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实验-治疗-医学。2016年4月；11(4): 1231–1238.
2016年2月16日在线发布。 数字对象标识：10.3892/等2016.3077
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白藜芦醇通过诱导超氧化物歧化酶对乙醇诱导的氧化应激的肝保护作用体内和在体外

陈伟铭,1,2,三 李-辛-肖,4 张培九（PEY-JIUM CHANG）,2 水衣洞,1,三 特生长,1,2 陈洪深,1,2 YUNG-YU HSIEH（云雨诗）,1,三和郭良伟1,三
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

本研究旨在研究白藜芦醇（RSV）对乙醇诱导的氧化应激的肝保护作用体内，并研究RSV对肝细胞发挥抗氧化作用的潜在机制。C57BL/6J小鼠分为四组：未处理对照组、乙醇处理组、RSV处理组和乙醇+RSV处理。分析血脂谱、肝脏脂质蓄积和抗氧化酶活性。以HepG2细胞为细胞模型，分析超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）和过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）在RSV介导的乙醇诱导氧化应激保护中的作用。在C57BL/6J小鼠中，乙醇导致血浆甘油三酯水平和肝脏脂质积聚显著增加（P<0.05），而RSV显著增加SOD活性。在HepG2细胞中，RSV处理的HepG2细胞中SOD活性增强，而CAT和GPx的活性不受影响。Western blot和定量聚合酶链反应分析显示RSV显著增加SOD蛋白和mRNA表达水平（P<0.05）。通过瞬时转染实验，观察到PPARγ参与RSV给药HepG2细胞中SOD基因表达的调节。总之，本研究的结果表明，RSV可能通过诱导SOD活性和基因表达，有助于保护肝细胞免受乙醇诱导的氧化应激。

关键词：抗氧化酶、乙醇、氧化应激、过氧化物酶体增殖物激活受体、白藜芦醇

介绍

白藜芦醇（RSV；3,5,4-三羟基二苯乙烯）是一种天然多酚，存在于葡萄、红酒、花生和浆果中(1,2). RSV具有抗氧化和抗炎特性，能够调节脂质代谢(三–7). 因此，富含RSV的饮食可以减轻糖尿病、心血管疾病和压力相关疾病(8–11). 肝脏是负责体内营养物质代谢的主要器官，很容易因氧化还原状态失衡而受损(12). 然而，RSV对肝脏损伤发挥有益作用的潜在机制尚不清楚。

酒精饮料在世界各地广泛消费，并与肝硬化和肝癌等许多疾病有关，这些疾病在全球造成的死亡和残疾人数与烟草相同(13). 肝脏是人体中负责酒精代谢的主要器官，酒精主要在肝细胞中代谢。已知活性氧（ROS）会导致乙醇诱导的肝脏损伤(14,15)酒精性肝损伤的一个表现是脂质积聚(16). 脂质体内平衡失调，加上活性氧的生成，促进脂肪变性、纤维化、肝硬化和肝炎等肝脏症状(17,18). RSV的抗氧化特性表明它可能是一种有前途的酒精性肝病保护剂。为了描述RSV对氧化损伤的保护作用体内本研究检测了乙醇加RSV治疗小鼠肝脏丙二醛（MDA，一种脂质过氧化产物）水平和组织病理学。

内源性抗氧化酶如超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）能够保护肝脏免受氧化损伤(19). SOD清除超氧阴离子自由基（O2•−)氧气和过氧化氢（H2O（运行）2). H（H）2O（运行）2然后可以被CAT转化为水。相比之下，GPx能够通过减少H来保护细胞免受氧化应激2O（运行）2和脂质过氧化物，使用谷胱甘肽作为电子供体(20). 本研究揭示了RSV在调节抗氧化酶活性和基因表达中的作用，这有助于氧化应激下肝细胞抗ROS的防御机制。

