光谱仪（德国威明顿）对RNA进行定量。使用iScript cDNA合成试剂盒（加州Hercules Bio-Rad）进行反转录。反应条件为：25 5°C 最小值，42 30°C 最小值，85 5°C 最小值和4 °C永久。随后，根据制造商的协议，使用PerfeCTa SYBR Green FastMix反应混合物试剂盒（vWR，Radnor，PA）进行qRT-PCR。18秒rRNA作为对照。qRT-PCR条件如下：95 5°C 最小值，40次循环，包括95次 15°C s和60 1°C 最小值；95 15°C s和60 15°C s.RNA表达采用ΔCt法进行分析。引物序列见补充表6.

免疫印迹法

使用混合有β-巯基乙醇的Laemmli样品缓冲液（Bio-Rad）对HCAEC和HUVEC进行裂解。经超声处理和加热后，通过western blot（4–20%Novex Tris-Glycine Gel，Invitrogen）对样品进行分析。所用的初级抗体如下：抗FAP（ab53066，Abcam；1:500）、抗CD31（ab9498，Abcam；1:1000）、抗活性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（ab13847；Abcam，1:1000）、抗SM22α（ab14106，Abcam；1:1000）、抗磷酸-SMAD3（ab51451，Abcam；1:1000）、抗SMAD3（#9513，细胞信号传导，丹弗斯，马萨诸塞州；1:1000）和抗甘油醛3-磷酸脱氢酶（GAPDH）（G8795，Sigma；1:10000）。本手稿中所有图的原始未切割免疫印迹(图3e，g和4米，北；补充图9c和10g)显示为补充图16–21.

免疫细胞化学

在对照条件下，在TGF-β2±H₂O（运行）₂±缺氧治疗。用4%多聚甲醛固定10天后 分钟，用PBS洗涤，使用封闭溶液（5%正常驴血清和0.1%Triton-X100在PBS中）1 h.在第4天过夜应用以下主要抗体 °C：抗活性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（ab13847；Abcam，1:100）、抗SM22α（ab14106；Abcam1:100），抗FAP（ab53066；Abcam-1:100）和抗CD31（ab9498；Abcam/1:50），抗Ve-Cadherin（sc-6458；Santa Cruz，1:50）。用PBS清洗细胞，并应用相应的二级抗体1 室温下h。通过浸入DAPI（Invitrogen#D3571；1:1000）进行核染色。用ApopTag检测HUVEC的凋亡染色现场细胞凋亡检测试剂盒（S7100；Millipore，Billerica，MA）符合制造商的说明。

为了对人成纤维细胞进行染色，将培养细胞固定在−20的甲醇中 10°C 用0.1%吐温20在PBS中清洗并渗透10分钟 室温下的最小值。阻断后，在4点钟使用以下主要抗体过夜 °C：抗FAP（ab53066；Abcam；1:100）、抗Vimentin（ab20346；Abcam1:100）和抗FSP-1（ab27957；Abcam-1:100）。用PBS清洗细胞，并应用相应的二级抗体1 室温下h。

通过浸入DAPI（Invitrogen#D3571；1:1000）进行核染色。每次观察至少重复三次。

体外细胞活力和计数

根据制造商的说明，我们最初使用FITC Annexin V凋亡检测试剂盒（BD Pharmingen）评估了凋亡和死亡HUVEC的数量。简言之，用TGF-β2±H治疗HUVEC₂O（运行）₂用于48 将h（与增殖试验一致）轻轻胰蛋白酶化，用冷PBS洗涤并重新悬浮在结合缓冲液中。然后我们染了10个⁶单元格 毫升⁻¹在室温下使用FITC Annexin V和碘化丙啶（PI）15 min.使用配备Diva软件（BD Biosciences）的FACS LSRII流式细胞仪通过流式细胞术估计凋亡和死亡细胞的数量。然而，由于该试验需要胰蛋白酶化，我们担心这可能会导致凋亡细胞死亡，从而导致细胞凋亡的错误表达。因此，该方法仅量化了细胞死亡。通过western blot、凋亡相关蛋白免疫染色和TUNEL分析（ApopTag现场细胞凋亡检测试剂盒见上文）。用TGF-β2±H治疗5天后进行细胞计数₂O（运行）₂然后进行温和的胰蛋白酶消化并使用血细胞仪。

