通过酸性pH和高K逐步启动⁺甲型流感病毒穿透后需要浓度才能有效揭开病毒核心

病毒生长和准备。

纯化的甲型流感病毒株X31（H3N2）由Virapur生产。简单地说，为了生产X31，接种了60个鸡蛋，并在33至37°C的温度下孵育了2天。收集尿囊液并通过低速离心进行澄清，然后通过高速离心步骤浓缩病毒。为了获得更高的纯度，X31使用10到40%蔗糖梯度进一步进行两次超速离心。收集、汇集病毒带并在配方缓冲液中稀释（40%蔗糖、0.02%牛血清白蛋白[BSA]、20 mM HEPES、pH 7.4、100 mM NaCl、2 mM MgCl₂). IAV的WSN毒株（A/WSN/1933[H1N1]）的库存如前所述准备(7). 简单地说，MDBK细胞在滚筒瓶中生长，当细胞90%融合时，每细胞感染0.01 PFU。在感染后36至40小时（p.i.）或60至80%的细胞出现细胞病变时收集细胞上清液。在4°C的Beckman SW32 Ti转子中以28000 rpm的速度将预分离上清液造粒90 min，然后将颗粒重新悬浮在MNT缓冲液中（20 mM MES[2-4-吗啉乙磺酸]、100 mM NaCl、30 mM Tris），然后进行超声波处理10 s。然后将溶解的颗粒加载到由6.5 ml 30%（wt/vol）蔗糖和3 ml 60%（wt/vol）蔗糖组成的不连续梯度上，并在4°C的Beckman SW41转子中以24000 rpm离心90 min。从梯度界面收集病毒带并进行鉴定。将纯化的X31和WSN冷冻并储存在−80°C下，直至使用。

抗体、化学品和试剂。

生产IAV M1（HB-64）和NP（HB-55）特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞系购自ATCC。先前已经描述过针对HA后酸性形式的A1抗体和抗X31兔多克隆抗体（Pinda）(42,43). 从ViroStat中获得抗-IAV M1（山羊）。小鼠抗UUKV核蛋白抗体8B11A3是瑞典斯德哥尔摩路德维希癌症研究所赠送的礼物。NuPAGE十二烷基硫酸锂（LDS）样品缓冲液，罗丹明B氯化物（R18），3,3′-二十八烷基-5,5′-二（4-磺苯基）羰基碳菁，钠盐（SP-DiOC₁₈)从Invitrogen购买Alexa Fluor（AF）标记的表皮生长因子（EGF）、小麦胚芽凝集素（WGA）、卵磷脂和AF结合的二级抗体。细胞核用DRAQ5（Biostatus Ltd.）或Hoechst（Molecular Probes）染色。巴非霉素A1（BafA）、环己酰亚胺（CHX）、诺卡唑、羰基氰化物米-氯苯腙（CCCP）、金刚烷胺、缬霉素、聚-我-从Sigma-Aldrich中获得赖氨酸、苯甲烷磺酰氟（PMSF）、测序级改性胰蛋白酶、蛋白酶K（PK）和甲醛（FA）溶液（36%）。Asante钾绿3（APG3）盐来自Teflabs。不含EDTA的蛋白酶抑制剂鸡尾酒片剂购自罗氏公司。

薄型EM。

对于薄片电子显微镜（EM），A549细胞生长在盖玻片上。将病毒在冰上与预冷细胞结合1小时，直接固定（2.5%戊二醛，pH 7.2的0.05M二甲酰二钠，50mM KCl，1.25mM MgCl₂1.25 mM氯化钙₂)30分钟或在37°C的融合培养基（DMEM，50 mM柠檬酸缓冲液，pH 5.0）中培养60至90秒，并立即固定。样品在室温（RT）下在2%OsO中培养1小时₄然后在4°C下用0.5%乙酸铀酰孵育过夜。如前所述进行脱水、包埋和薄片切割(44). 将包埋样品切成50至60nm的薄片。

启动缓冲区。

基于DMEM的pH和阳离子（高Na⁺，K⁺，Cs⁺、和Li⁺)在实验的同一天，使用以下缓冲剂在37°C下调整缓冲液：20 mM HEPES（pH 7.4）、30 mM MES（pH 6.5至5.6）和50 mM柠檬酸缓冲液（来自1 M柠檬酸和柠檬酸钠）（pH 5.4至5.0）。然后用HCl或NaOH对缓冲液进行微调。在无DMEM缓冲液的情况下，通过添加NaCl或KCl达到所需的盐浓度。在高浓度（120 mM）Cs的情况下⁺，李⁺、和K⁺缓冲液，5 mM Na⁺已添加。高浓度Na⁺，Cs⁺、和Li⁺缓冲液进一步补充5 mM KCl。由于pH 5.8缓冲液是用NaOH调节的，因此额外的5 mM Na⁺存在于这些解决方案中。