过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）是核受体，有助于营养基因相互作用，参与维持代谢稳态(21,22). PPAR与维甲酸-X受体结合形成异二聚体并调节其靶基因的表达，这些靶基因在其启动子区域具有PPAR反应元件（PPRE）(23). PPAR由3种亚型组成，即PPARα、PPARβ/δ和PPARγ(23). 在这些PPAR中，PPARα在肝脏中以相对较高的浓度表达，在肝脏中氧化脂肪酸并代谢脂质(24,25). PPARβ/δ参与细胞分化和表皮伤口愈合(26–28). 然而，PPARγ调节抗氧化酶基因，包括SOD(29)和CAT(30). 有人认为PPARγ可能在保护器官免受氧化应激方面发挥重要作用(31). 本研究假设RSV可能对PPAR在维持肝脏脂质稳态和执行其抗氧化特性方面发挥调节作用。

在当前的研究中，研究了RSV调节小鼠肝脏和HepG2细胞中抗氧化酶活性的能力。此外，使用荧光素酶基因5′上游的各种PPRE评估RSV对PPAR表达和报告基因转录活性的影响。

材料和方法

实验动物

32只雄性C57BL/6J小鼠（6–8周龄，18.5–20.3 g）取自国立阳明大学实验动物中心（台湾台北），随机分为四组（每组8只）。在每个笼子中饲养两只动物，并在12小时光/暗周期内保持25°C。所有实验程序均经长庚医学基金会（台湾嘉义）动物护理和使用委员会批准，并符合NIH《实验动物护理与使用指南》（国家研究委员会，1996年）(32). 四组小鼠连续28天每天经口灌胃给予以下药物：乙醇（200 mg/kg）；RSV（200 mg/kg；美国马萨诸塞州圣路易斯Sigma-Aldrich）；乙醇+RSV（每种100 mg/kg）；或蒸馏水（对照组）。RSV在无菌水中稀释。有食物和自来水随意在整个实验过程中每周记录体重。

治疗后，用一氧化碳麻醉小鼠2隔夜禁食12小时后提取血样。通过1500×g离心15分钟分离血浆，并将其储存在−35°C下进行后续生化分析。根据制造商的说明，使用商用试剂盒（德国达姆施塔特默克米利浦）分光光度法测定总胆固醇和三甘油的血浆浓度。将肝脏迅速取出，吸干，称重，冷冻在液氮中，并在−80°C下保存，直至使用。为了分析抗氧化酶活性和表达，使用Polytron均质机（型号099C-K54；Glas-Col LLC，Terre Haute，in，USA）在冰上将肝脏组织均匀化于10体积的50 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.4；Sigma-Aldrich）中。将匀浆转移到离心管中，并在4°C下在9000×g下离心20分钟。分离上清液以用于随后的抗氧化酶活性测量。

丙二醛（MDA）和肝脏脂质蓄积的测定

如前所述，通过定量硫代巴比妥酸（TBA）反应物质监测血浆MDA水平，MDA是一种氧化应激标记物(33). 简言之，将1g肝组织在10ml 1.15%KCl缓冲液（Sigma-Aldrich）中匀浆。将匀浆与1%H混合三人事军官4（Sigma-Aldrich）和0.6%TBA（Sigma-Aldrich），并在100°C下加热45分钟。将样品冷却至室温并与正丁醇（Merck Millipore）结合。在剧烈旋涡之后，将丁醇相在4000×g下离心10分钟。以1,1,3,3-四乙氧基丙烷（默克-密理博）为标准。如前所述，使用油红O（Sigma-Aldrich）染色方法评估肝脏微泡脂肪变性的组织学(34).

