病毒和宿主机制支持膜渗透和细胞进入

摘要

简介

病毒在蛋白质外壳中含有核酸基因组，有时还含有脂膜和糖。它们通过与宿主附着因子和受体的相互作用进入细胞(20). 包膜病毒通过将其脂质膜与宿主膜（在大多数情况下是内体膜）融合，将其基因组输送到细胞质或细胞核中(1). 非包膜病毒要么直接穿透宿主膜，要么将含有基因组的亚病毒颗粒送入胞浆(2). 包膜病毒和非包膜病毒都会掩盖其膜穿透肽，通常位于病毒膜的糖蛋白、外壳内或病毒管腔内。穿膜肽被进入病毒时作用于病毒的细胞线索揭开(20). 控制病毒进入的细胞线索包括受体、酶和化学物质，如蛋白酶、金属离子和还原剂(2). 最近，人们观察到由运动蛋白或病毒成熟介导的机械过程可以控制病毒的进入。

力学被认为是物理学的一个分支，研究力对材料的作用。在生物学中，细胞可以感知、产生和承受机械力，并在机械转导过程中将其转换为特定的反应，例如(三). 与细胞或细胞器不同的是，它们会对外力作出反应，并调整刚度以抵抗张力，病毒通常不会在生物力作用下调整其机械性能，而是会断裂或破裂。这种“惯性”为病毒提供了利用机械事件打开衣壳并释放病毒基因组以在进入细胞期间进行转录激活的机会。本Gem重点介绍了细胞信号如何调节病毒的物理特性，以及这如何影响病毒进入细胞和感染性。

病毒力学是感染的关键

病毒颗粒（病毒粒子）保护病毒核酸，并在宿主提示下释放病毒核酸。它们可以打破惯性，因为它们是亚稳态的。亚稳定性允许稳定的病毒粒子在受到干扰时改变其构象。干扰可通过加热、加压、辐射或化学物质的作用，或通过抗病毒免疫，导致传染性丧失。病毒颗粒也会受到来自宿主的线索的干扰，从而获得进入细胞的功能(20)。

此外，病毒利用内部基因组压力破坏衣壳的稳定性。噬菌体，如噬菌体λ，在封装基因组的大小和基因组脱膜的温度之间显示出负相关在体外(4). 同样，用原子力显微镜（AFM）测量腺病毒（一种非包膜真核DNA病毒和临床上广泛使用的载体），为内部衣壳压力约为30 atm提供了证据(5). 来自水合DNA的这种内部压力的性质主要是熵的，部分是静电的。在程度上与疱疹病毒衣壳的喷射压力相似(6)。

内部衣壳压力不仅有助于从顶点弹出戊糖基蛋白并最终从衣壳中释放基因组，还可以增强衣壳抵抗外部变形力，如AFM对噬菌体λ的实验所示（参考文献4以及其中的参考）。有趣的是，二十面体病毒衣壳的刚度是各向异性增强的：例如，在5倍的对称轴上强制力最小，在2倍的对称轴线上强制力最强。因此，围绕腺病毒5倍对称轴的戊子区的弹性特性受到宿主因子的调节，如整合素和防御素，它们在病毒在细胞内的分解中起着重要作用(7,8). 这一证据突出了衣壳力学的重要性以及宿主相互作用如何调节病毒力学。

此外，压力依赖性生物功能的概念在几个方面适用于腺病毒(图1A). 成熟腺病毒的硬度比不成熟病毒大20%左右，表明成熟病毒的内部压力大于不成熟病毒的压力(5,9). 使用AFM进行的病毒破坏实验证实了这一点，其中成熟核心（即病毒DNA-蛋白复合物）扩散到更大的区域，并且在破坏后，荧光DNA-结合染料比未成熟核心更容易接近(10). 因此，蛋白水解酶病毒成熟过程中的加压会破坏病毒粒子的稳定性，并使其进入亚稳态，在亚稳态中，破坏的低活化能屏障促进了戊糖碱的释放，暴露了水解蛋白VI，最终导致基因组的释放。这种情况很可能解释了为什么未成熟病毒TS1在进入柯萨奇病毒腺病毒受体（CAR）和整合素依赖途径（如野生型病毒）的细胞时脱膜缺陷，但与野生型病毒不同的是，它不脱纤维，不暴露膜裂解蛋白VI，不能穿透内胚层(7). 所有这些数据表明，病毒加压是噬菌体和当今人类病毒中一种进化上保守的机制。特别是，病毒粒子的物理特性有助于宿主线索触发的感染性脱膜，并为治疗干预提供了新的可能性。