基于FACS的X31融合分析。

IAV标记有R18和自猝灭浓度的SP-DiOC₁₈，如前所述(45). 简言之，将纯化的IAV在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中稀释至最终浓度0.1 mg/ml，并在RT下与R18（最终浓度，0.4μM）和SP-DiOC孵育1 h₁₈（最终浓度，0.2μM），同时轻轻摇晃混合物。为了去除未结合的染料，病毒颗粒通过0.22μm孔径过滤器（密理博）过滤，并在每次实验中新鲜使用。为了测量标记的X31在质膜（PM）上的酸诱导融合，用EDTA溶液（PBS中0.53 mM EDTA，pH 8.0）分离A549细胞，并用感染介质清洗，在冷感染介质中稀释的病毒在冰上与细胞结合1h。取出病毒接种物，用冷感染培养基清洗细胞一次。使用调整至指示pH值的基于DMEM的pH缓冲液溶解颗粒，在37°C下培养2分钟，并在室温下通过添加等体积的8%FA 20分钟直接固定。样品在荧光活化细胞分选（FACS）缓冲液（PBS，0.2%FCS，5 mM EDTA）中清洗并重新悬浮。SP-DiOC的量₁₈使用FACSCanto II流式细胞仪系统测量脂质混合后释放的荧光。每个条件下共有10000个细胞被计数，并使用FlowJo软件对数据进行分析。

X31融合动力学。

对于融合动力学实验，在轻摇混合物的同时，在室温下用最终浓度为0.42μM的R18标记PBS中稀释的X31 1 1 h。通过0.22-μm孔径过滤器过滤去除多余的染料。将标记的病毒与EDTA分离并在冰上预冷的细胞结合1小时，然后用PBS洗涤步骤以去除未结合的病毒。将带有结合病毒粒子的细胞颗粒重新悬浮在100μl PBS中，然后将其添加到900μl预热的PBS中的1.5 ml荧光试管中（119.004-QS；Hellma）。为了平衡，样品在37°C下保持1分钟，然后通过添加100μl MES（0.063至1 M）将pH降低至所需值（pH 6.5至5.0）来开始融合。使用Cary Eclipse荧光分光光度计（Varian）随时间测量低pH诱导的R18去猝灭，激发波长为560±5nm，检测波长为590±5nm。通过添加0.1%（最终浓度）Triton X-100终止熔合反应，释放出最大脱淬能力。融合诱导R18去猝灭的百分比归一化为0.1%Triton X-100存在下测得的荧光。

感染分析。

如前所述，本研究中的所有感染检测均在接种在96周基质板（Greiner Bio-One）上的A549细胞中进行，并应用自动成像和感染评分程序(46). 细胞感染IAV（X31，WSN[wt]，或WSN[AS]），IAV在感染介质（DMEM，0.2%BSA，50 mM HEPES，pH 6.8）中稀释，病毒浓度可导致20%感染，并固定在4%FA中的10 h p.i.中。细胞在渗透缓冲液（0.1%皂苷，1%BSA，10%FCS in PBS）中培养20 min，RT，然后用小鼠单克隆抗IAV NP（HB-65，1:100）作为一级抗体，用AF488标记的抗小鼠抗体作为二级抗体进行间接免疫荧光。通过Hoechst（1:5000）染色观察细胞核。对于每个孔，使用×10物镜，用落射荧光显微镜（MD Assay Development 2[MD2]；Molecular Devices）自动采集9（3×3）个图像。病毒蛋白阳性细胞与细胞总数的比率是通过使用基于MATLAB（The MathWorks，Inc.）的感染计数器软件来确定的(47). 在每个实验中，对超过1000个细胞进行量化。对于SFV、VSV和UUKV，按照相同的方案进行实验，但SFV感染是用添加0.2%BSA的RPMI进行的，20 mM HEPES调节到pH 7.2。如前所述，SFV和VSV感染的细胞在p.i.5 h固定，UUKV感染细胞在p.i 19 h固定。根据绿色荧光蛋白（GFP）的表达检测SFV和VSV感染，UUKV感染通过免疫染色检测(48).

酸性旁路分析。

病毒（感染多重性[MOI]为～5）在冰上与预冷A549细胞结合1小时，然后在冷感染培养基中进行一个清洗步骤，并在37°C下使用温度为5.0（IAV、UUKV、VSV）和5.2（SFV）的热融合培养基（DMEM、50 mM柠檬酸缓冲液）进行2分钟脉冲。在37°C的温度下，用温停培养基（DMEM、50 mM HEPES、20 mM NH）将酸旁通对照样品培养2分钟₄氯，pH 7.4）。立即将细胞移回冰上，用冷感染培养基清洗两次，并在37°C的停止培养基中培养，以阻止内体酸化，从而阻止IAV通过内吞作用进一步进入。在14h p.i.时，用4%的FA在RT下固定细胞20分钟。使用多通道移液管在96 well Matrix板上进行实验，确保在一个实验中测试的所有条件下，酸诱导病毒融合的起始和终止的准确时间。在金刚烷胺的实验中，病毒与100μM药物预先孵育（在双蒸馏H中稀释₂O[日H₂O] ），在酸旁路前在RT下持续5分钟。同样，在酸旁路之前，用CCCP（70 nM，在DMSO中稀释）和缬氨霉素（2.5μg/ml，在DMISO中稀释）预培养病毒5分钟。将单个试剂或这些试剂的组合进一步添加到融合培养基中，但在随后的停止培养基培养中省略。有关金刚烷胺、CCCP和缬氨霉素序贯治疗的详细信息，请参见相应的图例。当缬氨霉素与预酸化结合时，根据制造商的协议（Millipore），使用Amicon Ultra-0.5离心过滤器（100-kDa截止）清洗离子载体。