增殖试验

根据制造商的说明，使用细胞增殖ELISA、BrdU（比色）测定试剂盒（Roche）测量增殖。简单地说，HUVEC是在一个96-well板中播种的。第二天早上，将培养基更换为含有50 纳克 ml转化生长因子-β2±H₂O（运行）₂八小时后，BrdU被添加到每口井中，再增加16个 h.然后固定细胞，并向每个孔中添加抗BrdU-POD，以通过底物反应检测免疫复合物。通过在370℃下测量吸光度来量化反应产物 nm，使用SpectraMax M5（分子器件，加利福尼亚州森尼维尔）。每个实验分析了三口井，并进行了三次实验。

迁移和侵入分析

使用24孔QCM趋化细胞迁移试验（Millipore）评估细胞迁移 μm孔径，按照制造商的说明。HUVEC在基础培养基中培养或与50 纳克 毫升⁻¹TGF-β2（#100-35；肽基）和200 微米高₂O（运行）₂如所述持续5天。将细胞重新悬浮在EBM-2无血清培养基中，计数并以每室37500个细胞的速率将其放置在趋化性插入物上，一式三份。37岁时，细胞可以在一夜之间迁移至EBM-2培养基+10%FBS 摄氏度。细胞染色20 在室温下，用蒸馏水冲洗min，用棉签刮去插入物上腔上残留的未迁移细胞。然后将迁移的细胞溶解在提取缓冲液中。将细胞溶液转移到96 well板上，读取560的光密度 纳米。吸光度值归一化为未模拟样品的平均值。迁移是通过三个独立的实验进行计算的。

使用24孔，8 μM聚碳酸酯Transwell嵌件（康宁Costar公司，马萨诸塞州图克斯伯里）。插入物涂有生长因子减少的Matrigel，浓度为1 毫克 毫升⁻¹对于1 室温下h。使用TGF-β和200诱导EndMT 5天后 微米高₂O（运行）₂如前所述，将未经刺激和处理的细胞重新悬浮在EBM-2无血清培养基中，计数并以15000个细胞/插入物的速度将其电镀到插入物上，一式两份。24天后 h、 侵入细胞在PBS中清洗，并在冰镇70%乙醇中固定10 分钟。用棉签从插入物的上腔刮去未被感染的细胞，然后在PBS中再次清洗插入物。用手术刀从插入物中取出膜，并使用含有DAPI（Vector Laboratories）的Vectashide将其安装在玻璃载玻片上。细胞在每层膜的五个随机场中以×10倍放大成像，并使用ImageJ软件（马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院）进行计数。细胞侵袭是通过三个独立的实验计算出来的。

MMP活性和蛋白质测定

用TGF-β和200标准诱导EndMT后 微米高₂O（运行）₂在如上所述的人脐静脉内皮细胞或人成纤维细胞培养物中，然后仔细清洗，将EBM-2+0.2%FBS涂敷于细胞上16 h.收集条件培养基，在RIPA缓冲液中裂解细胞，并将样品储存在−80 °C待分析。根据制造商的说明，使用SensoLyte 520通用MMP荧光测定试剂盒（AS-71158；Anaspec，Fremont，CA）测量MMP活性。条件培养基未稀释，细胞裂解物在测定缓冲液中稀释至200 纳克 毫升⁻¹EBM-2+0.2%FBS作为阴性对照。使用SpectraMax M5在490的激发下测量最终反应 nm和520时检测到的发射 nm（分子器件，加利福尼亚州森尼维尔）。

使用Quantibody Human MMP Array 1（QAH-MMP-1；RayBiotech，Norcross，GA）测量特定MMP和TIMP蛋白水平，以检测MMP1、2、3、8、9、10、13和TIMP1、2和4。按照制造商的说明，将未稀释的条件培养基应用于阵列，并使用EBM-2+0.2%FBS作为阴性对照。使用Axon GenePix激光扫描仪（分子器件）对阵列进行Cy3波长扫描。使用ImageJ软件获取密度测定数据。所有样本均归一化为内部阳性对照，MMP/TIMP蛋白定量采用已知浓度的标准。