细胞培养、细胞活力和活性氧测定

HepG2是一种分化良好的人肝癌细胞系，常用于肝脏研究。HepG2细胞由An-Na Chiang教授提供，并在含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100µg/ml链霉素（GE Healthcare）的Dulbecco改良Eagle's培养基（HyClone；GE Health，Logan，UT，USA）中培养。在37°C和5%CO中生长24小时后2用乙醇或RSV（50、100、200或400 mM）处理细胞24 h。用3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化物（MTT）测定法（Sigma-Aldrich）评估乙醇和RSV的细胞毒性作用(35). 如前所述，使用染料2′，7′-二氯二氢荧光素二醋酸盐（分子探针；Thermo Fisher Scientific，Inc.，Waltham，MA，USA）测量HepG2细胞中的ROS水平(36). 将此还原染料以最终浓度10µM添加到细胞中。使用流式细胞仪（型号FC500；Beckman Coulter，Inc.，Brea，CA，USA）记录氧化二氯荧光素的荧光，激发波长为488 nm，发射波长为525 nm。结果表示为相对荧光强度。未经乙醇或RSV处理的ROS水平测量用作对照。

抗氧化酶活性的测定

采用羟胺还原法测定C57BL/6小鼠或HepG2细胞肝提取物中的SOD活性(37). 次黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶系统(38)用于测量羟胺被O还原2•−在550nm处进行监测。一个单位的SOD活性被记录为将羟胺还原减少50%所需的酶量。使用Aebi描述的方法分析提取物中的小鼠肝脏或HepG2细胞CAT活性(39). H的分解2O（运行）2通过监测H来分析CAT活性2O（运行）2以及240nm处吸光度的降低。一个单位的CAT活性被记录为催化1µmol H的酶的数量2O（运行）225°C时每分钟。根据耦合酶（GPx和谷胱甘肽还原酶）程序量化GPx活性(40)，测量NADPH转化为NADP时340 nm处吸光度的降低。一个单位的GPx活性记录为每分钟氧化1µmol NADPH的酶量。SOD、CAT和GPx的比活性表示为U/mg蛋白质。使用Bradford方法测定肝脏或细胞提取物的蛋白质含量（美国加利福尼亚州Hercules Bio-Rad Laboratories，Inc.）(41).

蛋白质印迹分析

用western blot分析法测定添加乙醇和/或RSV 24 h的HepG2细胞中抗氧化酶和PPAR的蛋白水平。使用含有1%Triton X-100、50 mM HEPES、6 mM EDTA、，和150 mM NaCl补充完整的蛋白酶抑制剂鸡尾酒（罗氏诊断有限公司，德国曼海姆）。对细胞裂解液进行离心，并收集上清液。使用Bradford方法（Bio-Read Laboratories，Inc.）以牛血清白蛋白为标准测定蛋白质浓度，并通过10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析等量的蛋白质（30µg），并将其转移至硝化纤维素膜（美国纽约州华盛顿港Pall公司）。免疫印迹用5%的非脂肪乳封闭，然后用以下主要抗体在4°C下孵育16–32小时：兔抗人SOD多克隆抗体（1:5000；cat.no.ab13533；Abcam，Cambridge，UK）；兔抗人CAT多克隆抗体（1:2000；CAT.no.ab16731；Abcam）；山羊抗人GPx IgG（1:1000；目录号sc-22145；Santa Cruz Biotechnology，Inc.，Dallas，TX，USA）；兔抗人PPARαIgG（1:1000；目录号sc-9000；Santa Cruz Biotechnology，Inc.）；兔抗人PPARβ/δIgG（1:1000；目录号sc-7197；Santa Cruz Biotechnology，Inc.）；山羊抗人PPARγIgG（1:1000；分类号sc-1981；Santa Cruz Biotechnology，Inc.）。洗涤阶段后，将印迹与辣根过氧化物酶偶联的第二抗体（Sigma-Aldrich）在4°C下孵育1小时，并使用Western Lightning Plus增强化学发光试剂（PerkinElmer，Inc.，Waltham，MA，USA）观察靶蛋白带。然后用β-肌动蛋白（兔抗人β-肌动蛋白多克隆抗体；cat.no.ab189073；Abcam）作为内部对照，剥离印迹进行进一步检测。使用ImageQuant软件5.0版（Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA，USA）通过密度测定法量化蛋白质条带的相对强度。