国际原子能机构在体外启动注水。

在所有启动试验中，向较大体积的pH缓冲液中添加少量纯化IAV。这里，病毒/pH缓冲液的体积比保持在>1:20，以避免病毒添加后pH值的波动。在37°C下对病毒进行预处理，然后在冰上进行短时间培养，然后与预冷A549细胞结合，并进行酸过测试。通过添加1 M HEPES（pH 9.5）实现pH缓冲液的中和。通过滴定实验当天使用的每个新鲜pH值或阳离子缓冲液，确定达到pH值7.4所需的体积。如果使用不同的阳离子缓冲液进行预处理，在体外-在冷感染培养基中稀释引物病毒，使pH值平衡，最终产生K⁺浓度为10 mM，然后继续进行酸旁路方案。

体外X31 HA酸化。

病毒颗粒在各自的启动缓冲液中在37°C下处理60分钟，同时病毒颗粒与玻璃盖玻片结合。样品在室温下立即用4%FA固定20分钟，并在渗透缓冲液中培养。使用针对HA酸形式的单克隆（小鼠）抗体（A1，1:1000）和针对X31的多克隆（兔）抗体（Pinda，1:10000）进行间接免疫荧光。图像通过共聚焦显微镜（LSM-Meta；Zeiss）和×100物镜获得。通常情况下，每种情况总共统计了1000到1500个病毒粒子，并使用定制的基于MATLAB的软件对共定位百分比进行了量化。带有酸化HA的病毒粒子的百分比由A1阳性/Pinda阳性粒子的比率确定。

IAV与细胞表面结合。

A549细胞生长在玻璃盖玻片上。病毒在冰上与预冷细胞结合1小时，用冷PBS广泛清洗，然后立即用4%FA在RT固定20分钟。细胞在RT用WGA-AF594（1:250）染色30分钟，在RT用封闭溶液（1%BSA，PBS中的10%FCS）培养30分钟，并用抗X31（Pinda，1:10000）进行间接免疫荧光抗体和DRAQ5（1:1000）以可视化细胞核。使用×100物镜通过共聚焦显微镜获得每个条件下约100个细胞的Z堆叠，并使用ImageJ软件分析最大Z堆叠投影。为了去除背景信号，在每个实验中都设置了Pinda信号的阈值。使用ImageJ的斑点检测功能对信号高于此阈值的斑点进行计数。WGA染色作为细胞总面积的标记。最后，计算每个细胞面积的结合粒子数。

酸旁路后M1和NP暴露（脱涂层）。

A549细胞接种在聚乙烯上-我-赖氨酸涂层96周基质板以增加细胞附着。为了检测酸诱导融合后释放的X31 M1和NP，使用了高MOI（～300），并应用了标准酸旁路协议。在5分钟（M1）和30分钟（NP）时固定细胞。将CHX（1 mM）添加到终止培养基中，以防止合成新的病毒蛋白。样品在RT下在渗透缓冲液中培养20分钟，并用抗M1（HB-64，1:250）和抗NP（HB-6，1:10）进行免疫荧光染色。使用×100物镜通过共焦显微镜获得代表性图像。为了量化，使用MD2显微镜和20倍物镜采集每个孔的16（4×4）张图像。在每个实验中，使用ImageJ对约1000个细胞的特定脱膜信号进行量化。首先，在每个实验中设置M1和NP的阈值。其次，确定高于此阈值的信号的总面积。最后，将该值除以细胞数，并将该值归一化为对照样品的值。

M1和NP的免疫荧光共染色。

A549细胞在聚乙烯上生长-我-赖氨酸涂层玻璃盖玻片。如上所述，细胞接受酸旁路方案（MOI，～300）。为了在酸旁路后检测M1和NP，细胞在室温下用0.1%Triton X-100在PBS中渗透20分钟，在室温下在封闭溶液中培养30分钟。样品用抗M1（山羊，1:500）和抗NP（1:10）的一级抗体染色，然后用卵磷脂-AF647和二级抗体驴抗羊（AF488）和驴抗鼠（AF594）孵育。图像由使用×100物镜的共焦显微镜采集。