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图1

病毒和宿主机制对病毒进入细胞的影响的示意图。（A） 腺病毒子代组装期间的蛋白质分解成熟增加了内部压力，同时也增加了衣壳外壳（上部面板）的硬度。（下面板）甲型流感病毒在进入期间的酸暴露，例如，导致质子通过基质蛋白2（M2）通道流入病毒粒子，并通过增强内部蛋白质的重排降低病毒硬度，包括M1和由病毒RNA和核蛋白（NP）组成的病毒核糖核蛋白颗粒（vRNP）。（B） Acto-myosin介导的腺病毒与柯萨奇病毒腺病毒受体（CAR）结合的漂移运动和细胞表面整合素对病毒的限制导致病毒纤维脱落，这是病毒拆卸程序中的第一步。（C） 传入的（无纤维）腺病毒通过主要衣壳蛋白己糖与核孔复合体（NPC）蛋白Nup214结合。微管依赖性运动驱动蛋白-1（Kif5C重链）通过其轻链Klc1/2与蛋白质IX（IX）的结合连接到衣壳。马达的激活发生在与Nup358结合的重链上，并通过微管上的位移引发衣壳破裂，微管可能被栓系在Nup359的远端结构域。同时，衣壳蛋白的破坏将Nup62从NPC的中央通道结构中移除（但不包括核篮的Nup153），病毒DNA被导入细胞核。

感染病毒在宿主提示下的力学特性变化

流感病毒通过酸性内体，这是脱衣和感染的关键步骤(1,20). 在低氢条件下，质子通过病毒离子通道M2进入病毒腔，并通过诱导M1的构象变化将病毒核糖核蛋白核心（vRNP）从M1蛋白中分离出来(图1A). 这与观察结果一致，即M1蛋白在病毒粒子中具有多种功能，并以带状或卷曲结构出现。质子流入病毒管腔后软化病毒包膜，很可能是通过将vRNP从包膜内侧分离出来(11,12). 通过原子力显微镜对天然病毒粒子和缺乏病毒糖蛋白的“秃头”粒子进行测量，获得了这一概念的证据。后一结果表明，在低H条件下，低H诱导的病毒糖蛋白变化不会显著促进包膜软化。

病毒和宿主机械控制膜破裂和基因组脱膜

根据腺病毒和流感病毒的细胞生物感染研究，除了病毒的机制外，宿主的机制也与病毒进入有关。一系列研究，包括高时空分辨率的单病毒追踪、光漂白后的荧光恢复、免疫学分析、药物干扰、电子显微镜和病毒重定位，都表明腺病毒暴露于细胞表面的机械线索下(7). 在病毒与细胞相互作用的最初几秒钟内，病毒与受体CAR结合并随机运动(图1B). 然后，它参与肌动蛋白介导的缓慢漂移运动（<0.1μm/s），持续数微米而无明显中断。病毒缓慢漂移被停滞或短时间的随机运动打断。病毒的机械信号来自CAR的缓慢漂移和第二个病毒受体整合素的停滞运动。这些线索被认为是直接传递给病毒颗粒并导致机械应力，从而在细胞表面启动逐步的病毒包被程序。例如，对缓慢漂移的药理学干扰阻止了病毒纤维的释放和膜裂解蛋白VI从病毒内部的暴露，尤其是在病毒被吞噬到内体之前。

蛋白VI在质膜上的暴露可能有几种影响。一种是蛋白质VI与磷脂结合，另一种是它破坏膜。最近的一项研究发现有证据表明，来自传入腺病毒的质膜上的蛋白VI暴露会导致小的膜损伤(13). 细胞不可耐受染料碘化丙啶（PI）证明了质膜穿孔，并且它依赖于蛋白VI，如使用突变腺病毒所示。当PI与核酸（如细胞核中的DNA或细胞质中的RNA）结合时，它会发出荧光。流式细胞仪的群体测量和共焦显微镜的单细胞/单病变分析均表明，蛋白质VI的暴露导致PI进入胞浆的摄取增加。这发生在病毒加入细胞后的几分钟内，单个损伤通常持续10到20秒。有趣的是，一个细胞可以有多个质膜损伤，只要细胞表面存在病毒，这些损伤就会重复发生。这些实验还显示，与PI内流相一致，需要细胞外钙的胞浆游离钙离子浓度瞬时增加。总之，这些观察结果表明，传入的腺病毒会引起质膜的短暂损伤。

质膜完整性受损严重威胁细胞生存。真核细胞已经进化出多种修复机制来恢复膜的完整性。例如，承受重机械负荷的肌肉细胞通过分泌一组特殊的溶酶体，即所谓的分泌溶酶体（参考文献综述14). 这些酸性细胞器通常位于细胞外围。它们与受损的质膜融合，这取决于胞浆中的钙离子。