RNA提取和定量聚合酶链反应（qPCR）分析

根据制造商的说明，使用TRIzol®试剂（Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc.）从HepG2细胞中提取总RNA。使用Moloney小鼠白血病病毒逆转录酶（Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc.）逆转录总RNA（2µg）。在罗氏LightCycler系统（Roche Diagnostics GmbH）中使用合成的cDNA（1µg）作为qPCR分析的模板，使用SYBR Green Master混合物（QuantiTect SYBR Green-PCR试剂盒200；目录号204143；Qiagen，Inc.，Valencia，CA，USA）进行qPCR分析。如前所述，使用SOD、CAT和GPx基因的特异性引物（0.08µl中50µM）(42). 使用了以下引物序列：Cu/Zn-SOD正向、5′-CAGGTCCTCACTTCAATCC-3′和反向、5′-CCAAACTTCCACGCAT-3′；CAT正向，5′-CGAAGGCGAAGGTTTTG-3′和反向，5′-AGTGTCGATCCATATCC-3′；GPx正向，5′-CACAACGGTGCGGGACTA-3′和反向，5′-CATTGCGACACACTGGAC-3′；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）正向，5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′，反向，5′-GAAGATGGTGATGGTTTC-3′。使用GAPDH mRNA作为内部对照，对靶基因mRNA的表达进行比较评估。反应条件为95°C持续10分钟，然后是40个95°C循环20秒，60°C循环20s，72°C循环20min。使用Cq方法计算抗氧化酶mRNA的相对定量（比率=2−（Cq（抗氧化酶）-Cq（GAPDH）)如前所述(43).

瞬时转染分析

用An-Na Chiang教授实验室构建的0.2µg tk-PPREx-Luc报告质粒和0.2µgPPARα（pGShPPARα）、PPARβ（pCMX-hPPARβ/δ）或PPARγ（pCMX-hPPARγ）表达载体瞬时转染HepG2细胞。对于每次转染，内部控制载体pCMV-β-gal也被联合转染。荧光素酶分析使用光度计（EG&G Berthold；Berthold Technologies USA LLC，Oak Ridge，TN，USA）进行测量，并根据β-半乳糖苷酶的活性进行标准化(44).

统计分析

数据表示为平均值±标准误差。每个实验至少重复三次。使用Student t检验对两组进行统计分析。采用一元方差分析结合Tukey多重比较检验评价四组间差异的统计学意义。使用SPSS软件17.0版（美国伊利诺伊州芝加哥SPSS公司）进行统计分析。P<0.05被认为表明存在统计学上的显著差异。

结果

乙醇和RSV对血脂及肝脏抗氧化酶活性的影响

与对照组小鼠相比，各组小鼠的体重和血浆胆固醇水平没有显著差异(表一). 然而，与对照小鼠相比，乙醇处理小鼠的血浆甘油三酯和MDA水平分别高75.3%和56.1%(表一). 经过28天的治疗，RSV组小鼠的SOD活性增加了79.5%；然而，在乙醇组和乙醇+RSV组中未观察到任何变化。此外，与对照组相比，乙醇和RSV对C57BL/6小鼠肝脏中CAT和GPx活性没有显著影响。此外，用乙醇治疗的小鼠肝脏中的脂质蓄积显著增加，用乙醇+RSV治疗的小鼠中脂质蓄积适度增加，而用RSV治疗后脂质蓄积保持不变(图1).

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用油红O染色的（A）对照组、（B）乙醇组、（C）白藜芦醇组和（D）乙醇+白藜芦醇组的小鼠肝组织的代表性显微照片（放大倍数，x200）。

表一。

乙醇和白藜芦醇对血脂和肝脏抗氧化酶活性的影响体内.