体外脱衣试验。

这个在体外脱衣试验根据之前描述的WSN方案进行调整(26). 简言之，将30μl在MNT缓冲液中稀释的含有X31（5μg/μl）或纯化的WSN（2μg/μl）的澄清尿囊液加载在由3 ml 15%（vol/vol）甘油和3.4 ml 25%（vol/vol）甘油组成的双层甘油梯度上。底层还含有1%的Nonide P-40（NP-40）、150 mM NaCl和一种通用蛋白酶抑制剂，并通过添加5 mM Tris（pH 7.4和6.4）、5 mM MES（pH 5.8和5.4）或柠檬酸缓冲液（pH 5.0）调节至适当的pH值。当测试不同的盐浓度时，使用相同的梯度设置，但总盐浓度保持在135 mM。所使用的NaCl和KCl浓度的组合在相应的图中显示。梯度在Beckman SW41转子中以21000 rpm和12°C离心150分钟。抽吸甘油层，将颗粒溶解在40μl非还原性样品缓冲液（NuPAGE LDS）中，并在95°C下煮沸5分钟。将20微升溶解的颗粒装入NuPAGE双三倍微凝胶（4-12%）中，并通过SDS-PAGE分离。将凝胶固定在50%甲醇–10%乙酸中，并用胶体考马斯染色。在ddH中退役后₂O、 使用Quantity One软件（Bio-Rad）对凝胶进行扫描并量化条带。在PB2检测的情况下，用SDS-PAGE分离溶解在样品缓冲液中的7μl颗粒，并使用小鼠单克隆抗PB2抗体（1:1000）进行免疫印迹。

蛋白酶K和基于胰蛋白酶的LiP。

纯化的X31在各自的引发缓冲液中预处理，用1M HEPES（pH 9.5）中和，并在RT下用MNT缓冲液中的0.1%NP-40裂解20分钟，用于基于PK的有限蛋白水解（LiP），用MNT缓冲液中的0.1%Triton X-100裂解用于基于胰蛋白酶的LiP。使用双茚二酸（BCA）测定法（BCA蛋白质测定试剂盒；美国伊利诺伊州罗克福德热电科学公司）测量裂解产物的蛋白质浓度。LiP是通过将PK以1:100的酶/底物比添加到蛋白质提取物中并在RT下培养混合物5分钟来进行的。所得肽经过液相色谱（LC）-选择性反应监测（SRM）/质谱（MS）分析，基本上如Feng等人所述(49).

在使用胰蛋白酶的LiP的情况下，以1:4（胰蛋白酶/M1）的比例添加蛋白酶，并在RT下培养混合物，培养时间如下所示。通过添加含有2 mM PMSF的还原SDS样品缓冲液停止反应。样品在95°C下煮沸5分钟，用SDS-PAGE分离，并使用抗M1（HB-64）的单克隆抗体进行免疫印迹。

EGF摄入。

A549细胞生长在8孔Nunc Lab-Tek II室载玻片（Sigma-Aldrich）上，并在添加EGF之前在DMEM中饥饿4小时，无需补充。EGF-AF647（200 ng/ml）在冰上与预冷A549电池结合60分钟。广泛清洗细胞并将其转移至37°C，将培养基改为全培养基（DMEM，10%FCS，1%谷氨酸MAX），以进行内化，然后使用×100物镜通过实时共焦显微镜进行成像。

用APG3装载内体。

A549细胞生长在8孔Nunc Lab-Tek II室载玻片上。对于结合EGF摄取的实验，在EGF结合后清洗细胞，转移至37°C，并加载20μM膜不清洁版本的APG3盐（在ddH中稀释₂O） 用温暖的A549生长培养基冲洗细胞30分钟，并在37°C的温度控制台上使用×100物镜通过实时共焦显微镜成像。为了在内化后随时间观察APG3荧光，在37°C下用APG3负载细胞30分钟。再次用温暖的A549细胞生长培养基清洗细胞，并在指定的时间点立即用活体共焦显微镜在37°C的温度控制台上使用×100物镜成像。为了测试内体成熟抑制的效果，将细胞与诺可唑（DMSO中30μM）在37°C下与APG3共同孵育30分钟。在清洗步骤和图像采集过程中，药物进一步出现。每种条件下>40个细胞的平均荧光强度由ImageJ测定，并归一化为第一次采集时的强度（APG3脉冲后5分钟）。

暴露在pH 6.5至5.4的环境中可提高酸-旁路感染效率。

低酸-旁路感染性的一个可能原因是病毒核心没有暴露在导致启动的温和酸性环境中(6,22). 为了模拟内体贩运过程中的条件，我们将IAV置于在体外启动协议，如图1E将病毒在37°C的DMEM缓冲液中培养1小时，在此缓冲液中pH值调整为7.5至5.0，然后进行酸-旁路感染。

虽然在pH>6.6的预孵育没有影响，但在pH6.6-5.4范围内预孵的IAV的感染性水平等于（甚至超过）正常内吞进入后观察到的水平。在pH 5.4下预处理后，感染性最高可提高30倍(图1E，红线，显示在对数刻度上）。当引物病毒通过正常途径进入细胞时，没有观察到类似的增强(图2B).

预暴露于pH值低于5.4的环境中导致传染性急剧下降(图1E，红线），与HA在没有靶膜的情况下暴露于低于其阈值pH值的pH值时观察到的已知效果一致(58,–61). 使用单克隆抗体（A1）确认HA构象变化，该抗体仅识别HA的酸诱导构象(图1E，蓝线，开放圆圈）(43). 该结果与基于FACS的融合分析的结果密切相关，该融合分析测量R18-DiOC的去猝灭₁₈-酸诱导融合后标记X31(图1E，蓝线，闭合圆）。两次试验中观察到的pH阈值与H3亚型的测定值一致(62).