微阵列样品制备

初级人类成纤维细胞是从CAUSE研究（临床试验。政府标识符：{“类型”：“临床试验”，“属性”：{“文本”：“NCT01808729”，“term_id”：“ncT018087 29”}}NCT01808729号)。这项研究得到了西奈山伊坎医学院机构审查委员会的批准，所有受试者都提供了书面知情同意书。将新获得的皮肤活检样本清洗、打碎，用含有20%FBS的DMEM/F-12培养基（#11330-032；Gibco，Grand Island，NY）培养，37℃孵育 °C盖滑。～4周后，成纤维细胞分离并传代。然后将所有成纤维细胞系均匀传代并用于<P7的最终实验。在收获进行RNA提取之前，成纤维细胞被切换到含有5%FBS的DMEM/F-12培养基中24小时 h复制HUVEC培养条件（EGM-2培养基含有5%FBS）。

HUVEC的生长情况如前所述。根据制造商的说明，使用RNeasy迷你试剂盒（马里兰州日耳曼镇齐根）从HUVEC和成纤维细胞中分离RNA。在RNeasy制备过程中，使用无RNase DNA酶组（Qiagen）柱上DNA酶处理去除残余DNA。RNA由Illumina TotalPrep RNA扩增试剂盒扩增，并与HumanHT-12 v4表达芯片杂交（Illuminia，San Diego，CA）。使用Illumina HiScan扫描芯片。

统计和生物信息学分析

对于细胞培养，每个单独的实验至少重复三次。在适当的情况下，通过随机数生成器将小鼠随机分为实验组。统计能力是根据我们实验室使用类似模型进行的先前研究确定的^17,56将数据归一化为每个实验的平均值，参考条件设置为1。实验数据采用非配对双尾模型进行分析t吨-检验，单向方差分析事后（post-hoc）Dunnett’s（以基线为参考）或Newman–Keuls（如果多组间比较合适）多重比较测试，或如图所示，使用Bonferroni后验进行双向方差分析。结果表示为平均值±标准偏差。线性回归用于建模纤维斑块帽厚度与%FAP之间的关系⁺vWF（vWF）⁺人类动脉粥样硬化斑块中的共阳性细胞。在以下情况下，差异被视为显著对<0.05. 使用Prism 4.00版（GraphPad软件）或STAT VIEW软件包（SAS、Cary、NC）进行这些分析。

为了进行微阵列数据分析，Illumina Hiscan生成的图像被上传到GenomeStudio软件中进行初级数据提取和分析。通过平移检测来过滤杂散探针对值放入q个值^60,61并取下最大值的探针q个所有样本的值为10%。结果日志的差异表达式分析₂-转换后的数据使用其默认参数进行微阵列显著性分析^33,34错误发现率<5%的基因被认为是差异表达的。通过巧妙途径分析（ingenuity Systems，Redwood City，CA）和分子特征数据库，在差异表达基因的结果列表中确定了丰富的途径和其他基因集，如细胞外基质组织基因⁶²应用程序（错误发现率<5%，表示富集）。基因表达数据的聚类采用组平均层次聚类算法，以Pearson相关性作为相似性度量。使用Matlab（Mathworks，Natick，MA）计算和可视化生成的树状图，并使用单链接算法、欧氏距离和其他分层聚类选项进一步验证这些结果的稳健性。EndMT相关基因所有细胞类型表达谱的主成分分析(补充表2)并在Matlab中显示结果。微阵列数据保存在GEO中，登记号：{“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSE56309”，“term_id”：“56309“}}GSE56309标准.

J.C.K.和该项目由美国国立卫生研究院（NIH）拨款K08HL111330直接支持。J.C.K.还感谢NIH R01HL130423基金会Leducq（跨大西洋卓越网络奖）的支持，并获得阿斯利康的研究支持。K.C.M.和V.d.E.由NIH T32HL007824支持。L.H.由NIH K01HL103176支持。G.P.得到NIH R01GM114434、P30ES023515、U01HL107388、U2CES026561、U2CE S026555和IBM教师奖的支持。R.H.得到了NIH R01HL117505、HL119046、HL129814、128072、P50HL112324和基金会Leducq（跨大西洋卓越网络奖）的支持。我们感谢西奈山伊坎医学院显微镜、基因组学和多尺度生物学、流式细胞术核心设施以及比较医学和外科中心的协助和技术专长。