参数控制乙醇白藜芦醇乙醇+白藜芦醇
体重，g25.5±0.6826.1±0.5826.3±0.8325.9±0.66
血脂
总胆固醇，mg/dl96.4±10.3130±14.6121±12.8129±14.9
甘油三酯，mg/dl81.0±10.8142±13.4一103±12.7122±15.4
丙二醛，nmol/l254±30.4396±37.5一297±27.2333±41.2
肝脏抗氧化酶
超氧化物歧化酶，U/mg15.1±1.518.7±2.227.1±3.1一22.6±2.8
过氧化氢酶，U/mg42.1±4.845.4±5.047.8±4.746.5±3.9
谷胱甘肽过氧化物酶，mU/mg34.3±4.339.5±4.137.1±4.038.9±4.4

结果显示为四个独立实验的平均值±标准误差。

一与对照组相比，P<0.05。

乙醇和RSV对细胞活力和ROS生成的影响

MTT法在暴露于乙醇、呼吸道合胞病毒或乙醇+呼吸道合胞病毒的HepG2细胞中未检测到细胞活力的显著变化(图2A). 相比之下，乙醇处理似乎以剂量依赖的方式提高了活性氧的生成(图2B). 然而，在乙醇+RSV组中，ROS生成没有显著变化。这表明RSV能够从乙醇诱导的ROS生成中清除ROS。

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乙醇和白藜芦醇对细胞活力和ROS生成的影响。（A） 用50、100、200和400 mM乙醇、白藜芦醇和乙醇加白藜芦醇处理HepG2细胞24小时。用MTT法评估白藜芦》对细胞活力的影响。所有值均表示为控制组的百分比，设置为100%。（B） 通过将2′，7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯转化为2′，7'-二氯二氢荧光素来测定活性氧的产生。结果表示为与对照组相比的相对荧光强度，设置为1。数据以平均值±标准误差（n=3-5）*P<0.05表示，与对照组相比。活性氧。

乙醇和RSV对HepG2细胞抗氧化酶活性和表达的影响

为了评估抗氧化酶是否参与RSV介导的氧化应激保护，测定了HepG2细胞中SOD、CAT和GPx的活性。如所示图3与对照组相比，接触RSV的细胞SOD活性显著升高（P<0.05），而CAT和GPx的活性不受乙醇或RSV处理的影响。SOD、CAT和GPx蛋白的表达水平(图4A-C)和mRNA(图4D–F)western blot和qPCR检测HepG2细胞中的表达。与对照细胞相比，RSV组SOD蛋白和mRNA的表达水平分别高1.9倍和1.95倍。与对照组相比，三个实验组中CAT和GPx的表达没有变化。

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C、E和RSV对抗氧化酶活性的影响。分析了（A）SOD、（B）CAT和（C）GPx的酶活性。结果代表了四种不同的分析。数据表示为平均值±标准误差*与对照组相比，P<0.05。C、 控制；E、 乙醇；RSV，白藜芦醇；超氧化物歧化酶；过氧化氢酶；谷胱甘肽过氧化物酶。

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E和RSV对抗氧化酶mRNA和蛋白表达的影响。分析（A）SOD、（B）CAT和（C）GPx的Western blot和定量蛋白表达水平，以及（D）SOD，（E）CAT及（F）GPx mRNA水平。结果显示为四个实验的平均±标准误差*与对照组相比P＜0.05。C、 控制；E、 乙醇；RSV，白藜芦醇；超氧化物歧化酶；过氧化氢酶；谷胱甘肽过氧化物酶。

乙醇和RSV对PPAR蛋白反式激活活性的影响

为了确定RSV诱导SOD基因表达的机制，测定了PPAR在HepG2细胞中的表达和反式激活活性。乙醇和/或RSV处理的细胞中PPARα、PPARβ和PPARγ蛋白表达不受影响(图5A和B). 然而，用tk-PPREγ-Luc报告子结构和pCMX-hPPARγ转染RSV处理的HepG2细胞，与未处理的对照细胞相比，启动子活性增加了2.1倍(图5C). 单独使用200 mM乙醇或100 mM乙醇+100 mM RSV处理HepG2细胞对PPAR反式激活没有任何显著影响。