为了分离启动效应和HA相关效应，我们进一步限制了在体外启动实验，pH值为5.8或更高。当IAV在37°C下暴露于pH 5.8的不同时间段时，30分钟后达到最大传染性(图1F)，半衰期为10分钟。在pH 6.4下，90分钟后达到最大水平。缓慢的转化解释了为什么在酸旁路期间触发熔化所需的不到2分钟的酸化期间没有发生引发。此外，我们发现，当病毒启动时，另一种病毒株（H1N1毒株A/WSN/1933）的酸旁路感染也会增加在体外(图1F). 在该菌株中，HA失活的阈值pH较高（pH 5.6）(58,62). 这将底漆的pH值范围限制在5.8及以上。

为了确定是否通过重新中和来逆转初孵诱导的感染性增强，我们使用pH 7.4、6.4或5.8的缓冲液启动X31 1小时。中和pH 5.8处理的病毒会导致40%的感染性损失，但该病毒的感染性仍然是pH 7.4处理病毒的6倍。这表明转换仅部分反转。pH 6.4预处理后，中和后感染性损失为70%。如预期的那样，在酸旁路或正常感染之前，在pH 5.0下进行预酸化会导致HA不可逆失活，从而丧失传染性(图2A和​和B）B类) (58).

结果表明，病毒颗粒暴露在温和的酸性pH值下在体外酸旁路术后感染性增加。从pH 6.5开始，随着pH值的降低，这种影响变得更加显著，直到达到HA活化的阈值pH值。相关的变化发生缓慢，部分是不可逆的。

注油改善了堆芯拆卸。

定义感染过程中的哪一步通过在体外启动，我们使用定量、基于图像的分析(46). 我们发现启动和未启动的IAV在细胞表面结合方面没有差异(图2C)或旁路熔合动力学和效率(图2D). 然而，当细胞在与引物IAV旁路融合5分钟后固定时，可以在细胞质中检测到强烈的M1染色，表明有效的脱膜(图3A) (20,46). NP在细胞质中呈斑点状存在，主要不含M1(图3B，底部，白色箭头）。30分钟后，在细胞核中已经检测到启动病毒的NP(图3A). 对于未感染病毒，M1和NP抗原的整体染色较弱（M1为～8到10倍，NP为2.5倍），大多数M1和NP仍停留在PM处或附近的斑点中(图3B). 我们的结论是，引物和未引物病毒与PM有效融合，但只有引物病毒的核心经历了脱膜，而未引物的病毒核心保持完整并与PM保持关联。

在单独的窗口中打开

图3

在pH5.0介导的融合之前，病毒核心蛋白的轻度酸化会导致更有效的脱膜。（A） IAV在预酸化和酸诱导的PM融合后脱膜。病毒在37°C的DMEM缓冲液中预处理1小时，缓冲液pH调节为7.4和5.8。中和的病毒在冰上与A549细胞结合，并如酸旁路感染测定所述诱导融合。融合后，在含有CHX的终止培养基中培养细胞5分钟（M1）和30分钟（NP），固定细胞，并通过间接免疫荧光分别对M1和NP进行染色。（右）代表性图像。细胞核通过DRAQ5染色进行可视化。（左）M1和NP暴露，作为病毒脱膜的测量，通过测量每个细胞的总荧光来确定，并用ImageJ进行量化。棒材，20μm。（B） 预酸化病毒酸旁路后检测M1和NP。如面板A图例所述，病毒在A549细胞的PM处进行预处理和融合。在含有CHX的终止培养基中培养5分钟后，固定细胞并对其进行M1和NP染色。白色箭头，无M1 NP-染色。棒材，10μm。（C） 在100μM M2抑制剂金刚烷胺存在下，WSN（wt）和金刚烷烷胺敏感WSN（AS）的酸旁路感染。有关构建重组WSN（AS）的详细信息，请参见材料和方法。（D） 金刚烷胺存在下WSN（wt）和WSN（AS）的预酸化。病毒在RT下用金刚烷胺预处理5分钟，然后在37°C下在pH 6.2下预酸化10分钟。在与X31相同的条件下进行酸旁路感染。（E） 存在CCCP时X31的酸旁路。如右图所示，IAV要么未经处理（条件1），要么在37°C（条件2）下在pH 5.8下预酸化1小时，要么在RT（条件3）下用CCCP处理5分钟，或者预酸化与CCCP处理相结合（条件4）。样本接受了A549细胞的酸-旁路感染试验或正常感染，如面板A的图例所述。CCCP在2分钟融合步骤中进一步出现，但不包括在随后的停止和感染培养基中培养。（F） 在存在CCCP的情况下，在PM处酸诱导熔融后，IAV脱涂层。按照图例所述，使用CCCP和酸旁路进行预培养图1D酸旁路后固定细胞5分钟（M1）和30分钟（NP），并进行间接免疫荧光。图中显示了具有代表性的DRAQ5核染色图像（左）和量化图像（右）。按照面板A的图例中所述对样品进行分析。棒材，20μm。（G） 在存在CCCP和金刚烷胺的情况下对WSN（AS）进行酸旁路。如左图所示，IAV要么未经治疗（条件1），要么在RT时用金刚烷胺（条件2）或CCCP（条件3）预处理5分钟。当两种药物联合使用时（条件4），首先用金刚烷胺处理病毒5分钟以阻断M2通道，然后将CCCP添加到溶液中，并将混合物进一步孵育5分钟。融合步骤中存在药物，但随后将其排除在停止培养基中。在与X31相同的条件下进行酸-旁路感染试验。