一系列生化和遗传学实验表明，接种腺病毒的细胞会触发酸性溶酶体的分泌，并在几分钟内释放出脂质水解酶酸性鞘磷脂酶（ASMase）(13). ASMase催化鞘磷脂分解为神经酰胺和磷酰胆碱，其在细胞中的缺失与溶酶体储存障碍有关，如尼曼-匹克病。它在pH值5时具有最佳活性，但在pH值7时也具有相当大的活性。感染细胞的高分辨率脂质组学分析表明，传入的腺病毒会触发依赖ASMase活性的神经酰胺脂质种类的快速选择性增加。神经酰胺是一种缺乏大亲水性头部基团的锥形信号脂质，可能增强膜修复。然而，神经酰胺也能增强蛋白质VI与合成或细胞衍生脂质体的相互作用，并促进脂质体的破坏。进一步体内实验表明，神经酰胺可加速腺病毒的内吞作用，并促进腺病毒从内体渗透到胞浆。

总之，这些数据为腺病毒感染中的两步膜渗透过程提供了有力证据。第一步由病毒和细胞的机械特性控制。高内部压力会使成熟腺病毒变硬并为脱膜做好准备。它使病毒能够接受细胞表面的机械信号，这些信号来自于病毒受体的运动和限制。该病毒暴露其膜裂解蛋白并触发涉及溶酶体分泌ASMase的膜修复过程。第二步提高质膜中神经酰胺的水平，并随着病毒内吞作用而逐渐增加膜损伤。据认为，这是由于含有病毒的内体中神经酰胺的富集所致。无论如何，神经酰胺信号促进病毒从早期内体渗透到胞浆。现在有兴趣探索破碎的内体是否代表细胞的一类新的危险信号。例如，这些内体是由受感染细胞修复、分泌的，还是被自噬体中和的？看看其他非包膜病毒是否利用膜修复过程进行感染，以及破膜是否产生前病毒或抗病毒信号，也将是一件有趣的事情。

腺病毒和流感病毒宿主机械控制基因组脱膜

许多病毒，包括腺病毒，感染有丝分裂后的细胞并在细胞核中复制。腺病毒将其线性DNA基因组，而不是病毒衣壳，沉积在细胞核中，正如最近以单分子分辨率点击化学标记的传入病毒基因组所证明的那样(15). 该病毒使用分子运动蛋白-1从衣壳中分离基因组(16). 这发生在核孔复合体（NPC）的细胞质表面，在那里主要病毒衣壳蛋白与核穿孔蛋白Nup214对接。驱动蛋白相关轻链1、2与另一种病毒衣壳蛋白（蛋白IX）结合，重链中的运动域通过与细胞质孔复合体丝的Nup358结合而被激活。微管位于核孔复合体的近端，因为它们在Nup358的远端域有一个结合位点。这种由病毒、两个Nup和两个运动成分组成的五元复合物随后执行病毒的破坏，巧合的是，部分也执行核孔复合物。病毒DNA（可能与病毒蛋白VII形成复合物）随后在细胞转运因子（如导入蛋白和转运蛋白）的协助下导入细胞核。然而，病毒DNA的核导入过程并不完全准确，传入病毒DNA的可变部分错误地传递到细胞质(17). 这就提出了细胞溶质病毒DNA的先天免疫识别和可能的病毒拮抗作用的问题。

除腺病毒外，流感病毒基因组的脱膜还依赖于细胞运动蛋白，在这种情况下是动力蛋白和肌球蛋白(18). 在内体的低pH条件下，流感病毒改变了血凝素糖蛋白的构象，导致疏水性融合肽的暴露以及病毒膜与限制性内体膜的融合。细胞溶质RNP通过模拟攻击性形成和清除的过程从膜融合部位分离。这涉及组蛋白去乙酰化酶6（HDAC6）的非锚定泛素结合域（ZnF-UBP）和动力蛋白结合域，以及微管和肌动蛋白马达(18). 例如，鉴于内胚体腔室中的离子环境受调控状态的影响，但早期内胚体不含高浓度的钾离子和低浓度的钠离子，可以预见，其他线索会作用于内胚体病毒。事实上，晚期内体中的高浓度钾离子和低pH值在融合前很长一段时间内促使了甲型流感病毒分离vRNP(19)。

结论与展望

本文试图将单个病毒颗粒的物理特性与宿主细胞的机械或化学线索结合起来。物理和结构病毒学将继续阐明单个病毒颗粒的新颖和令人兴奋的特征，并表明它们对感染、病毒传播或接种病毒疾病很重要。然而，只有将物理和结构特征整合到细胞或免疫机制中，这些特征的全部力量和重要性才会显现出来。这种方法考虑了病毒在进化过程中被选择的环境。此外，重要的是要记住，病毒是由一群粒子和遗传元素组成的，单个病毒粒子很少能感染单个细胞。更常见的是，病毒颗粒在感染期间相互合作或竞争。这一概念催生了病原体共同感染的新兴领域：例如，病毒-病毒和病毒-细菌共同感染。

致谢

资金报表

医疗研发项目VirX（SystemsX.ch，由瑞士国家科学基金会评估）向Urs F.Greber提供资金。

参考文献