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E和RSV对PPAR表达和活性的影响。（A） 通过对添加乙醇和/或RSV 24 h的HepG2细胞的核提取物进行western blot分析，测定PPARα、PPARβ/δ和PPARγ的相对蛋白表达水平。数据表示为平均值±标准误差（n=4）。（C） PPARα、PPARβ/δ和PPARγ的转录活性分别通过使用带有PPRE-luc的HepG2细胞和pGSH-PPARα，pCMX-hPPARβ-δ或pCMX-h PPARγ质粒的转染实验进行评估。结果显示为通过将归一化荧光素酶活性与报告载体PPRE-luc分开而获得的相对荧光素酶活性*与对照细胞相比，P＜0.05（n＝4）。增殖物激活受体；C、 控制；E、 乙醇；RSV，白藜芦醇。

讨论

酒精饮料通常在啤酒中约4.5%乙醇（900 mM）和葡萄酒中约12%乙醇（2 M）之间(45). 大量摄入的乙醇通过门静脉循环至肝脏，并在肝细胞中造成氧化应激和脂质积聚状态(14,46). 在本研究中，乙醇处理小鼠的血浆甘油三酯水平和MDA生成增加，表明乙醇导致脂质代谢紊乱并增加脂质过氧化体内油红O染色证实RSV减弱了乙醇诱导的肝脏脂质积聚，这可能是乙醇对肝脏损伤的原因或影响。与乙醇处理组相比，乙醇+RSV组肝脏中的脂质积累较低。

氧化还原状态的失衡可能导致广泛的健康并发症和各种病理生理综合征(47). 乙醇诱导的氧化应激导致酒精中毒患者肝损伤(47). RSV是一种广泛使用的营养成分，具有多种生物功能，包括抗氧化作用(10). 先前的研究表明，RSV通过抑制巨噬细胞中ROS的生成来抑制泡沫细胞的形成(48). 本研究旨在确定RSV是否能够预防乙醇诱导的肝细胞氧化应激。

由SOD、CAT和GPx等抗氧化酶组成的内源性抗氧化系统负责保护机体免受自由基损伤体内(49). 本研究结果表明，呼吸道合胞病毒对乙醇诱导的肝损伤的保护作用是由于其能够诱导肝脏SOD活性。Kasdallah Grissa之前的一项研究表明了这一点等(50)据who报道，乙醇处理大鼠的SOD、CAT和GPx的肝脏活性受到抑制，而RSV的治疗可以逆转这种抑制。在当前的研究中，以HepG2细胞为肝细胞模型，研究了RSV对氧化应激的保护作用的机制。结果表明，乙醇以剂量依赖的方式增强活性氧，RSV通过抑制活性氧的生成来保护细胞免受氧化损伤。此外，在本研究中，与对照组相比，RSV给药可增强SOD的活性和表达。

此前，已观察到RSV可选择性激活神经细胞和脂肪细胞中的PPAR(51,52). 已知SOD基因是PPARγ靶基因(29). 本研究假设RSV通过激活PPAR激活肝脏SOD基因表达。采用western blot分析和荧光素酶分析研究RSV对PPAR表达及其转录激活的影响。观察到RSV显著上调PPARγ活性；然而，其基本机制仍有待阐明。

总之，本研究表明RSV在减轻乙醇诱导的肝脏氧化应激中起着重要作用体内和在体外这种保护作用可能是由于抑制脂质过氧化和积累以及激活SOD基因表达所致。此外，可能提示PPARγ激活参与RSV增强SOD基因调控。当前研究的结果确定了RSV保护作用的新机制，并为预防乙醇诱导的肝损伤和肝病提供了新的见解。

致谢

本研究得到台湾长庚医学基金会（批准号CMRP:G6A0311）的支持。作者感谢An-Na Chiang教授（台湾台北国立杨明大学生物化学与分子生物学研究所）提供HepG2细胞和技术援助。

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