岩芯酸化和M2的作用。

测试感染性是否在在体外启动依赖于M2，我们使用金刚烷衍生物金刚烷胺，一种特殊的M2通道阻滞剂(7,63,64). 由于IAV菌株X31和WSN对金刚烷胺具有耐药性，我们使用了一种称为WSN（AS）的重组金刚烷碱敏感性H1N1菌株（先前在参考文献中描述7). 我们证实，金刚烷胺抑制了未感染WSN（as）的正常感染和酸-旁路感染，而WSN（wt）未受影响(图3C).

什么时候？在体外在金刚烷胺存在的情况下启动WSN（AS），旁路术后感染被完全阻断，而启动的WSN（wt）没有受到影响(图3D). 这表明在体外实际上，启动依赖于M2及其通道活性。

为了加速质子通过病毒膜的转移并规避M2的需求，我们测试了质子载体CCCP的作用。这种质子转运体使H⁺沿着电化学梯度穿过脂质双层。我们发现，未启动的携带CCCP的病毒不会通过正常的内吞途径更有效地感染细胞（数据未显示）。然而，原核细胞的加入导致酸旁路后未感染X31的感染性急剧增加（20倍）(图3E; 比较条件1和3）。传染性是未经处理的IAV正常进入时获得的水平的两倍，比经预处理的IAV旁路后获得的传染性高出约60%(图3E，条件2）。这反映在脱衣能力的提高，如细胞中M1和NP对抗体染色的更易接近性所观察到的(图3F). 当CCCP与预酸化联合使用时，未观察到酸-旁路感染性进一步增加(图3E，条件4）。

在未注射WSN（AS）的情况下，当在没有金刚烷胺的情况下使用CCCP时，旁路术后感染性达到最高水平（17倍）（比较条件1和条件3图3G). 如果M2被阻断，感染性增加将下降到10倍。这表明M2在这一过程中的作用超出了质子运输。

综合来看，结果表明在体外启动增加IAV感染，因为它激活M2，从而允许质子通过病毒膜传导。如果存在CCCP，则岩芯酸化速度非常快，以至于在酸旁路期间的短pH下降期间，岩芯已经能够脱涂层。

K⁺改善启动。

至此，在缓冲细胞培养基（DMEM）中进行了预酸化实验，其中单价阳离子成分与细胞外液（120 mM NaCl，5 mM KCl）中的阳离子成分相对应。由于该缓冲液不太可能代表LEs内的离子状态(65)，我们测试了不同单价阳离子预培养的效果(图4A).

在pH 5.8的高浓度K缓冲液中预培养⁺（120毫米K⁺，10 mM钠⁺)IAV感染增加到基于DMEM缓冲液的2.5倍(图4A). 感染率的增加与K的增加呈线性关系⁺浓度高达120 mM(图4B). 这很有趣，因为K的管腔浓度⁺在内体成熟过程中增加，LEs和溶酶体中的值远远超过50 mM(66). K引起的升压⁺不是因为钠的浓度降低⁺，作为Cs⁺和李⁺与K的效果不同⁺(图4A).

免疫荧光分析表明，感染性增加的原因再次是IAV核心脱膜效率的提高，导致vRNP的核导入效率更高(图4F). 病毒粒子与细胞的结合(图4C)，HA转化为酸性构象(图4D)以及PM处的酸诱导聚变效率(图4E)通过用高K预处理没有改变⁺浓度。

缬氨霉素增加酸-旁路感染。

为了避开M2，我们利用了缬氨霉素，一种穿梭于K细胞的离子载体⁺沿着其电化学梯度穿过膜(67,68). IAV在含有低（5 mM）或高（120 mM）K的缓冲液中加入或不加入安定霉素的情况下进行pH 5.8启动⁺然后是酸-旁路感染。

我们发现缬氨霉素处理的病毒暴露于高K⁺启动期间的浓度是在没有离子载体的情况下启动的对照病毒的两倍(图4G). 这表明K的流量⁺通过病毒膜改善了M2作为阳离子载体的功能以外的启动。为了使其最佳工作⁺浓度必须很高。在低K下⁺浓度，感染的增加可以忽略不计。

暴露于安定霉素和高钾⁺在启动期间，pH值没有下降的浓度也会导致高的酸-旁路感染性。显然，在这种情况下，K的渗透率增加⁺在触发融合过程中，离子和短时间酸化足以诱导病毒处于启动状态。

使用WSN（AS）病毒，我们测试了金刚烷胺、CCCP和缬氨霉素在不同组合中的作用(图4H). 当M2被金刚烷胺单独灭活时，启动后没有传染性(图4H，条件1）。在金刚烷胺抑制病毒中添加缬霉素不会增加感染性(图4H，条件3）。这表明K的通量⁺如果没有质子流入，就不会引发引发。当在金刚烷胺存在下添加CCCP以允许质子传导时，只检测到低感染性(图4H，条件2）。因此，只有质子没有K⁺可以引发一些启动。然而，在含有CCCP的病毒中添加缬霉素使其感染性增加了一倍(图4H，条件4）。这证实了H⁺和K⁺需要有效启动。结果还表明，只要这两种阳离子的电导由离子载体人工支撑，M2通道本身就不需要引发。

在没有金刚烷胺的情况下，当病毒在未添加离子载体的情况下在PM处酸融合时，没有发现感染性(图4H，条件5）。然而，当CCCP或安定霉素单独存在时，可观察到有效的酸-旁路感染(图4H条件6和7）。这表明，在每种情况下，M2通道都可以为第二个阳离子提供必要的导电性。当CCCP和安定霉素同时存在时，感染率进一步增加至30%(图4H，条件8）。事实上，它高于CCCP和缬氨霉素与金刚烷胺共存时的水平。这意味着M2通道对启动有一定影响，即使K的通量⁺和H⁺由电离层介导。金刚烷胺对IAV融合动力学的轻度抑制作用(69,–71)可以解释这种效果(图4H，条件4）。CCCP、缬氨霉素或两者的组合并没有增加IAV感染的正常水平（数据未显示）。

我们的数据表明，不仅pH值，K⁺浓度影响IAV的启动。K⁺它本身没有影响，但当它与低pH值结合时，它将核心脱膜的效率提高了一倍。两个H的电导⁺和K⁺由M2通道介导，除非存在离子载体。

堆芯稳定性的变化。

此前曾使用甘油梯度离心法提供有关IAV核心及其稳定性的信息(26). 梯度含有一种非离子洗涤剂（NP-40），当病毒向底部沉积时，通过溶解去除病毒膜。通过对这种梯度的颗粒进行分析，Zhirnov得出结论，WSN的核心是一个稳定的结构，暴露在pH值低于6.0的环境中会导致M1的离解(26).

我们将此方法用于X31和WSN病毒(图5)并研究了KCl和NaCl存在和不存在时的酸化效果。首先，我们在135 mM NaCl存在下测试了7.4到5.0之间的pH值(图5A). 粒剂的SDS-PAGE证实，只要pH值保持在6.4以上，M1和vRNP就会结合在一起，即使病毒的膜已经被去除(图5A和​和B）。B类). 随着pH值达到5.8或更低，M1逐渐从沉积岩芯中消失。pH值低于5.6时，vRNP（NP和病毒聚合酶亚单位PB2被分析）从颗粒中丢失，表明病毒核衣壳发生了第二步分离。将此程序应用于纯化的WSN显示出类似的结果(图5C). 在pH 5.5时，大多数M1和NP从沉积岩芯中分离出来。

当NaCl在梯度溶液中被交换为KCl时，小球表明，只要pH值为中性，大多数核心都保持完好(图5D和​和E）。电子). 然而，当梯度pH值降至5.8时，与NaCl相比出现了明显差异。在含有KCl的梯度中，颗粒中只有15%的M1和20%的NP。在NaCl含量梯度中，相应值分别为40%和75%。因此，在弱酸性pH值下，KCl比NaCl更有效地分解核心。我们的结果表明，KCl的存在不仅增加了核心拆卸的效力，而且对第二拆卸步骤（涉及vRNP相互作用的步骤）也有其主要影响。

K的浓度依赖性⁺-使用氯化钠和氯化钾的混合物在pH 5.8条件下测试诱导的堆芯拆卸(图5F和​和G）。克). 研究发现，50 mM KCl足以使M1从病毒核心分离80%，而要实现相同程度的vRNP分解，则需要100至135 mM KCl。

综上所述，梯度分析证实IAV核心（X31和WSN）可以在没有病毒包膜的情况下以完整结构存在。弱酸性pH和低K⁺与启动时使用的浓度一样，M1-vRNP相互作用减弱。在较低的pH值下，vRNP沉淀的变化为可能涉及vRNP之间相互作用丧失的进一步变化提供了证据。高钾的存在增强了第二个离解步骤⁺浓度。

启动后M1和NP更容易发生蛋白水解断裂。

为了更深入地了解M1和NP中可能的构象变化，我们应用了有限蛋白水解（LiP）。溶解后，在体外在中性pH和RT条件下，用胰蛋白酶消化酸化和未酸化的X31病毒。Western blot分析检测到，病毒预酸化后M1的完全降解速度更快(图6A). LiP与靶向MS（LC-SRM/MS）分析的组合(图6B)，最近用于整个酵母（即。，酿酒酵母)蛋白质组(49)，使我们能够对启动效应进行更详细和定量的分析。这里，溶解在体外-在中性pH和RT条件下，用PK短暂消化引物和未引物的X31病毒，然后用MS定量来自三种病毒蛋白（M1、NP和HA）的胰蛋白酶肽。定量肽的丰度比是通过比较酸反应病毒和未反应病毒获得的(图6C; 另见补充材料中的表S1）。

在单独的窗口中打开

图6

LiP探测启动后病毒衍生IAV核心蛋白的结构转变。（A） 基于胰蛋白酶（Tryp.）的轻度酸化X31病毒的LiP。将X31在pH 7.4和5.8下于37°C下预处理1 h，中和，并用0.1%Triton X-100（Tx-100；RT下20 min）进行裂解。对照样品未经分析。以1:4（胰蛋白酶/M1）的比例添加胰蛋白酶，并在RT下培养混合物指定的时间。通过添加含有2 mM PMSF的还原SDS样品缓冲液停止反应。样品通过SDS-PAGE进行解析，并使用针对M1（HB-64）的单克隆抗体通过Western blot分析进行M1胰蛋白酶裂解。（B） 适用于X31的LiP-SRM工作流程示意图。用0.1%NP-40中和和溶解引物和未引物病毒样品（RT下20分钟）。在酶/底物比为1:100的情况下，用PK进行5分钟的LiP。随后对样品进行变性和胰蛋白酶化，以进行LC-SRM/MS分析。比较了预处理和未预处理样品的胰蛋白酶肽强度。（C） 预酸化病毒（pH 5.8，60 min，37°C）和对照病毒（pH 7.4）之间M1、NP和HA的定量LiP肽的倍数变化反映了PK裂解敏感性的差异。x轴，原木₂（褶皱变化）；年轴，−log₁₀(对值）。对每个条件下通过三次技术复制获得数值。使用对<0.01的值被认为是显著的。（D，E）将LiP肽映射到M1序列（D，底部），并对M1（D，顶部）和NP（E）中的PK裂解位点进行图解可视化。三角形表示观察到预酸化病毒PK裂解显著增加的位置（基于LiP分析）。（F） 在5mM K中预酸化的病毒之间，从M1、NP和HA定量的肽的倍数变化反映了PK切割易感性的差异⁺（低K⁺浓度）和病毒在120 mM K中预酸化⁺（高K⁺浓度）。调整了面板A的相同设置。（G） （底部）肽到M1序列的映射。（顶部）三角形表示在用120 mM K处理的病毒中观察到PK裂解增加的位置（基于LiP分析）⁺在pH 5.8下。（D、E和G）显示了病毒蛋白M1和NP的结构域组织示意图。指出了其他病毒成分的结合位点。NLS，核定位信号。

对于M1，通过对12个LiP肽进行量化，获得了大约70%的序列覆盖率，其中3个在酸引发后强度显著降低(图6C和​和D）。D类). 所有三个肽都被映射到N端和C端结构域之间连接区内部或侧面的区域(图6D). 当病毒粒子被引物时，鉴定出四种强度较低的NP衍生肽(图6E)而HA在pH 5.8时未发生重大变化。启动后M1和NP的PK敏感性增加很可能是由于低pH暴露后构象或蛋白质-蛋白质/蛋白质-RNA相互作用发生不可逆变化所致。

接下来，我们评估了K的影响⁺(图6F和​和G）。克). 病毒在低（5 mM）和高（120 mM）K存在下预酸化⁺浓度。发现M1中的另外两个区域被PK切割得更有效。与低K启动的结果相比⁺浓度，连接区更容易发生蛋白水解(图6G，紫色箭头）。此外，在M1的C末端检测到一个新的裂解位点，该区域被建议与vRNP结合(29,72) (图6G，黄色箭头）。未检测到NP和HA的其他变化（见补充材料中的表S1）。

我们感谢山内洋平和霍塔里对手稿的批判性阅读。我们感谢Roberta Mancini在电子显微镜方面的帮助和Florian Schmidt在IAV融合动力学分析方面的帮助。我们还感谢Giuseppe Balistreri为我们提供了SFV-ZsGreen和Roger Meier的库存，用于UUKV库存和抗体。我们感谢托马斯·海格（Thomas Heger）为我们提供了感染计数器算法，感谢彼得·霍瓦思（Peter Horvath）帮助我们进行了协同定位分析，感谢A.Helenius小组成员进行了有益的讨论。我们感谢苏黎世理工大学光学和电子显微镜科学中心的支持。

A.H.实验室得到了玛丽·居里初始培训网络（ITN）和瑞士国家科学基金会（Sinergia）的支持。P.P.由瑞士国家科学基金会的Foerderungsprofessur拨款支持（拨款PP00P3_133670;), 通过欧盟第七框架计划重返社会补助金(FP7-人员-2010-RG-277147;), 通过FP7-ERC启动拨款(337965-保护ToxNet;), 由Promedia Stiftung（拨款2-70669-11;). Y.F.由ETH研究拨款（拨款4412-1).